奶牛不同發(fā)育時期乳腺組織IGF-I及其受體的表達(dá)與定位

崔英俊，李慶章

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱150030)

0 引 言

胰島素樣生長因子家族(Insulin-like growth factor family)是乳腺生長發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子。成熟IGF-I由70個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量約7.5 ku，是生長激素 (Growth factor，GH) 依賴的堿性單鏈蛋白[1]。IGF-I主要由垂體GH刺激肝產(chǎn)生，GH也可以刺激乳腺分泌IGF-I，并通過IGF-I對乳腺發(fā)育起作用。IGFI作于乳腺上皮細(xì)胞上的IGF-IR從而介導(dǎo)細(xì)胞的生存和增殖[2-3]，IGF-I缺失時乳腺不發(fā)育[4]。目前國內(nèi)外對胰島素樣生長因子家族成員的研究多以嚙齒類動物為研究對象，且多局限于RNA水平。本研究旨在闡述IGF-I及其受體IGF-IR在奶牛乳腺發(fā)育、泌乳及退化過程中表達(dá)定位的動態(tài)變化，揭示IGF-I及其受體表達(dá)變化與乳腺發(fā)育及泌乳功能的關(guān)系。

1 實 驗

1.1 實驗動物與樣品采集

本研究以健康荷斯坦奶牛為實驗動物，購自黑龍江省畜牧業(yè)科技園區(qū)。所選用的奶牛生理狀態(tài)均正常，沒有疾病記錄，泌乳期奶牛乳腺健康，產(chǎn)奶量正常。奶牛舍飼，舍溫18℃，通風(fēng)干燥，采光良好，自由采食飲水。

實驗動物按照青春期(Virgin，V)、妊娠期(Pregnancy，P)、泌乳期(Lactation，L)、退化期(Involution，I)4個時期共12個時點進(jìn)行取樣。分別為：青春期12個月(V12m)、青春期14個月(V14m)；妊娠期2個月(P2m)、妊娠期4個月(P4m)、妊娠期6個月(P6m)；圍產(chǎn)前期(產(chǎn)前7日，Peripartum)；泌乳期第7日(L7d)，泌乳期第50日(L50d)，泌乳期第140日(L140d)，泌乳期第280日(L280d)；退化期第3日(I3d)，退化期第30日(I30d)。 每個采樣時點選取3頭奶牛做平行實驗，每次試驗至少重復(fù)3次。在預(yù)定取樣時點，乳房中部消毒，按常規(guī)手術(shù)切取少量乳腺組織塊，獲取組織樣本。獲取的組織樣本在30 min內(nèi)于液氮速凍，保存于-80℃低溫冰箱備用。

1.2 主要試劑

兔抗IGF-I多克隆抗體 (H-70)(sc-9013)， 兔抗IGF-I Rβ多克隆抗體(3027)，鼠抗β-actin抗體(C-14)(sc-47778)，F(xiàn)ITC-羊抗兔IgG(sc-2012)，HRP-雞抗兔IgG，HRP-雞抗鼠IgG，正常山羊血清封閉液，DAPI (4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚)，TritonX-100，DABCO(1，4-重氮基雙環(huán)[2，2，2]辛烷)，BCA蛋白濃度測定試劑盒，RIPA蛋白裂解液 (P0013B)，ECL超敏化學(xué)發(fā)光液，Tricine(三[羥甲基]甲基甘氨酸)。其他試劑均為市售分析純試劑。

1.3 方法

1.3.1 免疫熒光檢測

厚度8 m的冰凍切片復(fù)溫后置于預(yù)冷丙酮，4℃固定10 min，PBS漂洗3次。體積分?jǐn)?shù)10%的山羊血清 37℃封閉2 h，再加入一抗(1:50)(陰性對照加等量PBS)，4 ℃過夜。次日PBS漂洗3 次，F(xiàn)ITC-羊抗兔IgG(1∶100)37 ℃孵育30 min，PBS漂洗3次。 DAPI(10 mg/L)染液室溫染核5 min，PBS漂洗3次，DABCO封片。激光掃描共聚焦顯微鏡 (Laser Scanning Confocal Microscopy，LSCM)進(jìn)行掃描拍照(400×)。

1.3.2 蛋白提取及Western blotting分析

稱取100 mg奶牛乳腺組織樣本剪碎后，于玻璃勻漿器中加入1 mLRIPA蛋白裂解液(PMSF終濃度為1 mmol/L)，冰上勻漿；充分裂解后，4 ℃，12 000 r/min離心5 min，取上清，即為總蛋白；用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。

蛋白樣品調(diào)至等濃度，與2×上樣緩沖液1:1混合，煮沸10 min，冷卻后50 μg/孔上樣，分別用8%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)分離IGF-IRβ，用16%Tricine-SDS-PAGE分離IGF-I，電泳結(jié)束后用半干轉(zhuǎn)移電泳法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜 (NC膜)。TBS洗滌NC膜10 min；將其放入適量50 g/L(質(zhì)量濃度)脫脂乳封閉液(TBS/T配制)中，37℃孵育1.5 h，一抗(兔抗IGF-I多克隆抗體1∶1000稀釋、兔抗IGF-I Rβ多克隆抗體1∶1000稀釋，鼠抗β-actin抗體，1∶500稀釋)4℃孵育過夜。TBS/T洗膜3次，每次5 min，二抗(HRP-山羊抗兔IgG 1∶10 000稀釋、HRP-雞抗鼠IgG 1∶1 000稀釋)孵育，室溫1 h，洗膜后用ECL超敏發(fā)光液孵育，X射線膠片壓片、顯影、定影，透射掃描儀掃描X光片。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

Western blotting結(jié)果用Bandscan 5.0軟件分析。所得數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，同一樣本不同處理的結(jié)果用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行t檢驗，多組數(shù)據(jù)之間應(yīng)用Duncan檢驗。P＜0.05為統(tǒng)計學(xué)差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺IGF-I及IGF-IR的定位

青春期奶牛乳腺發(fā)育的主要特征是導(dǎo)管發(fā)育。在發(fā)育良好的脂肪組織周圍可見小團(tuán)的導(dǎo)管。在導(dǎo)管腔上線狀排列著一個兩層上皮組織，它由近似方形的腔分泌細(xì)胞組成；導(dǎo)管腔上還有一個由肌上皮細(xì)胞組成的基底層。在導(dǎo)管間，圍繞著導(dǎo)管上皮有一個3～4層的疏松結(jié)締組織。IGF-I定位于青春期乳腺導(dǎo)管腔上皮細(xì)胞以及基質(zhì)中(圖1a)。IGF-IR顯示了與IGF-I類似的定位(圖1f)。

妊娠2個月時奶牛乳腺內(nèi)導(dǎo)管分支大量增殖，腺泡芽大量形成；妊娠4個月至妊娠6個月，乳腺腺泡大小不一、形態(tài)各異，腺泡腔逐步擴(kuò)大；圍產(chǎn)期時大量的小葉腺泡發(fā)育完全，小葉間和腺葉間的結(jié)締組織隔膜都伸長和變薄。IGF-I在圍產(chǎn)期(圖1c)、IGF-IR在妊娠期6個月表達(dá)較弱；在妊娠期的其他檢測時點，IGFI與IGF-IR均定位于妊娠期乳腺導(dǎo)管腔上皮細(xì)胞、乳腺腺泡上皮細(xì)胞，以及基質(zhì)中(圖1b，圖1 g～h)。

泌乳期乳腺小葉由大量具有張開腔結(jié)構(gòu)的腺泡組成，這些腔狀結(jié)構(gòu)間被結(jié)締組織分隔。在泌乳期，IGF-I與IGF-IR均定位于泌乳期乳腺腺泡上皮細(xì)胞以及基質(zhì)中(圖1d，圖1i)。

退化30d，IGF-I與IGF-IR均微弱定位于小葉間基質(zhì)(圖1e，圖1j)。

圖1 奶牛不同發(fā)育時期乳腺IGF-I及IGF-IR的定位

2.2 乳腺IGF-I及IGF-IR的蛋白表達(dá)變化

奶牛不同發(fā)育時期乳腺IGF-I及IGF-IR的蛋白表達(dá)變化分別如圖2和圖3所示。

圖2 奶牛不同發(fā)育時期乳腺IGF-I蛋白表達(dá)變化

圖3 奶牛不同發(fā)育時期乳腺IGF-IR蛋白表達(dá)變化

將Western blotting結(jié)果掃描，用Bandscan5.0軟件進(jìn)行灰度統(tǒng)計和分析，奶牛不同發(fā)育時期乳腺IGF-I及IGF-IR蛋白的相對表達(dá)量如圖4所示。

圖4 奶牛不同發(fā)育時期乳腺IGF-I及IGF-IR蛋白的相對表達(dá)量

IGF-I在V12m時蛋白表達(dá)量較高，隨后在V14m表達(dá)量顯著下降(P＜0.05)；進(jìn)入妊娠期，隨乳腺發(fā)育IGF-I表達(dá)量持續(xù)下降，至圍產(chǎn)前期達(dá)到最低值(P＜0.05)； 在泌乳期初期L7d，IGF-I表達(dá)量顯著高于圍產(chǎn)期(P＜0.05)，隨后在泌乳期各檢測時點IGF-I表達(dá)量持續(xù)升高，在L140d達(dá)到最大值(P＜0.05)，然后在L280d顯著下降(P＜0.05)；進(jìn)入退化期，IGF-I表達(dá)量繼續(xù)下降，在I30d檢測不到其蛋白表達(dá)(圖4a)。

在青春期時IGF-IR蛋白表達(dá)量沒有顯著性差異(P＞0.05)；在妊娠初期(P2m)和中期(P4m)，IGF-IR表達(dá)量顯著升高(P＜0.05)，隨后在P6m表達(dá)量突然顯著下降(P＜0.05)；在圍產(chǎn)前期IGF-IR表達(dá)量有一個顯著且突然的升高，并達(dá)到最大值(P＜0.05)；進(jìn)入泌乳期，IGF-IR表達(dá)量保持持續(xù)而顯著的下降(P＜0.05)，這種下降一直維持到退化期；在退化期的2個檢測時點，IGF-IR表達(dá)量持續(xù)下降但并無顯著性差異(P＞0.05)，在I30達(dá)到最小值(圖4b)。

3 討 論

在乳腺中IGF-I由與乳腺相關(guān)聯(lián)的基質(zhì)細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞以及脂肪細(xì)胞)合成，脂肪細(xì)胞對IGF-I的釋放可被葡萄糖和脂肪酸調(diào)節(jié)[5]。IGF-I的主要生理學(xué)作用是刺激出生后身體生長[6]，調(diào)節(jié)全身蛋白合成，調(diào)節(jié)組織周圍的葡萄糖攝取和脂質(zhì)代謝，以及細(xì)胞增殖[7-8]。在乳腺組織中，IGF-I與乳腺發(fā)育有關(guān)，能促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖，抑制其凋亡[9-10]。在泌乳晚期，IGF-I可能維持乳腺細(xì)胞數(shù)量，而不是直接刺激乳合成[11-13]。本研究結(jié)果表明，IGF-I蛋白表達(dá)量在泌乳期各檢測時點持續(xù)升高，在L140d達(dá)到最大值，然后在L280d顯著下降；這說明在乳汁形成及乳汁分泌過程中，局部IGF-I作用強(qiáng)。在泌乳晚期IGF-I蛋白表達(dá)下降，則可能是乳腺即將進(jìn)入退化期內(nèi)在調(diào)控的結(jié)果。

在小鼠青春期以及妊娠期誘導(dǎo)的乳腺發(fā)育過程中，IGF-IR在整個乳腺上皮組織表達(dá)。IGF-IR也在正常人乳腺組織表達(dá)[14-15]。IGF-IR對于正常青春期乳腺導(dǎo)管分枝以及末端乳芽增殖不可缺少[16]。Rowzee等(2009)研究結(jié)果表明，小鼠乳腺上皮細(xì)胞中的IGF-IR mRNA表達(dá)在妊娠早期達(dá)到峰值并在妊娠晚期下降[17]，這與本研究中青春期及妊娠期IGF-IR的蛋白表達(dá)規(guī)律基本一致。有研究表明IGFs的存在對分化有抑制作用。因此妊娠末期乳腺上皮細(xì)胞中IGF-IR下降，可能與減慢生長，給細(xì)胞分化多提供一些機(jī)會有關(guān)。

牛乳腺組織在泌乳期基本都是由上皮細(xì)胞組成[18]，因此IGF-IR在泌乳期表達(dá)量隨乳生成呈現(xiàn)變化可能是上皮細(xì)胞數(shù)量改變的結(jié)果。本研究結(jié)果表明，進(jìn)入泌乳期IGF-IR蛋白表達(dá)量持續(xù)下降；結(jié)合本研究泌乳期IGF-I蛋白表達(dá)先升后降的結(jié)果，說明在奶牛乳腺中IGF-I與IGF-IR結(jié)合并發(fā)揮作用時，可能還涉及其他的調(diào)控方式。

在奶牛不同發(fā)育時期，IGF-I和IGF-IR在奶牛乳腺中定位的一致性及其特異性表達(dá)規(guī)律，預(yù)示二者結(jié)合并參與了奶牛乳腺發(fā)育及泌乳的調(diào)控。IGF家族還有許多重要成員，各自具有復(fù)雜的生理功能。因此，奶牛不同發(fā)育時期乳腺中其他IGF家族成員的蛋白表達(dá)規(guī)律及彼此間的相互作用還有待深入研究。

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