代料配方與傳統(tǒng)松木栽培茯苓的質(zhì)量分析比較研究*

楊 祺，周元科，黃 婕，孫盼盼，劉焱文

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北省中藥資源與中藥化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430061）

茯苓是多孔菌科真菌Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核，其菌種寄生于松木的根莖繁殖而成。茯苓為中國(guó)特有藥食兩用中藥，史載于古典醫(yī)著《神龍本草》，列為上品；收載于歷年版《中國(guó)藥典》一部，具有滲濕利尿、和胃健脾、寧心安神的功效[1]。現(xiàn)代臨床研究表明，茯苓及其配方具有抗疲勞、抗腦卒中后抑郁、治療慢性腎小球腎炎、腹瀉等療效[2-5]。茯苓廣泛應(yīng)用于藥品和食品行業(yè)，為中藥大品種。據(jù)第3次全國(guó)中藥資源普查統(tǒng)計(jì)，該藥材每年的需求量為1.5萬(wàn)噸以上[6]。由于歷年過(guò)度采挖，中國(guó)野生茯苓藥材極為稀少，瀕臨滅絕，所需藥材依賴人工栽培。傳統(tǒng)栽培茯苓方法是砍伐松木作為菌種繁殖藥材的原料，每年消耗大量的松木，嚴(yán)重影響生態(tài)環(huán)境。因此，尋找替代松木栽培茯苓的原料是我國(guó)科學(xué)工作者面臨的重要研究課題。筆者對(duì)茯苓藥材的資源調(diào)查、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量分析、規(guī)范化種植等[7-10]進(jìn)行了多年的研究。在前期研究基礎(chǔ)上，近年來(lái)筆者開(kāi)展了代料配方栽培茯苓的研究工作，以期尋求代替松木栽培的原料。本研究采用現(xiàn)代儀器分析方法對(duì)代料配方與傳統(tǒng)松木栽培茯苓的有效成分含量進(jìn)行比對(duì)分析研究，從而為代料栽培茯苓的應(yīng)用前景提供了參考依據(jù)。

1 儀器與材料

Agilent1100高效液相色譜儀，UV-2401紫外檢測(cè)器，Agilent色譜工作站（美國(guó)Agilent公司），UV-2401紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津），KQ3200DE型超聲波清洗儀 (昆山市超聲儀器有限公司)，Sartonus型電子天平（十萬(wàn)分之一，德國(guó)）。

代料配方見(jiàn)表1，代料配方與傳統(tǒng)松木栽培茯苓藥材為本項(xiàng)目組在羅田九資河種植，經(jīng)本院鑒定教研室吳和珍教授鑒定為定為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf，通過(guò)發(fā)汗，去皮，切塊，陰干，粉碎過(guò)60目篩。菌種均為同仁堂1號(hào)（T1），由湖北省中醫(yī)藥研究院提供。茯苓酸對(duì)照品為本實(shí)驗(yàn)自制。乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總多糖的含量測(cè)定 參考文獻(xiàn)[11]。

2.1.1 苯酚溶液的制備 取苯酚50 g，加鋁片0.05 g和碳酸氫鈉0.025 g，置于圓底燒瓶，常壓蒸餾并收集182℃的餾分，冷卻后稱取餾分5.00g，置于100mL量瓶中，加蒸餾水95 mL稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)至棕色試劑瓶，搖勻，即得5%苯酚溶液。

2.1.2 多糖的提取純化方法 精密稱取茯苓粉末1.0000 g，置于 50 mL 燒瓶中，加 25 mL（60～90）石油醚于80℃水浴回流2h，冷卻，過(guò)濾，濾渣揮干溶劑置于200mL燒杯中，加0.1mol/LNaOH溶液100mL，冰浴攪拌1 h（＜5℃），混合溶液以3000 r/min的速度離心分離20 min，取上清液，用10%冰乙酸溶液調(diào)pH值至5～6，待其成黏糊狀，將糊狀物離心，棄上清液，再次離心并棄上清液，下層得白色凝膠狀沉淀，即為茯苓總多糖。

表1 6種栽培茯苓樣品的代料配方Tab.1 Six kinds of substitutes synergy ingredients

2.1.3 供試品溶液制備 取上述茯苓多糖，約1 g，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加水混溶解至刻度，緩慢攪拌均勻，再吸取0.25 mL至10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，即為茯苓多糖供試品溶液。

2.1.4 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取減壓干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品0.00152 g，置于25 mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻得0.0608 g/L的對(duì)照品溶液。

2.1.5 樣品的測(cè)定 分別精密稱取各代料配方樣品茯苓粉末約1.0000 g各3份（平行測(cè)定3份），按照上述方法制得供試品溶液，精密量取2.0 mL供試品溶液于20 mL試管中，分別加入5%苯酚溶液1.75 mL，充分混合后，緩慢加入6.0 mL濃硫酸，迅速搖勻，放置40 min，在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上，于490 nm處測(cè)定樣品的吸光度值（平均值），見(jiàn)表2。

2.2 總?cè)频暮繙y(cè)定 參考文獻(xiàn)[11]。

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取茯苓酸對(duì)照品0.00251 g，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用，即為濃度0.1004 g/L的對(duì)照品溶液。

2.2.2 樣品的測(cè)定 精密稱取各代料樣品茯苓粉末約0.5000 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加入甲醇15 mL，超聲提取90 min，過(guò)濾，用適量甲醇洗滌藥渣，定容至刻度，搖勻。吸取0.4 mL于10 mL的具塞試管中，水浴揮干溶劑，冷卻，準(zhǔn)確加入0.4 mL 5%香草醛冰醋酸溶液和1.8 mL高氯酸，混勻，蓋塞，置70℃恒溫水浴加熱20 min，取出，冷卻至室溫，加入冰醋酸5 mL，搖勻，于540 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 代料配方與傳統(tǒng)松木栽培茯苓的多糖含量測(cè)定Tab.2 The total polysaccharides determination results of Fuling and substitute cultivated Fuling

表3 不同代料茯苓總?cè)坪康臏y(cè)定結(jié)果Tab.3 The total triterpenoid determination results of Fuling and substitute cultivated Fuling

2.3 茯苓酸的含量測(cè)定 參考文獻(xiàn)[12-15]。

2.3.1 色譜條件 色譜柱型號(hào)：Kromasil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5μm），柱溫：30℃，流動(dòng)相：乙腈－0.2%乙酸（82∶18），流速：1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取茯苓酸對(duì)照品2.0214 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，密封，即得濃度為0.2022 g/L的茯苓酸對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液制備 精密稱取茯苓粉末約0.5000 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入甲醇15 mL及10 mL，加塞精密稱定，超聲兩次，每次30 min，放置室溫后濾過(guò)，甲醇洗滌濾渣，合并濾液，定容至25 mL。精密吸取續(xù)濾液5 mL于蒸發(fā)皿中，水浴揮干，用甲醇溶解殘?jiān)? mL量瓶中，即得。

圖1 測(cè)定樣品茯苓HPLC圖Fig.1 The HPLC figure of Fuling

2.3.4 樣品的測(cè)定 稱取各代料樣品的茯苓粉末，約0.5 g，精密稱定。按照上述方法制備供試品溶液，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液密封備用，分別精密吸取各供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定并計(jì)算茯苓酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 代料配方與傳統(tǒng)松木栽培的有效成分茯苓酸的含量測(cè)定Tab.4 The Poria acid assay results of Fuling and substitute cultivated Fuling

2.4 茯苓提取物的干膏收率的測(cè)定

2.4.1 茯苓醇提物的測(cè)定 將各代料樣品的茯苓飲片加8倍量的70%的乙醇回流提取2次，每次分別為2 h、1 h，過(guò)濾，合并濾液，揮干溶劑，干燥恒重，測(cè)定醇提物的干膏得率。

2.4.2 茯苓水提物的制備 將上述乙醇提取后的藥渣用8倍量的水回流提取3次，每次1 h，過(guò)濾，合并濾液，蒸干，恒重，測(cè)定水提物的收率。

2.4.3 茯苓堿水提取物測(cè)定 再將上述水提后的藥渣采用70倍量的0.5 mol/L NaOH攪拌提取1 h，過(guò)濾，濾液用HCL中和，離心，除鹽，再離心，干燥恒重，測(cè)定堿水提取物的收得率。

上述3種提取物干膏得率其測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

2.5 代料配方與傳統(tǒng)松木栽培茯苓質(zhì)量分析的加權(quán)綜合評(píng)價(jià) 將代料配方與傳統(tǒng)松木栽培茯苓各供試樣品測(cè)定的總多糖、總?cè)?、茯苓酸、醇提物、水提物、堿水提取物等指標(biāo)，采用Excel2007軟件處理，加權(quán)綜合評(píng)分，評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 代料配方與傳統(tǒng)松木栽培茯苓的3種提取物收得率Tab.5 Three extracts of dry extract of Fuling and substitute cultivated Fuling %

3 討論

根據(jù)諸多文獻(xiàn)報(bào)道，以及前期研究結(jié)果表明，茯苓的主要有效成分為茯苓多糖和茯苓三萜類成分。本研究以茯苓多糖、總?cè)啤④蜍咚幔ㄈ祁惓煞郑?、茯苓提取物為考察指?biāo)，對(duì)代料配方與傳統(tǒng)松木栽培茯苓進(jìn)行質(zhì)量分析比對(duì)研究。研究結(jié)果表明，代料配方栽培茯苓的多數(shù)測(cè)定指標(biāo)優(yōu)于傳統(tǒng)松木栽培茯苓；加權(quán)綜合評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，代料配方栽培茯苓各組得分均高于傳統(tǒng)松木對(duì)照組，傳統(tǒng)松木栽培茯苓組排次末位。因此本研究證明了代料栽培茯苓的質(zhì)量?jī)?yōu)于傳統(tǒng)松木栽培茯苓，從而為代料栽培茯苓的應(yīng)用前景提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)于保護(hù)松林生態(tài)環(huán)境具有潛在意義。

加權(quán)綜合評(píng)分結(jié)果表明，6種代料配方栽培茯苓的質(zhì)量存在較大的差異。代料配方C和F實(shí)驗(yàn)組得分最高，其排名位次并列第一，其他代料配方實(shí)驗(yàn)得分順序?yàn)镕>A>D>B。因此本項(xiàng)目統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果為代料配方栽培茯苓的后期研究奠定了良好的基礎(chǔ)。擬分析和調(diào)整代料配方的物料組成或配伍比例，進(jìn)一步開(kāi)展代料栽培茯苓研究，優(yōu)選最佳代料配方。

表6 茯苓及代料茯苓有效成分的綜合評(píng)分Tab.6 Composite scores of the active ingredient of Fuling and substitute cultivated Fuling

尋求替代松木栽培茯苓的代料配方研究已進(jìn)行了多年，至今難以推廣應(yīng)用主要存在兩個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，即產(chǎn)量低和成本較高。在后期研究工作中將針對(duì)提高栽培茯苓產(chǎn)量和降低栽培成本的關(guān)鍵問(wèn)題，優(yōu)選栽培茯苓的最佳代料配方。

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