脹果甘草的簡(jiǎn)便快速鑒定方法

木合布力·阿布力孜， 王永波， 施翔弋,2， 熱娜·卡斯木

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥化有機(jī)教研室， 烏魯木齊 830011； 2上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院， 上海 201210)

甘草(Glycyrrhizarout)是多年生草本植物，藥用其根與根莖。在我國(guó)甘草藥用歷史悠久，得到廣泛的應(yīng)用。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為其有益氣補(bǔ)中、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥等功效。甘草的品種較多，而《中國(guó)藥典》(2010 年版一部)記載其原植物有 3 種，即烏拉爾甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)、脹果甘草(GlycyrrhizainflataBat)和光果甘草(GlycyrrhizaglabraL)，其中脹果甘草在新疆、甘肅等西部地區(qū)的分布資源較為豐富[1]。

甘草的化學(xué)成分是其藥用功效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)外已從甘草中分離出100多種黃酮類化合物、60多種三菇類化合物及香豆素類、18種氨基酸、多種生物堿、雌激素類和多種有機(jī)酸等[2]。然而，不同種類甘草的化學(xué)成分有一定的區(qū)別，故其藥用價(jià)值可能不完全相同。因此，在甘草的資源考察和藥用研究中，對(duì)其品種鑒定是非常重要的。甘草的品種鑒定一般包括藥材全草的形態(tài)鑒定及藥材粉末的纖維鑒定等較系統(tǒng)而復(fù)雜的生藥鑒定方法。此方法有時(shí)在無(wú)全草鑒定輔助的條件下可產(chǎn)生一定的誤差。崔淑芬等[3]報(bào)道了一種準(zhǔn)確度較高而程序較復(fù)雜的微乳薄層鑒別法。對(duì)不同品種甘草的簡(jiǎn)便快速的鑒定方法的報(bào)道很少。本研究利用脹果甘草中的特殊黃酮類成分甘草查爾酮A為對(duì)照品，以簡(jiǎn)便的薄層色譜法快速鑒別脹果甘草品種的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行研究，并獲得較滿意的實(shí)用性結(jié)果，方法準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性都高，可為中藥材甘草的快速品種鑒定、資源考察及產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供簡(jiǎn)便有效的輔助手段及參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥材

新疆脹果甘草(3份樣本于2012年8月分別采集于新疆甘草資源較豐富的巴楚縣、新和縣、和靜縣基地，并編號(hào)為GC-1、GC-2、GC-3)；光果甘草(2012年8月采集于新疆巴楚，編號(hào)GC-4)。以上甘草樣本根據(jù)藥材特征初步鑒定品種，新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院帕麗達(dá)·阿不力孜教授進(jìn)行生藥學(xué)品種鑒定為脹果甘草(GlycyrrhizainflataBat)和光果甘草(GlycyrrhizaglabraL)。

1.2 儀器與試劑

Unity-Inova600超導(dǎo)核磁共振譜儀(美國(guó)Varian公司)，IR Prestige-21紅外光譜儀(SHIMADZU)，AB104-N電子天平(Mettler-Toledo Group)，DT200型電子分析天平(常熟市衡器廠)，SHB-111A型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科共貿(mào)有限公司)，SK2510HP型數(shù)控超聲清洗儀(上海科導(dǎo)超聲儀有限公司)，N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)，ZF-20C暗箱式紫外分析儀(上海寶山顧村電光儀器廠)，WRS-1A型數(shù)字式熔點(diǎn)測(cè)定儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，HH-S恒溫水浴鍋，粉碎機(jī)，進(jìn)口硅膠薄層GF254層析板(德國(guó)Merck)。

無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、石油醚、三氯甲烷、1,2-二氯甲烷等均為分析純；柱層析硅膠(60-100目，青島康業(yè)鑫)，甘草查爾酮A對(duì)照品(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)803529)，蒸餾水(新疆醫(yī)科大學(xué)蒸餾水供應(yīng)中心提供)。

2 方法與結(jié)果

2.1 甘草總黃酮提取物的制備

將不同產(chǎn)地的干燥脹果甘草根(GC-1～3)分別經(jīng)粉碎和過(guò)20目篩后，各取粉末1 g，在10 mL的75%乙醇中室溫浸泡10 min后，放入水浴鍋中，60℃下超聲5 min后繼續(xù)加溫提取15 min，并過(guò)濾，得約6 mL的供試品溶液，分別編號(hào)為T-A1(提取物A1，巴楚脹果甘草GC-1)、T-A2(新和GC-2)和T-A3(和靜GC-3)。再稱取已鑒定的光果甘草藥材粉末1 g，按同法制備提取物B(T-B，巴楚GC-4)，備用。

2.2 甘草查爾酮A對(duì)照品溶液的制備

取甘草查爾酮A對(duì)照品約2 mg，溶解于適量75%的乙醇中，制成濃度為0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液備用。

2.3 甘草總黃酮提取物的薄層鑒定

利用毛細(xì)管，將以上所制備的4種總黃酮粗提物溶液(3種脹果甘草提取物T-A1、T-A2、T-A3和光果甘草提取物T-B)及對(duì)照品溶液，分別點(diǎn)樣于1張進(jìn)口硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯∶甲酸∶水(8∶3∶1)混合展開劑進(jìn)行展開，并在紫外燈下觀察薄層斑點(diǎn)特征。

2.4 脹果甘草總黃酮中特殊斑點(diǎn)的分離鑒定

稱取已鑒定的干燥脹果甘草根粉末10 g，在100 mL的75%乙醇中室溫浸泡2 h后，放入水浴鍋中，60℃加溫提取2 h并過(guò)濾，得65 mL的提取液，減壓濃縮至稠膏狀，利用自制的硅膠制備薄層板(20 cm×20 cm，0.3 mm)進(jìn)行展開[1,2-二氯乙烷∶甲醇∶乙酸乙酯(3∶0.5∶1)]，在紫外光下顯色，對(duì)具有甘草查爾酮A斑點(diǎn)特色的色帶劃線標(biāo)記，并用刀片刮取，用甲醇提取，減壓濃縮至干，黃色提取物固體用乙酸乙酯-石油醚重結(jié)晶，得少量亮黃色針狀結(jié)晶，過(guò)濾，干燥，并用光譜方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

2.5 結(jié)果

2.5.1 不同產(chǎn)地的3種脹果甘草薄層色譜特征 不同產(chǎn)地的3種脹果甘草總黃酮粗提物T-A1、T-A2、T-A3的薄層色譜特征(硅膠GF254板，展開劑為乙酸乙酯∶甲酸∶水=8∶3∶1)：3種提取物的薄層斑點(diǎn)上，至少有10個(gè)斑點(diǎn)，其中上端有7～8個(gè)紫外熒光特征的斑點(diǎn)；提取物都具有與對(duì)照物甘草查爾酮A(LicoA)相應(yīng)的亮黃色熒光斑點(diǎn)(Rf=0.79)，即適合脹果甘草特征，見圖1。

2.5.2 脹果甘草與光果甘草提取物的薄層色譜特征比較 脹果甘草與光果甘草提取物中黃酮類化合物的組成有差異，其中光果甘草總黃酮提取物中不顯甘草查爾酮A(LicoA)的斑點(diǎn)特征(圖2)。顯示本實(shí)驗(yàn)所建立的薄層色譜鑒定法在脹果甘草和光果甘草品種的快速鑒定中具有使用價(jià)值。

2.5.3 單體成分的光譜鑒定結(jié)果 經(jīng)薄層鑒定結(jié)果可觀察到，不同產(chǎn)地的脹果甘草乙醇提取物中都具有符合于甘草查爾酮A的1個(gè)亮黃色熒光斑點(diǎn)。經(jīng)制備薄層法分離純化并重結(jié)晶后獲得其與對(duì)照品相似的亮黃色針狀結(jié)晶，經(jīng)理化鑒定和光譜鑒定后，獲得單體化合物的鑒定數(shù)據(jù)如下：金黃色針狀結(jié)晶(乙酸乙酯-石油醚)，紫外燈下呈亮黃色熒光，m.p.：155.7～157.6℃，易溶于氯仿、乙酸乙酯，溶于甲醇、乙醇、丙酮，微溶于石油醚，不溶于水。鹽酸-鎂粉反應(yīng)顯微紅色，與FeCl3溶液反應(yīng)生成黃色沉淀，遇堿性顯色試劑顯橙色，遇到硫酸顯桔紅色。IR(紅外光譜，KBr壓片)υcm-1：3217，2964，1650，1604，1587，1556，1510，1446，1346，1290，1261，1215，1166，1078，1039，1006，904，837。1H-NMR(核磁共振譜，Varian 600, CDCl3) δppm：8.03(1H，d，J=16 Hz，H-β)，7.98(2H，d，J=8.5Hz，H-2′，6′)，7.58(1H，d，J=16Hz，H-α)，7.47(1H，s，H-6)，6.96(2H，d，J=8.5Hz，H-3′，5′)，6.45(1H，s，H-3)，6.20(1H，dd，J=18，10Hz，H-2″)，5.35(1H，dd，J=18.1Hz，H-3″)，5.32(1H，dd，J=10.1Hz，H-3″)，3.87(3H，s，OCH3)，2.19(2H，s，OH-4，4′)，1.45(6H，s，CH3-4″，5″)。甘草查爾酮A的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖3所示。 NMR譜中觀察到8.03(1H，d，J=16Hz，H-β)和7.58(1H，d，J=16Hz，H-α)，為典型的查爾酮特征信號(hào)。氫譜還給出一組AA′XX′偶合的A環(huán)芳?xì)湫盘?hào)7.98(2H，d，J=8.5Hz，H-2′，6′)和6.96(2H，d，J=8.5Hz，H-3′，5′)，以及B環(huán)2個(gè)孤立芳環(huán)質(zhì)子信號(hào)7.47(1H，s，H-6)和6.45(1H，s，H-3)。此外，氫譜還給出1組末端雙鍵質(zhì)子信號(hào)6.20(1H，dd，J=18，10Hz，H-2″)、5.35(1H，dd，J=18.1Hz，H-3″)和5.32(1H，dd，J=10.1Hz，H-3″)，1個(gè)甲氧基信號(hào)3.87(3H，s，OCH3)，2個(gè)酚羥基信號(hào)2.19(2H，s，OH-4，4′)以及2個(gè)甲基信號(hào)1.45(6H，s，CH3-4″，5″)。以上鑒定結(jié)果與文獻(xiàn)[4]報(bào)道的一致。因此，將此單體成分鑒定為甘草查爾酮A(結(jié)構(gòu)式如圖3所示)。

3 討論

脹果甘草是甘草品種之一，主要分布于新疆、甘肅、內(nèi)蒙古一帶，是《中國(guó)藥典》2010版收錄的甘草藥用品種之一。近期研究顯示，脹果甘草中的總黃酮具有較明顯的抗癌活性，其中尤其是對(duì)人宮頸癌細(xì)胞的增殖顯示明顯強(qiáng)的抑制活性，并能促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[5]。近期的實(shí)驗(yàn)研究顯示，脹果甘草中特有的查爾酮類單體成分——甘草查爾酮A顯示明顯的抗宮頸癌、抗前列腺癌和抗乳腺癌活性，并能抑制癌細(xì)胞的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移[6-8]。這些研究結(jié)果促進(jìn)了脹果甘草在抗癌新藥研究中的潛在價(jià)值。然而，市售的甘草根因?yàn)楫a(chǎn)地和原植物形態(tài)不明而較難以確定其品種特征，需要進(jìn)行較復(fù)雜的生藥學(xué)鑒定才能確定。

崔淑芬等[3]利用微乳薄層色譜法對(duì)《中國(guó)藥典》收錄的烏拉爾甘草、脹果甘草和光果甘草3種甘草品種進(jìn)行鑒定，并提出與對(duì)照品甘草查爾酮A相對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)只存在于脹果甘草中，從而進(jìn)一步確定甘草查爾酮A是脹果甘草中的種屬特異性成分。然而微乳薄層方法需要進(jìn)行較復(fù)雜的操作程序，對(duì)儀器設(shè)備要求也較高且耗時(shí)。

作為脹果甘草中種屬特異性成分之一的單體化合物甘草查爾酮A主要存在于脹果甘草中。本實(shí)驗(yàn)中，利用簡(jiǎn)單的硅膠薄層色譜法，以甘草查爾酮A為對(duì)照品來(lái)對(duì)新疆脹果甘草進(jìn)行快速色譜鑒定的研究，并建立脹果甘草的快速品種鑒定的方法。利用脹果甘草中的種屬特異性成分甘草查爾酮A為對(duì)照品，對(duì)新疆不同產(chǎn)地脹果甘草根的薄層色譜特點(diǎn)進(jìn)行鑒定觀察，并將之與新疆分布較廣的另一種甘草品種光果甘草進(jìn)行對(duì)比分析。同時(shí)利用制備薄層方法，對(duì)脹果甘草樣品中符合甘草查爾酮A的薄層斑點(diǎn)進(jìn)行分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定，確定是否為甘草查爾酮A，從而進(jìn)一步驗(yàn)證鑒定效果。在操作中，首先以甘草查爾酮A為對(duì)照品，對(duì)摘自不同產(chǎn)地并已鑒定品種的3種脹果甘草根樣品用75%乙醇提取制備提取物(主要為總黃酮類粗品)，并進(jìn)行薄層色譜鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種脹果甘草樣品中都具有很明顯的查爾酮A亮黃色熒光斑點(diǎn)，以此對(duì)脹果甘草總黃酮類提取物的薄層色譜斑點(diǎn)特征進(jìn)行較系統(tǒng)的描述。進(jìn)一步利用制備薄層法，將適合于甘草查爾酮A對(duì)照品特征的樣品斑點(diǎn)(色帶)進(jìn)行分離純化，利用光譜方法確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)為甘草查爾酮A，從而進(jìn)一步確定適合于對(duì)照品特征的樣品斑點(diǎn)確實(shí)為甘草查爾酮A。同時(shí)制備另一種甘草品種光果甘草的乙醇提取物，在薄層板上在相同條件下與脹果甘草提取物平行展開，觀察2種甘草品種的薄層色譜斑點(diǎn)特征，發(fā)現(xiàn)2種甘草品種的薄層色譜特點(diǎn)明顯不同，尤其是光果甘草乙醇提取物在薄層板上不存在適合于甘草查爾酮A的斑點(diǎn)。此結(jié)果與采用微乳薄層方法的結(jié)果一致[3]。關(guān)于薄層展開劑的溶劑選擇及其比例篩選方面，經(jīng)反復(fù)多次摸索，最后確定混合展開劑的組成和比例為乙酸乙酯∶甲酸∶水(8∶3∶1)。本課題組前期研究詳細(xì)描述了從新疆脹果甘草中高效制備甘草查爾酮A對(duì)照品的方法。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，以甘草查爾酮A為對(duì)照品的薄層色譜法是簡(jiǎn)便快速鑒定脹果甘草品種的一種有效鑒定方法，此結(jié)果對(duì)脹果甘草的快速品種鑒定、甘草的資源考察研究以及其產(chǎn)品的質(zhì)量控制將具有一定的參考價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典2010[S]. 一部. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2010:80-81.

[2] 陶哺，劉曉清，屈振剛.甘草化學(xué)成分研究進(jìn)展[J]. 河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009,3(13)：77-79.

[3] 崔淑芬，林煥冰，F(xiàn)rank SCL, 等.微乳薄層法鑒別甘草的研究[J]. 中藥材，2007,38(4)：540-542.

[4] Wang QE, Frank SC, Wang XR. Isolation and purification of inflacoumarin A and licochalcone A from licorice by high-speed counter-current chromatography[J]. J Chromatogr A, 2004, 1048:51-57.

[5] Guo X, Matsidik R, Ablise M, et al. Anti-cancer activity of flavonoids from Xinjiang Glycyrrhiza inflata Licorice on proliferation, cytotoxicity and apoptosis in cervical carcinoma cells[J]. J Med Plants Res, 2013, 7(5):173-178.

[6] Yi TY, Gia SS, Keng FH, et al. Licorice and licochalcone-a induce autophagy in LNCaP prostate cancer cells by suppression of Bcl-2 expression and the mTOR pathway[J]. J Agric Food Chem, 2009, 57:8266-8273.

[7] Xiao XY, Hao M, Yang XY, et al. Licochalcone A inhibits growth of gastric cancer cells by arresting cell cycle progression and inducing apoptosis[J]. Cancer Lett, 2011, 302:69-75.

[8] Kim JK, Shin EK, Park JH, et al. Antitumor and anti-metastatic effects of Licochalcone A in mouse models[J]. J Mol Med (Berlin, Germany), 2010, 88:829-838.