棕色棉D(zhuǎn)FR基因的克隆與生物信息學(xué)分析

肖向文 朱奇朗 劉海峰 王俊鐸 羅城 曾聞梁亞軍 龔兆龍 李曉波

（1. 中國(guó)科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所 干旱區(qū)植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830011；2. 中國(guó)彩棉（集團(tuán)）股份有限公司，烏魯木齊830016；3. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，烏魯木齊 830091）

天然彩色棉作為環(huán)境友好型的純天然綠色產(chǎn)品，其纖維具有自然色彩，可省略化學(xué)染色，既節(jié)省生產(chǎn)成本，降低環(huán)境污染，又可避免紡織品中的化學(xué)染料對(duì)人體健康可能存在的某些不良影響，是真正意義上的“綠色、生態(tài)、環(huán)?！碧烊焕w維產(chǎn)品。彩棉紡織品被譽(yù)為“人類(lèi)第二健康肌膚”、“天然的護(hù)膚品”，符合人們對(duì)衣著需求的發(fā)展趨勢(shì)和回歸自然的潮流，迎合了市場(chǎng)的需求，是21世紀(jì)國(guó)際綠色紡織品市場(chǎng)上最具發(fā)展?jié)摿Φ漠a(chǎn)品之一，開(kāi)發(fā)前景十分廣闊［1-3]。近幾年經(jīng)過(guò)科研工作者的努力，選育出了一批產(chǎn)量、色澤、品質(zhì)等綜合性狀較優(yōu)的彩色棉新品種，在產(chǎn)量、抗性水平以及纖維品質(zhì)等方面取得了一定進(jìn)展，但彩色棉花一直存在著顏色單一、色譜狹窄、著色不均勻及色澤不穩(wěn)定等問(wèn)題，此外彩棉與白色棉相比，纖維品質(zhì)仍然有一定差距，這些因素都制約了彩棉的進(jìn)一步發(fā)展［4，5]。因此，提高彩棉的纖維品質(zhì)及獲得穩(wěn)定優(yōu)良的色澤特性，對(duì)于彩棉產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

彩棉色素物質(zhì)是彩棉纖維中獨(dú)特的次生代謝產(chǎn)物，此前的相關(guān)研究表明，彩棉色素物質(zhì)的合成同植物類(lèi)黃酮合成途徑存在著密切關(guān)系［6]，但具體機(jī)制尚不清楚。因此，開(kāi)展彩棉類(lèi)黃酮合成途徑中關(guān)鍵基因的克隆、表達(dá)特性研究及轉(zhuǎn)基因功能分析，對(duì)于揭示彩棉色素合成及調(diào)控的分子機(jī)制以及利用基因工程技術(shù)進(jìn)行彩棉纖維色彩及品質(zhì)的分子改良有著重要的意義。

類(lèi)黃酮（flavonoids）是植物次生代謝產(chǎn)物，類(lèi)黃酮化合物中的花青素等物質(zhì)是許多植物花、果實(shí)和種子色素的主要成分。迄今為止，在一些高等植物中，如擬南芥、玉米、矮牽牛等，有關(guān)類(lèi)黃酮物質(zhì)合成途徑的主要步驟已基本探明［7]，類(lèi)黃酮途徑已成為研究植物次生代謝基因表達(dá)及調(diào)控的模式途徑，也是植物次生代謝基因工程、代謝工程的主要目標(biāo)。Xiao等［8]利用分子生物學(xué)方法，從棕色棉中分別克隆了類(lèi)黃酮途徑中的5個(gè)關(guān)鍵酶基因查爾酮異構(gòu)酶（CHI），黃烷酮羥基化酶（F3H），二氫黃酮-4-還原酶（DFR），花青素合成酶（ANS），花青素還原酶（ANR）；通過(guò)RT-PCR 的方法檢測(cè)在棉纖維不同發(fā)育時(shí)期這5個(gè)基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明這幾個(gè)基因在棕色棉花中有較高的表達(dá)，而在白色和綠色棉花中表達(dá)量較低。此研究表明類(lèi)黃酮途徑參與了彩色棉纖維中色素的合成。

為了研究DFR基因及類(lèi)黃酮途徑在棕色棉纖維色素形成中的作用，本研究根據(jù)GenBank上登錄的棕色棉品種T586的DFR基因序列［5]設(shè)計(jì)引物，以新彩棉6號(hào)（XC-6）纖維的RNA以及DNA為模板克隆得到GhDFR基因的CDS全長(zhǎng)編碼序列及帶有內(nèi)含子的基因組序列。通過(guò)生物信息學(xué)的方法對(duì)GhDFR的氨基酸序列組成成分、理化性質(zhì)、疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位、結(jié)構(gòu)域等方面進(jìn)行較為全面的分析。此項(xiàng)研究為探究DFR基因在棕色棉色素形成過(guò)程中的可能的功能及作用機(jī)制奠定前期理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為后期利用基因工程的技術(shù)對(duì)彩色棉的色彩進(jìn)行遺傳改良提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 選擇棕色棉品種新彩棉6號(hào)（XC-6）作為試驗(yàn)材料，2012年4月種植于新疆天然彩色棉花研究所實(shí)驗(yàn)基地，取開(kāi)花后（DPA）16 d的纖維。所取新鮮材料迅速放入液氮中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 菌種、質(zhì)粒與試劑 大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存；克隆載體pGEM-T Easy購(gòu)自Promega；瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒購(gòu)自天根公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA分子量Marker、ExTaqDNA聚合酶等購(gòu)自TaKaRa。引物合成及測(cè)序由上海生工生物工程公司完成。其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA、總RNA提取及cDNA第一鏈合成 基因組DNA的提取采用CTAB法［9]，總RNA提取方法參照熱硼酸/蛋白酶K法［10-12]，總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，質(zhì)量完好的RNA置-80℃保存?zhèn)溆?。DNaseⅠ消化殘留的DNA后，參照TaKaRa公司提供的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)以O(shè)ligo（dT）18為引物，使用M-MLV、37℃ 溫浴2 h，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得cDNA第一條鏈。

1.2.2GhDFR基因的克隆與測(cè)序 根據(jù)GenBank登錄的序列EF187441，利用Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，F(xiàn)P（Forward Primer）：5'-GGTCTTTCTTTATGCCAAC-TG-3'，RP（Reverse Primer）：5'-GACATGGGTAGGCACTCAATT-3'。PCR的擴(kuò)增體系為20 μL，包括10×PCR Buffer 2 μL，0.2 mmol/L dNTP，1.5 mmol/L MgCl2，模板cDNA（或基因組DNA）約50 ng，上下游引物各0.2 μmol/L，1 U Ex Taq DNA聚合酶（寶生物）。擴(kuò)增程序：95℃ 預(yù)變性3 min；94℃ 45 s，58℃ 45 s，72℃ 1.5 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用天根公司的膠回收試劑盒回收DNA，連入Promega 公司pGEM-T Easy載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將鑒定正確的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送上海生工公司測(cè)序。

1.2.3 引物的設(shè)計(jì)與生物信息學(xué)軟件 應(yīng)用ExPASy工具包（http：//expasy.org/tools/）中的ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）在線分析GhDFR氨基酸序列的組成和理化性質(zhì)。利用SignalP 3.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線分析蛋白質(zhì)的信號(hào)肽。ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）在線預(yù)測(cè)DFR蛋白的親水性/ 疏水性。應(yīng)用PSORTII Prediction（http：//psort.hgc.jp/form2.html）進(jìn)行亞細(xì)胞定位。SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page =npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)元件。序列相似性搜索用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blast完成（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）。DFR核苷酸和氨基酸序列的同源性多重比對(duì)用DNAMAN完成。Pfam 27.0（http：//pfam.sanger.ac.uk/）和NCBI的CDD（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi）在線預(yù)測(cè)DFR蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。利用Clustal X軟件（http：//bips.u-strasbg.fr/fr/Documentation/ClustalX/）對(duì)基因組序列進(jìn)行相似性比較，MEGA軟件（http：//www.megasoftware.net/）進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果

2.1 GhDFR基因的克隆與測(cè)序

核苷酸序列的測(cè)定結(jié)果如圖1，圖2，所克隆獲得的GhDFR基因組序列為1 620 bp，CDS序列的長(zhǎng)度為1 068 bp，編碼355個(gè)氨基酸。序列結(jié)果已經(jīng)提交GenBank，登錄號(hào)為：KF749429。根據(jù)核苷酸序列測(cè)定結(jié)果，利用生物信息學(xué)與比較基因組學(xué)的方法，推測(cè)出該基因基因組序列有5個(gè)內(nèi)含子和6個(gè)外顯子，5個(gè)內(nèi)含子以GT開(kāi)始并以AG結(jié)尾的序列，而且3'端富含嘧啶核苷酸，基本符合內(nèi)含子的類(lèi)型。新彩棉6號(hào)中克隆的GhDFR基因CDS編碼區(qū)與克隆自彩棉品種T586的GhDFR基因EF187441的CDS編碼序列完全相同，與GenBank中已經(jīng)登錄的FJ713480序列相比，其編碼區(qū)在5'端多出15個(gè)氨基酸編碼序列。內(nèi)含子可能是提高基因表達(dá)的一種原因，通過(guò)分析基因內(nèi)部?jī)?nèi)含子的組成，對(duì)理解基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制具有非常重要的意義。內(nèi)含子還可以作為來(lái)研究物種進(jìn)化的分子標(biāo)記。

2.2 GhDFR編碼產(chǎn)物與其他植物GhDFR同源性比較

利用DNAMAN軟件將得到的GhDFR基因所編碼的氨基酸序列與GenBank上公布的其他物種DFR的氨基酸序列完全比對(duì)，結(jié)果如圖3，發(fā)現(xiàn)該基因與圓葉葡萄VrDFR、毛果楊PtrDFR、葡萄VvDFR、天竺葵PzDFR、槿麻T(mén)cDFR、芍藥PlDFR、甜櫻桃PaDFR的氨基酸同源性較高，分別為80.8%、80.2%、79.6%、80.6%、79.0%、79.3%、76.9%，與擬南芥DFR同源性為72.7%。在GhDFR 蛋白質(zhì)序列N端存在21個(gè)氨基酸殘基的 NADP（H）結(jié)合位點(diǎn)“VTGGSGFIGSWLIKLLLERGY”，該序列在不同植物中具有一定的保守性，另外還存在一個(gè)由26個(gè)氨基酸構(gòu)成的底物特異性結(jié)合保守區(qū)域“TIDVAEQQKPCYDETCWSDLEFIQAK”，決定其底物的特異性［13，14]。NCBI的BLAST比對(duì)結(jié)果表明，DFR 蛋白屬于NADB-Rossmann超基因家族（NADBRossmann super-family）。

2.3 GhDFR氨基酸序列的理化性質(zhì)

ProtParam分析得出：GhDFR蛋白的理論分子量為39.65 kD，等電點(diǎn)（pI）為5.67，其中Lys最多，有32個(gè)，占9.0%。其次為L(zhǎng)eu，有29個(gè)，占8.2%。而Tyr較少只有7個(gè)，占2.0%。最少的是Trp僅有5個(gè)，占1.4%。其中帶負(fù)電荷的氨基酸有48個(gè)，帶正電荷的氨基酸有40個(gè)。不穩(wěn)定指數(shù)為35.88，是一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的蛋白。脂肪族氨基酸指數(shù)較高達(dá)到了85.15，這是因?yàn)镚hDFR基因的蛋白含有較多的Leu?？偟钠骄H水值Grand average of hydropathicity（GRAVY）為-0.168，是親水性蛋白。

圖1 GhDFR基因的全長(zhǎng)序列及推斷的氨基酸序列

圖2 GhDFR內(nèi)含子及外顯子分析

2.4 GhDFR的親水性/疏水性、亞細(xì)胞定位

蛋白質(zhì)親水性/ 疏水性的預(yù)測(cè)是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)以及功能域劃分的重要的過(guò)程。ProtScale的分析結(jié)果（圖4）表明GhDFR蛋白的親水性/ 疏水性的最大值為208位的脯氨酸2.378，最小值為265位的丙氨酸-2.478，親水/ 疏水趨勢(shì)圖形也基本一致，結(jié)果如圖4所示。總體而言，與前面所有氨基酸序列理化性質(zhì)預(yù)測(cè)的結(jié)果一致，GhDFR蛋白屬于親水性蛋白。

圖3 GhDFR與其他物種DFR基因編碼的氨基酸序列的多重比對(duì)

SignalP的分析結(jié)果（圖5）表明GhDFR蛋白不具有信號(hào)肽，說(shuō)明GhDFR蛋白不是一個(gè)分泌蛋白。

PSORT Ⅱ Prediction 對(duì)GhDFR蛋白亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明，GhDFR定位于細(xì)胞質(zhì)的可能性最高，為43.5%；其次為線粒體的26.1%，細(xì)胞核8.7%，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)8.7%，最低為分泌囊泡、高爾基體和過(guò)氧化物酶體，可能性均為4.3%。

2.5 GhDFR蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)

SOPMA對(duì)GhDFR進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示（圖6），共有α-螺旋（Alpha helix）133處，占二級(jí)結(jié)構(gòu)的37.46 %，延伸鏈（Extended strand）50處，占總二級(jí)結(jié)構(gòu)的14.08%，β-轉(zhuǎn)角（Beta turn）26處，占二級(jí)結(jié)構(gòu)的7.32%，無(wú)規(guī)卷曲（Random coil）146處，占二級(jí)結(jié)構(gòu)的41.13%。該蛋白中α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的主要結(jié)構(gòu)元件，分散于整個(gè)蛋白質(zhì)中。

圖4 GhDFR蛋白的親水性/疏水性分析

圖5 GhDFR蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)執(zhí)行功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。Pfam27.0預(yù)測(cè)GhDFR蛋白的結(jié)構(gòu)域的結(jié)果（圖7）表明，GhDFR蛋白只有一個(gè)明顯的結(jié)構(gòu)域，即NAD dependent epimerase/dehydratase family，與NCBI的CDD在線預(yù)測(cè)結(jié)果一樣，都證實(shí)了GhDFR 屬于NADB-Rossmann superfamily。

2.6 GhDFR蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

應(yīng)用Clustalx1.83軟件將編碼的氨基酸序列及從GenBank獲取的其他植物的DFR基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，然后利用 MEGA5.2軟件按鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖8所示，途中所示數(shù)字為相對(duì)遺傳距離。GhDFR與天竺葵PzDFR蛋白以及芍藥PlDFR的親緣關(guān)系最近，可以聚為一類(lèi)，與擬南芥AtDFR親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討論

圖6 GhDFR蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖

圖7 GhDFR 蛋白的結(jié)構(gòu)域分析

圖8 GhDFR與其他高等植物 DFR蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析

花色苷合成的類(lèi)黃酮途徑是研究的最為清楚的植物次生代謝途徑之一［7]，類(lèi)黃酮類(lèi)化合物是植物花青素的主要成分，是花卉、果實(shí)、種皮重要的成色物質(zhì)。DFR即二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase）屬于細(xì)胞色素P450家族，是類(lèi)黃酮/花青素生物合成途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶，在類(lèi)黃酮途徑中，DFR催化二氫黃酮醇，如二氫堪非醇（dihydrokaempferol，DHK）、二氫槲皮素（dihydroquercetin，DHQ）和二氫楊梅素（dihydromyricetin，DHM），在C4位發(fā)生立體特異的還原反應(yīng)，分別生成無(wú)色天竺葵素、無(wú)色矢車(chē)菊素和無(wú)色飛燕草素（翠雀素），這些產(chǎn)物都是合成有色的花色苷類(lèi)物質(zhì)的前體物質(zhì)［7，13]。從O’Reilly第一次克隆得到DFR基因開(kāi)始，利用同源克隆的方法分別在矮牽牛（Petunia hybrida）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、金魚(yú)草（Antirrhinum majus）、番茄（Lycopersicon esculentum）、康乃馨（Dianthus caryophyllus）、葡萄（Vitis vinifera）、草莓（Fragaria ananassa）、玉米（Zea mays）等物種中都已經(jīng)克隆出來(lái)，其分子特征和調(diào)控機(jī)制已在很多植物中得到深入研究，研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自不同物種的DFR有非常高的同源性，但是不同植物的DFR結(jié)合底物的特異性有所不同。在矮牽牛中，DFR優(yōu)先轉(zhuǎn)化DHM生成無(wú)色翠雀素，其次是DHQ，不能轉(zhuǎn)化DHK，因此矮牽牛中缺乏天竺葵色素，將玉米的DFR基因A1轉(zhuǎn)化矮牽牛，A1能夠催化DHK生成無(wú)色天竺葵素，進(jìn)而在花青素合成酶（ANS）的作用下生成桔紅色的天竺葵素，矮牽?；ㄉ傻t色變?yōu)榻奂t色［14]。關(guān)于底物選擇特異性的分子機(jī)理，Beld等［15]根據(jù)對(duì)矮牽牛DFR的研究提出了一個(gè)由26個(gè)氨基酸組成的底物特異性結(jié)合區(qū)域，該區(qū)域的氨基酸序列決定DFR對(duì)底物的特異性結(jié)合。隨后，Johnson等［16]利用DFR單氨基酸突變體證明改變底物特異性結(jié)合區(qū)域的某些氨基酸能夠改變矮牽牛DFR的底物特異性，而有些位置的氨基酸具有高度保守性，并確定了與底物特異性直接相關(guān)的幾個(gè)氨基酸殘基，如133位、134位、142位和145位，其中第134位氨基酸直接決定底物特異性，矮牽牛DFR第134位是Asp，其最佳底物為DHM，對(duì)DHQ的還原效率很低，不能以DHK為底物生成天竺葵素，其他134位是Asn的植物都能以DHK為底物。將矮牽牛134位的Asp替換為L(zhǎng)eu，則DFR從只以DHQ和DHM為底物變?yōu)閮?yōu)先轉(zhuǎn)化DHK，而不能有效轉(zhuǎn)化DHM。根據(jù)DFR蛋白該相應(yīng)位置氨基酸殘基不同，發(fā)現(xiàn)植物DFR分為幾種類(lèi)型，即Asn型、Asp型及非Asn/Asp型，在植物中Asn型DFR分布廣泛，單子葉植物都是Asn型DFR，而Asp型DFR只分布在矮牽牛等部分雙子葉植物中。此外，只有少數(shù)植物含有非Asn/Asp型。根據(jù)蛋白比對(duì)結(jié)果，本研究克隆得到的棉花GhDFR屬于第二種類(lèi)型（即Asp類(lèi)型），推測(cè)其不能以DHK為底物生成無(wú)色天竺葵素，但目前還沒(méi)有關(guān)于棉花中花青素組成成分的報(bào)道。

內(nèi)含子是在轉(zhuǎn)錄后的加工中，從最初的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物除去的內(nèi)部的核苷酸序列。內(nèi)含子可能含有“舊碼”，就是在進(jìn)化過(guò)程中喪失功能的基因部分。正因?yàn)閮?nèi)含子對(duì)翻譯產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)無(wú)意義，它比外顯子累積有更多的突變。但越來(lái)越多的試驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)含子在基因的表達(dá)與調(diào)控中起著非常大的作用。擬南芥、矮牽牛和金魚(yú)草等雙子葉植物的DFR基因都由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成，而且它們的內(nèi)含子位置都大致相同［17]。本研究從棉花中得到的GhDFR基因的DNA序列也是由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成，說(shuō)明該基因在進(jìn)化上具有一定的保守性，這類(lèi)基因可能具有較為重要的功能。

目前關(guān)于DFR在類(lèi)黃酮/花青素合成途徑中的作用及相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面已有較多研究，影響DFR基因表達(dá)的因素可分為兩類(lèi)：內(nèi)部因素（各種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，如MYB、bHLH和WD40蛋白等）和外界因素（如光照、溫度等環(huán)境誘導(dǎo)因素），但目前對(duì)彩色棉類(lèi)黃酮/花青素相關(guān)方面的研究還很少。本研究從彩棉D(zhuǎn)FR基因入手，利用生物信息學(xué)手段對(duì)棉花GhDFR基因的相關(guān)蛋白性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行了初步研究，為將來(lái)研究彩色棉類(lèi)黃酮/花青素生物合成以及利用基因工程技術(shù)進(jìn)行彩棉種質(zhì)資源的創(chuàng)新奠定了重要基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

從棕色棉中克隆到GhDFR基因的全長(zhǎng)編碼序列及內(nèi)含子序列，該基因含有6個(gè)外顯子，5個(gè)內(nèi)含子，其編碼的氨基酸序列包含具有高度保守性的NADP（H）的結(jié)合位點(diǎn)以及底物特異性結(jié)合位點(diǎn)，系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明其與天竺葵、芍藥的DFR親緣關(guān)系較近。

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