高效液相色譜法測定維藥蜀葵花中蘆丁和紫云英苷含量

勉強輝， 鄭大成， 孫 蓮

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011； 2湖北鐘祥市中醫(yī)醫(yī)院， 湖北 鐘祥 431900)

蜀葵花為錦葵科蜀葵屬植物蜀葵[Althaearosea(Linn.)Gavan]的干燥花朵，全草入藥，味甘甜，性涼，有和血止血、解毒散結(jié)的功能,主治吐血、衄血、月經(jīng)過多、赤白帶下、二便不通、小兒風(fēng)疹等[1]。蜀葵花收載于1993年版《維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)》(上冊)[2]和1999年版《維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)》(下冊)[3]，其具鎮(zhèn)靜安神、止咳平喘、發(fā)汗透疹之功效。國內(nèi)外學(xué)者對其同屬植物報道較多，其化學(xué)成分主要含黃酮類化合物[4-8]。馮育林等[9]和Gudej等[10]從蜀葵屬中得到蘆丁等7種黃酮化合物，并從蜀葵中獲得紫云英苷。目前為止，有關(guān)蜀葵花中蘆丁和紫云英苷含量測定的研究尚未見報道。本研究建立了高效液相色譜法測定維吾爾藥材蜀葵子中蘆丁和紫云英苷含量的方法，為維藥材蜀葵花及其制劑的質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)，為進一步開發(fā)和利用維吾爾藥材資源提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(日本島津，LC-20AT)，檢測器(日本島津，SPD-M20A)，電子分析天平(德國賽多利斯，BP-211D)，超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，KQ3200DB)。

1.2 試藥

乙腈(Chromadex，色譜純)，甲醇(天津科密歐公司，色譜純)，磷酸(北京紅星化工廠，優(yōu)級純)。蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號100080-201009，純度≥98.0%)，紫云英苷對照品(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號110328，純度≥98.0%)。蜀葵花藥材購自烏魯木齊當(dāng)?shù)鼐S藥藥店(批號：20110815、20120116、20120328)，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院帕麗達(dá)教授鑒定為錦葵科蜀葵屬植物蜀葵[Althaearosea(Linn.)Gavan]的干燥花朵。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱： YMC-Pack ODS-A C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測波長360 nm，以流動相A (0.2%磷酸水溶液)和流動相B (0.2%磷酸乙腈溶液)進行梯度洗脫，梯度洗脫程序：洗脫時間分別為0～9、9～20、20～30、30～40、40～50、50～60 min；流動相A分別為85～80、80～75、75～65、65～60、60～85、85%。流速0.6 mL/min，進樣量10 μL。理論塔板數(shù)按蘆丁和紫云英苷色譜峰計算均不低于 3 000，對照品及樣品色譜圖見圖1、2。

2.2 對照品儲備液的制備

分別精密稱取蘆丁對照品和紫云英苷對照品10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取蜀葵花粉末(過四號篩)約0.2 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇約15 mL，超聲處理(功率250 W，頻率30 KHz)30 min，放冷，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

根據(jù)蜀葵花中蘆丁和紫云英苷的含量差異，分別精密吸取上述對照品儲備液適量，加甲醇制備系列混合對照品溶液(蘆丁和紫云英苷一一對應(yīng)的濃度分別為：0.5、1.0 μg/mL；1.5、2.0 μg/mL；3.0、4.0 μg/mL；4.5、8.0 μg/mL；6.0、12.0 μg/mL)，注入液相色譜儀中，按上述色譜條件測定色譜峰面積。以峰面積A為縱坐標(biāo)，待測成分濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果，蘆丁和紫云英苷的回歸方程分別為：A=583.5C-0.623，r=0.999 5,A=628.3C-0.270，r=0.999 1。蘆丁和紫云英苷進樣濃度分別在0.5～6.0 μg/mL和1.0～12.0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

取同一份蘆丁(濃度3.0 μg/mL)和紫云英苷(濃度4.0 μg/mL)的混合對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次。結(jié)果，蘆丁和紫云英苷色譜峰峰面積的RSD(n=6)分別為1.8%和0.90%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一批蜀葵花樣品(批號：20120116)粉末約0.2 g，精密稱定，按“2.3”項下制備供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進樣測定。結(jié)果，蘆丁和紫云英苷色譜峰峰面積的RSD(n=6)分別為1.79%和1.81%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一批蜀葵花樣品(批號：20120116)粉末約0.2 g，共6份，精密稱定，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果，蘆丁和紫云英苷含量的RSD(n=6)分別為1.0%和2.0%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取同一批蜀葵花樣品(批號：20120116)粉末6份，每份取約0.1 g，精密稱定，準(zhǔn)確加入蘆丁和紫云英苷對照品適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按““2.1”項下色譜條件進樣測定，計算回收率。結(jié)果，蘆丁和紫云英苷的平均加樣回收率(n=6)分別為102.3%和100.8%，RSD分別為0.89%和0.60%。

2.9 樣品含量測定

取蜀葵花藥材粉末約0.2 g，各3份，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液。分別精密吸取各供試品溶液20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定蘆丁和紫云英苷色譜峰面積，計算。結(jié)果，蜀葵花中蘆丁和紫云英苷的含量分別為0.30～0.32 mg/g和0.43～0.46 mg/g，結(jié)果見表1。

表1 蜀葵花中蘆丁和紫云英苷的含量/(mg/g)

3 討論

依據(jù)《中國藥典》(2010版)[11]中黃蜀葵花藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測定項下供試品溶液制備方法，以甲醇為提取溶劑，對提取時間進行了考察，分別超聲10、20、30 min，最終以超聲提取時間20 min為佳。

本研究參照文獻(xiàn)[12]的方法，先采用0.2%磷酸水溶液-乙腈為流動相，后來發(fā)現(xiàn)在乙腈中加入適量的磷酸可以改善分離效果，最終確定0.2%磷酸水溶液-0.2%磷酸乙腈溶液為流動相進行梯度洗脫。

蜀葵花收載于1993年版《維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)》(上冊)和1999年版《維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)》(下冊)，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中缺乏含量測定項。本研究利用高效液相色譜建立了維藥蜀葵花中蘆丁和紫云英苷的含量測定方法。結(jié)果顯示，此方法操作穩(wěn)定，重復(fù)性良好，為維藥蜀葵花藥材的質(zhì)量控制和評價提供一種快速、簡便的分析方法，為進一步完善維吾爾藥材蜀葵花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國家中藥管理局《中華本草》編委會.中華本草[M]. 上海:上?？萍汲霭嫔? 1999:1251-1255.

[2] 劉勇民. 維吾爾藥志:上冊[M]. 烏魯木齊:新疆科技衛(wèi)生出版社, 1993:372-373.

[3] 劉勇民. 維吾爾藥志:下冊[M]. 烏魯木齊:新疆科技衛(wèi)生出版社, 1999:883-884.

[4] 陳秋, 吳春華, 葛丹丹, 等. 蜀葵花總黃酮正交提取工藝研究[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2012, 14(8):35-37.

[5] 張祎, 陳秋, 劉麗麗, 等. 維藥蜀葵花化學(xué)成分的分離與結(jié)構(gòu)鑒定(Ⅰ) [J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報, 2013, 30(5):335-341.

[6] 李春梅, 王濤, 張祎, 等. 中藥黃蜀葵花化學(xué)成分的分離與鑒定(Ⅱ) [J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報, 2010, 27(10):803-807.

[7] 李春花, 劉雪麗, 鄭文麗, 等. 正交試驗優(yōu)選黃蜀葵花中總黃酮的提取工藝[J].中國藥房, 2013, 24(27):2535-2537.

[8] 周雷. 黃蜀葵花總黃酮研究進展[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2012, 14(6):42-44.

[9] 馮育林, 徐麗珍, 楊世林, 等. 蜀葵花的化學(xué)成分研究(Ⅱ)-黃酮類成分研究[J]. 中草藥, 2005, 36(11):1610-1612.

[10] Gudej J, Bieganowsk ML. Chromatographic investigations of flavonoids in the leaves and flowers of some species of the genus Althaea[J]. Chromatogra, 1990, 30(5-6):333-336.

[11] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典:一部[S]. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社, 2010:287.

[12] 劉龍,孫蓮,楊文菊,等.桑葉藥材高效液相色譜指紋圖譜分析[J]. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2008, 31(5):585-587.