新疆傳統(tǒng)發(fā)酵駝乳中分離出的一株乳酸菌的分子生物學鑒定

拉提帕·艾爾肯, 唐 雪, 新華·那比

(1新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室, 烏魯木齊 830011; 2中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心， 北京 100081)

駝乳作為營養(yǎng)性食品，在世界上許多國家被推崇,它富含大量的諸如溶菌酶、乳鐵蛋白和免疫球蛋白等抗微生物因子，可強化人體的免疫系統(tǒng)。發(fā)酵駝乳中含有較高含量的蛋白質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸和微量元素，而且蘊涵著大量的微生物，其中最主要的是益生菌為乳酸菌[1]。駝乳和發(fā)酵駝乳都具有較高的營養(yǎng)和食用價值。新疆傳統(tǒng)發(fā)酵駝乳的原料是新鮮駝乳，是具有濃厚民族特色的、利用新疆傳統(tǒng)發(fā)酵技術制成的一種營養(yǎng)價值較高的保健飲料。民間用于輔助治療胃腸道潰瘍、結核、糖尿病患者[2]。本實驗采用分子生物學鑒定方法，利用乳酸菌的遺傳物質(zhì)采用DNA 提取、PCR 擴增、產(chǎn)物測序和數(shù)據(jù)分析對分離出的一株乳酸菌進行系統(tǒng)發(fā)育分析并對其進行分類和鑒定。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

發(fā)酵駝乳10號乳酸菌菌株從新疆阿勒泰哈薩克族牧民發(fā)酵駝乳中分離篩選得到。 細菌DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，PCR 反應體系(Fermentas 公司)，引物[英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司]合成。16S rDNA 測序選用通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，rpoA引物選擇rpoA-21F(5′-ATGATYGARTTTGAAAAAACC-3′)和rpoA-22R(5′-ACYTTVATCATNTCWGVYTC-3′)，pheS引物選擇pheS-21F(5′-CAYCCNGCHCGYGAYATGC-3′)和pheS-23R(5′-GGRTGTACCATVCCNGCHCC-3′)。革蘭氏染色液(上?？婆d生物科技有限公司),TPY液體培養(yǎng)基，MRS 液體培養(yǎng)基(杭州百思生物科技有限公司),S021乳酸菌生化鑒定套裝(北京路橋技術有限責任公司) 。 Sigma1-14K離心機(德國 Eppendorf公司)，A2型二級生物安全柜(北京佰億新創(chuàng)科技有限公司)， DHP-9272 上海精密型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海合恒儀器設備有限公司)，Nano Drop 2000 DNA濃度測定儀[美林恒通(北京)儀器有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵駝乳中待測乳酸菌的活化與鏡檢 將需要活化的10號菌株接種到10 mL含有5 mLTPY液體培養(yǎng)基的試管中，37℃培養(yǎng)24 h，后將培養(yǎng)好的菌液用移液管吸取1 mL再次接種到10 mL含有5 mL MRS液體培養(yǎng)基的試管中，37℃培養(yǎng)36 h[3]。將活化的菌液1 mL，10 000 r/min離心45 s，去除上清液。沉淀物進行革蘭氏染色以及鏡檢[4]，對鏡檢純度高和形態(tài)結構穩(wěn)定的乳酸菌菌株進行分子生物學鑒定。

1.2.2 乳酸菌活化菌株生化鑒定 (1)糖發(fā)酵試驗[5]：取2 mL無菌水試管，挑單菌落至水中，震蕩至無明顯菌體，與標準濁度管作對比，制成0.5麥氏濁度的均勻菌液，接種、培養(yǎng)，用滴管吸取懸濁液，依次滴入安培管中，每管3滴，用乳酸菌生化鑒定套裝鑒定，如無特殊說明，培養(yǎng)時間為24 h，溫度為(36±1)℃，后觀察，記錄。(2)溫度實驗[6]：準備MRS液體培養(yǎng)基，分裝于試管中，每支試管4～5 mL，滅菌，厭氧菌用厭氧管培養(yǎng)，分裝滅菌準備接種，培養(yǎng)溫度分別為4、10、15、26、30、37、45、50、60℃，主要是找到最適溫度和可生長的溫度范圍。(3)鹽度實驗[7]：培養(yǎng)基為常規(guī)用的MRS，以常規(guī)培養(yǎng)基為0.1%NaCl的濃度，依次加入適量鹽分制成1%～10%，每只試管接種100 μL菌液即可，37℃培養(yǎng)24 h，以不接種的空白對照為陰性對照，記錄。

1.2.3 乳酸菌的DNA提取 用無菌牙簽挑取少量已純化的菌體重懸于30～100 μL無菌ddH2O中，然后在沸水浴中煮沸10 min，立即置于冰上(一般為-20℃)20 min，使用時常溫融化，10 000 r/min離心1 min，置于冰上，使用時取上清液做DNA模板，用Nano Drop 2000檢測DNA濃度及純度，其余-20℃保存[8]。對于少量不能用此方法獲得PCR模板的細菌，可采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA作為PCR反應的模板。

1.2.4 DNA的PCR體系擴增及測序 PCR 反應體系(50 μL):10×PCR buffer 5 μL，dNTP(2.5 mM) 4 μL,引物1 (10 nmol/μL) 0.2 μL，引物2(10 nmol/μL) 0.2 μL，Taq聚合酶(5 U/μL)0.25 μL，Templet 5 μL，ddH2O補足到50 μL。擴增條件分別為：(1)16S rDNA 的PCR 擴增條件[9]： 94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸7 min；4℃保存。(2)rpoA的PCR 擴增條件[10]： 95℃預變性5 min；94℃變性20 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.25 min，35個循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。(3)pheS的PCR 擴增條件[10]：95℃預變性2 min；94℃變性20 s，46℃退火30 s，72℃延伸1.25 min，30個循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。同種菌株收集的擴增產(chǎn)物(>30 μL)和引物(上游引物21 F 和下游引物1492 R，>10 μL)。封口，16S rDNA、rpoA、pheS均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序。

2 結果

2.1 活化的菌株形態(tài)

10號乳酸菌菌株經(jīng)培養(yǎng)后，可在培養(yǎng)皿上看到表面光滑、邊緣整齊，活性強的乳白色圓形菌落。油鏡下觀察活化的菌株，結果如圖1所示：細胞為長桿形，以單個或鏈狀存在，革蘭氏染色陽性，無芽孢，符合乳酸菌的定義。

2.2 活化菌株生化鑒定結果

對10號乳酸菌菌株和8個模式菌同時進行了生理生化檢測， 10號乳酸菌菌株不能代謝七葉甘、纖維素、麥芽糖、甘露醇、水楊甘、山梨醇、蔗糖，棉子糖(表1)。10號乳酸菌菌株在鹽度1%～10%下均能生長(表2)。10號乳酸菌菌株在26 、30、37、40、45 ℃下生長(表3)。

菌號七葉苷纖維素麥芽糖甘露醇水楊苷山梨醇蔗糖棉子糖10號菌種--------Lactobacillus pentosus--------Lactobacillus plantarum subsp. argentoratensis++++++++Lactobacillus paraplantarum--------Lactobacillus fabifermentans--------Lactobacillus zeae++++++++Lactobacillus paracasei subsp. Tolerans--------Lactobacillus paracasei subsp. paracasei--------Lactobacillus rhamnosus+++++++-

注：10號菌種為待測菌，其他菌種為模式菌，作為對比。“+”陽性為可代謝；“-”陰性為不可代謝。

表2 乳酸菌的鹽度實驗結果

注：10號菌種為待測菌，其他菌種為模式菌，作為對比?！?”陽性為可生長；“-”陰性為不可生長。

表3 乳酸菌的溫度實驗結果

注：10號菌種為待測菌，其他菌種為模式菌，作為對比?！?”陽性為可生長；“-”陰性為不可生長。

2.3 菌株的16S rDNA 片段測序結果及入庫比對結果

經(jīng)DNA 提取、PCR 擴增、產(chǎn)物測序和數(shù)據(jù)分析對該菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定，其中16S rDNA產(chǎn)物測序結果通過Eztaxon數(shù)據(jù)庫比對，保守基因rpoA、pheS的擴增產(chǎn)物通過NCBI數(shù)據(jù)庫比對[11]，發(fā)酵駝乳中乳酸菌菌株的序列和已報道的乳酸菌菌株16S rDNA、rpoA、pheS的序列分別用MEGA 5.2 軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹的繪制[12]，其16S rDNA測序結果為：GACGAACGCT GGCGGCGTGC CTAATACATG CAAGTCGAAC GAACTCTGGT ATTGATTGGT GCTTGCATCA TGATTTACAT TTGAGTGAGT GGCGAACTGG TGAGTAACAC GTGGGAAACC TGCCCAGAAG CGGGGGATAA CACCTGGAAA CAGATGCTAA TACCGCATAA CAACTTGGAC CGCATGGTCC GAGTTTGAAA GATGGCTTCG GCTATCACTT TTGGATGGTC。圖2顯示，此菌株(10號)的16S rDNA序列與Lactobacilluspentosus(JCM 1558T)、Lactobacillusplantarumsubsp.Argentoratensis(DKO 22T)、Lactobacillusparaplantarum(DSM 10667T)和Lactobacillusplantarumsubsp.Plantarum(ATCC 14917T)的相似率分別為100%、99.87%、99.8%和99.74%。圖3顯示，此菌株(10號)的rpoA序列與Lactobacilluspentosus(JCM 1558T)最相近。圖4顯示，此菌株(10號)的pheS序列與Lactobacilluspentosus(JCM 1558T)最相近。

3 討論

采用16S rDNA序列分析對新疆傳統(tǒng)發(fā)酵駝乳中一株乳酸菌進行分子生物學鑒定。有研究報道，運用16S rDNA分析鑒定乳酸菌，準確率可達97%～99%[13]，比傳統(tǒng)的生化實驗鑒定準確度高,結果更可靠。但是由圖2的系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，10號菌株與Lactobacilluspentosus(JCM 1558T)、Lactobacillusplantarumsubsp.Argentoratensis(DKO 22T)和Lactobacillusplantarumsubsp.Plantarum(ATCC 14917T)非常相近，分別為100%、99.87%、99.74%。不能明顯得出其最后的結果，所以本實驗加入了rpoA與pheS序列進行同源性分析，從圖3與圖4系統(tǒng)發(fā)育樹可看出，10號乳酸桿菌與Lactobacillus pentosus(JCM 1558T)最相近，在系統(tǒng)發(fā)育樹的同一樹干上，并且結合了生化實驗，10號乳酸桿菌的結果與Lactobacilluspentosus(JCM 1558T)最相近。最終通過16S rDNA、rpoA、pheS與生化實驗結果確定此菌株為Lactobacilluspentosus(JCM 1558T)。

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