反相高效液相色譜法測定昆侖雪菊中木犀草素的含量

趙文惠，朱雅琪，李新霞

（新疆醫(yī)科大學藥學院，烏魯木齊 830011）

昆侖雪菊又名“血菊”，維吾爾語“古麗恰爾”，系菊科金雞菊屬兩色金雞菊 （Coreopsis tinctoria Nutt）一年生草本植物，分布于新疆和田地區(qū)海拔3000m左右的昆侖山系［1］。昆侖雪菊具有清熱解毒、活血化瘀、健脾胃等功效，維吾爾族人民用花泡茶飲，用于治療燥熱煩渴、高血壓、心慌、胃腸不適、食欲不振、痢疾及瘡癤腫毒［2］。昆侖雪菊中含有黃酮、多糖、皂苷、氨基酸、揮發(fā)油等活性成分［3］?，F(xiàn)代藥理學研究表明該藥材具有明顯的抗氧化、降血壓和降血脂等多種生物活性［4－5］。其中木犀草素是重要的黃酮類成分，最新文獻報道木犀草素對全身惡性腫瘤的生長有抑制效應［6］；木犀草素能抑制炎癥反應，并改善胰島素在血管內皮細胞的敏感性［7］；木犀草素具有多靶點抗腫瘤作用，是一種非常有前途的潛在抗腫瘤藥物［8］。

已有研究表明昆侖雪菊含有木犀草素［9］。但昆侖雪菊中木犀草素含量測定未見報道，本研究建立反相高效液相色譜法測定昆侖雪菊花中木犀草素含量的方法，為今后昆侖雪菊化學成分的研究、藥材質量標準研究等提供實驗方案，同時為合理開發(fā)利用昆侖雪菊提供一定的依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀，Waters 2489紫外檢測器，自動進樣器、在線脫氣裝置，Empower 2色譜工作站。

1.2 試藥 昆侖雪菊產自和田地區(qū)昆侖山區(qū)，由新疆醫(yī)科大學藥學院胡君萍博士鑒定為菊科金雞菊屬一年生草本植物兩色金雞菊 （Coreopsis tinctoria Nutt）的干燥花蕾，木犀草素對照品（批號12113041）購于上海同田生物技術股份有限公司，甲醇為色譜純，實驗用水均為 Milli－Q純水儀制超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters XBridge C18（250mm×4.6mm，5μm），流動相：乙腈－2%冰醋酸，梯度洗脫（表1），pH＝3.0，測定波長350nm，柱溫35℃，流速1.0mL／min。

2.2 標準溶液的制備 精密稱取木犀草素5mg于5mL容量瓶中，配置為1mg／mL的儲備液。精密量取儲備液100μL于10mL容量瓶稀釋至刻度，得到10μg／mL的木犀草素標準溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取雪菊藥材0.5g，加入70%（V／V）甲醇10mL，40℃下超聲提取30min，提取液15000r／min離心10min，取上清液1mL于10mL容量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，0.22μm濾膜過濾，進樣分析。

2.4 系統(tǒng)適用性實驗 取供試品溶液10μL進樣，記錄色譜圖，木犀草素峰的保留時間為18.336min，各峰與相鄰峰的分離度均＞1.5，拖尾因子T＝1.04，理論板數(shù)按木犀草素峰計算大于2000。重復性試驗RSD＜2%（圖1）。

表1 梯度洗脫

圖1 HPLC圖譜

2.5 標準曲線 分別精密量取木犀草素標準溶液（10μg／mL）100、200、400、600、800μL及1mL于10 mL容量瓶中，稀釋至刻度。得到濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μg／mL的標準系列。取上述系列質量濃度溶液經0.22μm的微孔濾膜過濾，進樣，得系列濃度對應峰面積和保留時間。以對照品溶液的質量濃度（X）為橫坐標，色譜峰面積 （Y）為縱坐標，繪制標準曲線，其線性方程：Y＝－36.71＋37440.4 X，相關系數(shù)：r＝0.9999，表明木犀草素在0.1～1.0μg／mL濃度范圍內線性關系良好。

2.6 精密度試驗 分別吸取對照品溶液0.4、0.6、1.0μg／mL，分別取10μL進樣測定，低、中、高各濃度重復測定5次，峰面積RSD均＜2%，表明儀器精密度良好。

2.7 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的樣品溶液（2.871μg／mL）共9份，每份1mL于10mL容量瓶中，分別加入木犀草素對照品（木犀草素濃度為2μg／mL）溶液0.1、1.0、2.0mL各3份，稀釋至刻度，HPLC法測定，記錄峰面積，計算回收率，結果平均回收率為94.90% ，RSD為0.69%，見表2。

2.8 重復性試驗 以供試品溶液制備方法平行制備5份樣品，進樣測定，測得昆侖雪菊中木犀草素的含量為0.16mg／g，RSD為1.2%。

2.9 穩(wěn)定性試驗 吸取同一供試品溶液10μL，分別于0、2、4、6、8、12h進樣，測定峰面積 RSD＝0.8%，表明12h內供試品溶液仍保持穩(wěn)定。

表2 回收率實驗結果

3 結論

3.1 提取條件的確定 對比回流提取與超聲提取方法，木犀草素含量相似。但超聲提取法更加方便快捷，故選用超聲提取法對樣品進行處理。分別對30%、50%、70%、100%甲醇和30%、50%、70%、100%乙醇、水等溶劑對樣品進行超聲提取，最后70%的甲醇提取液中木犀草素的含量最高，故選擇用70%甲醇進行提取。

3.2 提取溫度的確定 采用70%甲醇分別于30℃、40℃、50℃下超聲提取30min。最終測定結果，40℃下提取木犀草素含量較高，故選擇在40℃下提取。

3.3 提取時間的確定 分別將樣品用70%甲醇在40℃下超聲提取10、20、25、30、40min。測定后為提取30min木犀草素的含量最高，故雪菊樣品提取時間確定為30min。

3.4 色譜條件的確定 分別采用了乙腈－0.1%磷酸、甲醇－0.1%磷酸、乙腈－2%冰醋酸、甲醇－2%冰醋酸等色譜系統(tǒng)，最終乙腈－2%冰醋酸色譜系統(tǒng)分離度高，保留時間較短，峰形較好，滿足分析要求，故選用乙腈－2%冰醋酸對樣品進行測定。采用梯度洗脫分離了近8個色譜峰，其中在10min處木犀草苷和馬里苷對照品峰保留時間相同，通過峰純度檢測，在峰尾處同時含有馬里苷和木犀草苷的光譜圖，說明峰不純，有待進一步分離；槲皮素在20min左右有個色譜峰，但含量較少，無法達到定量限。

［1］ 新疆植物志編輯委員會.新疆植物志：5［M］.烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1999：93.

［2］ 劉偉新，鄧繼華，徐鴻.一種金雞菊花的生藥學研究［J］.中國民族醫(yī)藥雜志，2009，23（1）：24－25.

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