microRNA657與新疆維吾爾族高脂血癥相關(guān)性研究

杜 憲, 焦 誼, 龍 梅， 王麗鳳， 毛新民, 米娜瓦爾·胡加艾， 武 云，朱曼麗， 李琳琳， 王 燁

(新疆醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室， 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能教研室， 3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，4中醫(yī)學(xué)院，5第一附屬醫(yī)院綜合內(nèi)科， 6協(xié)同實驗中心， 7基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室， 烏魯木齊 830011)

高脂血癥是各種原因?qū)е碌难獫{中膽固醇和(或)甘油三酯水平升高的一種疾病，是引發(fā)和加重動脈粥樣硬化的病理基礎(chǔ)及導(dǎo)致動脈硬化、心絞痛、心肌梗死、腦梗塞、腎損害等動脈栓塞性疾病的獨立危害因素[1]。我國高脂血癥的發(fā)生以高甘油三酯居多,主要與飲食、體質(zhì)指數(shù)(BMI)和生活方式關(guān)系較大[2]。孫玉萍等[3]調(diào)查新疆維吾爾族高脂血癥的分析研究發(fā)現(xiàn)：隨年齡增加,維吾爾族人群脂代謝水平紊亂與高脂血癥的患病率增加，而高脂血癥主要表現(xiàn)為高甘油三酯血癥和高膽固醇血癥患病率增加。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(microRNA)與脂代謝調(diào)節(jié)密切相關(guān)，microRNA對脂代謝的調(diào)節(jié)是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的過程，不同microRNA之間的靶點具有重疊性，相關(guān)的作用機(jī)制涉及到膽固醇、甘油三酯、脂肪酸等脂質(zhì)的合成、代謝和轉(zhuǎn)化。microRNA生物學(xué)功能是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)，其發(fā)生在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平。因此本研究采用前期芯片初篩結(jié)果及實時熒光定量PCR方法驗證，初步探討microRNA657與維吾爾族高脂血癥的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 主要試劑與儀器 異丙醇，氯仿(SIGMA)，TRIzol REAGENT BD(MRC)，miScript SYBR?Green PCR kit、miScript Primer Assays、10×miScript Universal Primer microRNANeasy mini KitmiScript Ⅱ RT Kit (德國Qiagen公司)。渦旋混合器，低溫高速離心機(jī)，實時熒光定量PCR熱循環(huán)儀購自ABI公司。

1.1.2 標(biāo)本采集 樣本采自新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌VIP二病區(qū)維吾爾族高脂血癥組和血脂正常組抗凝全血樣本各14例。樣本均為受調(diào)查者早晨空腹的新鮮抗凝血樣。本方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。高脂血癥納入標(biāo)準(zhǔn)：血脂水平參照中國成人血脂異常防治指南規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)[4]，總膽固醇(TC)濃度≥5.18 mmol/L，甘油三酯(TG)濃度≥1.7 mmol/L，高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)濃度<1.04 mmol/L，低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)濃度≥3.37 mmol/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)妊娠或哺乳期婦女；(2)半年內(nèi)曾患急性心肌梗死、腦血管意外、嚴(yán)重創(chuàng)傷或重大手術(shù)后的患者；(3)在被調(diào)查期間患有感冒、急性胃腸炎等急性疾病而對證候判斷產(chǎn)生干擾者。

1.2方法

1.2.1 臨床指標(biāo)的測定 受試者脫鞋、免冠，測量身高、體質(zhì)量、臀圍、腰圍，并計算體質(zhì)指數(shù)(BMI)。測量2次收縮壓與舒張壓，取平均值；采集肘靜脈血5 mL，分別測空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等生化指標(biāo)。

1.2.2 抗凝血中提取總RNA及逆轉(zhuǎn)錄 用TRI REAGENT BD的方法提取總RNA樣品；在冰上準(zhǔn)備反轉(zhuǎn)錄體系，根據(jù)miScript Ⅱ RT Kit試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，在37℃孵育60 min及95℃孵育5 min的條件下合成單鏈cDNA。

1.2.3 實時熒光定量PCR 取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA模板2 μL，配制PCR總反應(yīng)體系20 μL。參照miScript SYBR?Green PCR kit試劑盒說明書操作，進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃ 15 min，變性94℃ 15 s，退火55℃ 30 s，延伸70℃ 35 s，共40個循環(huán)。每個樣本重復(fù)2次。

2 結(jié)果

2.1維吾爾族高脂血癥組和血脂正常組間體檢及生化指標(biāo)的比較維吾爾族高脂血癥組患者年齡、FPG、TG水平高于血脂正常組，HDL-C水平低于血脂正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩組其余指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,見表1、2。

表1 維吾爾族高脂血癥和血脂正常組間體檢指標(biāo)的比較

表2 維吾爾族高脂血癥和血脂正常組間生化指標(biāo)的比較

2.2實時RT-PCR檢測microRNA657在維吾爾族高脂血癥組和血脂正常組抗凝全血中的表達(dá)實時RT-PCR分析結(jié)果顯示：內(nèi)參U6和microRNA657的擴(kuò)增曲線展示了RT-PCR產(chǎn)物好的擴(kuò)增效率；其熔解曲線為單峰，出峰位置為U6和microRNA657的退火溫度，特異性好。microRNA657在維吾爾族血脂正常組的表達(dá)量為(2.664±0.73)，較高脂血癥組的表達(dá)量(0.883±0.32)顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.237，P=0.038)，見圖1～5。

圖1 microRNA657在維吾爾族血脂正常組和高脂血癥組表達(dá)量的比較

圖2 內(nèi)參U6熔解曲線

圖3 內(nèi)參U6擴(kuò)增曲線

圖4 microRNA657 熔解曲線

圖5 microRNA657 擴(kuò)增曲線

2.3microRNA657與維吾爾族高脂血癥組和血脂正常組臨床指標(biāo)的相關(guān)分析在維吾爾族高脂血癥組和血脂正常組中,microRNA657與臨床的相關(guān)指標(biāo)無相關(guān)性(P>0.05)。在控制年齡的影響后，偏相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)microRNA657的表達(dá)量與收縮壓呈負(fù)相關(guān)(r=-0.518,P<0.05)，與舒張壓呈負(fù)相關(guān)(r=-0.529，P<0.05)，而與身高、體質(zhì)量、腰圍、臀圍、腰臀比、FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C等無相關(guān)性。提示在控制年齡的影響后，隨著microRNA657的表達(dá)量增加，收縮壓和舒張壓的水平會逐漸下降。

3 討論

高脂血癥又稱脂質(zhì)代謝紊亂或異常，是導(dǎo)致脂肪肝、動脈粥樣硬化等多種疾病的因素。高血脂癥的病因?qū)W預(yù)防和治療已經(jīng)成為目前的研究熱點，但至今藥物治療尚未明顯突破。而近期研究發(fā)現(xiàn)，microRNA與人類脂質(zhì)代謝及心血管疾病等密切相關(guān)[6-7]。microRNAs是一種內(nèi)源性、高度保守的、大小約為22個核苷酸的單鏈非編碼RNA，通過促進(jìn)靶mRNA的降解或抑制其翻譯而致基因表達(dá)沉默[8-10]。據(jù)報道人類所有microRNA約占基因總數(shù)的3%，可能調(diào)控人體細(xì)胞中約30%的蛋白質(zhì)編碼基因[11]，參與生命中許多復(fù)雜的生理過程。

研究發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)microRNA143的表達(dá)可以使甘油三酯聚集減少，并且抑制脂肪細(xì)胞的分化，下調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4和PPARγ編碼基因的表達(dá)，間接調(diào)控糖、脂的代謝[12]。在肝臟中特異表達(dá)的microRNA21可正性調(diào)控膽固醇生物合成關(guān)鍵酶的表達(dá)，維持正常脂代謝[ 13-14]。microRNA122和microRNA370通過調(diào)控脂肪酸的β氧化反應(yīng)進(jìn)程調(diào)節(jié)血脂的代謝[15]。有研究通過向小鼠尾靜脈內(nèi)注射固定劑量的microRNA122拮抗劑發(fā)現(xiàn)microRNA122作用被抑制后，實驗組小鼠血漿膽固醇水平比對照組降低40%以上[16]。諸多研究表明microRNA與脂代謝息息相關(guān)。

目前國內(nèi)外對微小RNA的研究有很多，但是對microRNA657的研究尚不多。研究發(fā)現(xiàn)microRNA657可以調(diào)控Hep G2細(xì)胞中的IGF2R的表達(dá)水平，有助于解釋2型糖尿病的發(fā)生機(jī)制[17]。microRNA657作用于靶基因TLE1通過NFKB途徑促進(jìn)腫瘤發(fā)生肝癌[18]。但是目前的研究尚未發(fā)現(xiàn)microRNA657與脂質(zhì)代謝及心血管等疾病相關(guān)。本研究通過對維吾爾族高脂血癥和血脂正常組的抗凝全血中microRNA表達(dá)量的研究發(fā)現(xiàn)，microRNA657在維吾爾族的高脂血癥和非高脂血癥人群中抗凝全血存在差異表達(dá)，microRNA657高脂血癥組的表達(dá)低于血脂正常組(P<0.05)。而Xu等[19]在2003年就發(fā)現(xiàn)microRNA與血脂存在關(guān)聯(lián)，將microRNA14沉默后，動物體內(nèi)的甘油三酯和甘油二酯水平都升高，而增加microRNA14的表達(dá)后，血脂水平則恢復(fù)正常。關(guān)于microRNA657的表達(dá)上調(diào)是否同樣具有降低血脂的作用，有待于在后續(xù)的試驗中繼續(xù)研究。

高血脂與高血壓在心血管病發(fā)病危險中有著重要作用，且二者之間又是相互促進(jìn)[20]。高血脂人群血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇均可作用于細(xì)胞膜，使其通透性改變，并與細(xì)胞Ca2+內(nèi)流呈正相關(guān)。Ca2+內(nèi)流增加導(dǎo)致血管平滑肌收縮增加、外周血管阻力升高，導(dǎo)致血壓升高。本研究發(fā)現(xiàn)，在偏相關(guān)性分析中，microRNA657與收縮壓和舒張壓呈負(fù)相關(guān)，說明microRNA657與血壓具有相關(guān)性，也提示若降低microRNA657在維吾爾族高脂血癥組的表達(dá)水平，則其血壓狀況也可能會升高。

另外，本研究實驗結(jié)束后，又利用targetscan、mirBase和miranda3個靶基因軟件綜合預(yù)測了microRNA657的靶基因，發(fā)現(xiàn)有CYTL1、 KIAA1324、PCYT1B等多個靶基因，這些靶基因分別涉及細(xì)胞的生長代謝、免疫調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂代謝等多種功能。目前，用實驗方法和計算機(jī)生物信息學(xué)手段明確了在維吾爾族高脂血癥人群microRNA657的差異表達(dá)及其靶標(biāo)，這也為揭示它的功能奠定了基礎(chǔ)。因此，在此基礎(chǔ)之上探明microRNA657具體調(diào)節(jié)途徑以及作用機(jī)制將是對研究維吾爾族高脂血癥調(diào)控的相關(guān)理論提供新的理論依據(jù)。后續(xù)的試驗研究將針對microRNA657的具體作用靶點以及在脂代謝中如何發(fā)揮其生物學(xué)功能進(jìn)行深入的研究。

綜上所述，本研究分別從新疆維吾爾族高脂血癥組和血脂正常組人群的抗凝全血中檢測到了microRNA657的差異表達(dá)，其表達(dá)水平的高低與維吾爾族高脂血癥相關(guān)。通過對microRNA657的研究，以期在microRNA分子研究水平上，為新一代的調(diào)血脂藥物提供一個新的切入點。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究microRNA657在高脂血癥的作用及其機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時也為microRNA657的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制的研究提供了參考依據(jù)。

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