Cell-SELEX技術(shù)研究進(jìn)展

趙仲麟 李燕 袁超

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，鄭州 450002；2.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450002）

適配子是從組合核酸庫(kù)中篩選到的、與靶分子具有高度親和性的分子［1]。與抗體類似，適配子對(duì)目標(biāo)分子具有高度親和性和特異性。然而適配子還有很多額外的優(yōu)點(diǎn)，如可以抵抗還原條件和熱變性等。典型的適配子一般少于40個(gè)核苷酸，同時(shí)還要易于化學(xué)合成。另外，適配子可以在一些生理?xiàng)l件下，可通過(guò)反義寡核苷酸雜交使其失活。因此，可以用于設(shè)計(jì)解毒劑。適配子在分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用［2]。適配子通過(guò)SELEX技術(shù)，即指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)，經(jīng)反復(fù)的放大篩選得到的［3，4]。這個(gè)過(guò)程中，單鏈核酸庫(kù)與靶分子孵育，單鏈核酸包括DNA、RNA和修飾的核酸，庫(kù)由30-100個(gè)核苷酸的隨機(jī)序列組成，約含1014-1015變異體。與目標(biāo)有結(jié)合活性的變異體將被回收，然后通過(guò)RT-PCR進(jìn)行文庫(kù)富集擴(kuò)增，然后利用富集的PCR產(chǎn)物，通過(guò)模板鏈除去或體外轉(zhuǎn)錄重建單鏈庫(kù)。該過(guò)程將重復(fù)幾輪至20輪不等，最終找到目標(biāo)適配子。

SELEX程序最早于1990年建立［3，4]，適配子可與多種目標(biāo)作用，包括可與大分子蛋白作用的小分子化合物。SELEX過(guò)程中使用高純度的目標(biāo)分子，一種理論研究認(rèn)為復(fù)合目標(biāo)也可以用于尋找特異的適配子［5]。這種觀點(diǎn)已經(jīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到了確認(rèn)［6，7]。如果與負(fù)選擇相結(jié)合進(jìn)行識(shí)別，那些可與非目標(biāo)結(jié)合的變異體可被除去，得到目標(biāo)特異的適配子（圖1）。如果SELEX過(guò)程使用活細(xì)胞，則可對(duì)活細(xì)胞的變種進(jìn)行檢驗(yàn)，稱為Cell-SELEX 技術(shù)。本文對(duì)Cell-SELEX 技術(shù)的發(fā)展進(jìn)行綜述。

圖1 Cell-SELEX

1 Cell-SELEX用于活病原微生物適配子篩選

適配子可以用于開發(fā)診斷試劑和藥物，而且活的病原微生物變種也可以作為Cell-SELEX技術(shù)的操作對(duì)象［7]。最早Cell-SELEX技術(shù)的應(yīng)用例子是使用活病原微生物，非洲布氏錐蟲Trypanosoma brucei。T.brucei是單細(xì)胞原生動(dòng)物寄生蟲，有兩個(gè)寄主，昆蟲和哺乳動(dòng)物寄主。寄生蟲可以引起非洲昏睡病，一種人類慢性病和牲畜那加那病。該寄生蟲的一個(gè)特點(diǎn)是其表面具有被稱為可變表面糖蛋白（VSG）構(gòu)成的保護(hù)殼，可逃脫宿主的免疫系統(tǒng)。Homann等［8]利用SELEX技術(shù)，將血液中活的布氏錐蟲作為目標(biāo)，篩選到了幾個(gè)與寄生蟲具有高度親和力的RNA適配子。同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)得到的適配子能結(jié)合到VSG變種上。他們利用氟代嘧啶修飾的RNA庫(kù)，通過(guò)SELEX技術(shù)與VSG變異體VSG117作用，然后再與活布氏錐蟲穩(wěn)定表達(dá)的VSG變異體作用。經(jīng)過(guò)若干輪SELEX后，純化得到一個(gè)不同的變異體VSG221，最后再與寄生蟲作用。篩選得到的適配子顯示出了與變異體高親和力。

Ulrich等［9]使用SELEX策略，以另一種活的寄生蟲熱帶南美洲錐蟲Trypanosoma cruzi為目標(biāo)篩選適配子。T. cruzi可引起chagas巨食管癥，是一種人類的致命疾病?，F(xiàn)已知寄生蟲表面與宿主細(xì)胞基質(zhì)分子進(jìn)行相互作用，這恰巧與寄生蟲侵染相關(guān)。研究者想找到能與基質(zhì)分子競(jìng)爭(zhēng)，并可與寄生蟲結(jié)合的適配子。他們將T. cruzi與RNA庫(kù)孵育，然后通過(guò)添加過(guò)量的基質(zhì)分子，如纖維連接蛋白、粘連蛋白、硫酸乙酰肝素、血管內(nèi)皮抑制因子等，來(lái)特異的洗脫目的適配子。接下來(lái)他們使用短膜蟲期的寄生蟲，這個(gè)階段屬于非傳染階段，利用負(fù)篩選除去不需要的適配子。最終成功的得到了能與目標(biāo)寄生蟲作用的適配子，最后通過(guò)體外侵染試驗(yàn)證實(shí)這些適配子具有抑制活性。

2 癌細(xì)胞特異性適配子篩選

由于適配子可以識(shí)別多種特定的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，因此，可以將其作為診斷和基礎(chǔ)研究的分子探針。癌細(xì)胞是最廣泛的檢測(cè)目標(biāo)，目前已發(fā)現(xiàn)多種適配子可以與癌細(xì)胞進(jìn)行相互作用［10，11]。通過(guò)熒光標(biāo)記，適配子可以作為癌癥檢測(cè)探針。Shangguan等［12]報(bào)道了一系列DNA適配子，可作為分子探針用于癌癥研究。他們使用人急性淋巴細(xì)胞白血病T淋巴細(xì)胞（CCRF-CEM）和人源Burkitt淋巴瘤B細(xì)胞系分別進(jìn)行正負(fù)篩選。使用幾種癌細(xì)胞和經(jīng)蛋白酶處理的CCRF-CEM細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合分析試驗(yàn)，結(jié)果顯示每種適配子只識(shí)別一種特定的細(xì)胞表面分子。目前，已通過(guò)Cell-SELEX技術(shù)篩選到多種用于檢測(cè)癌細(xì)胞的適配子，其中包括淋巴細(xì)胞白血癥、粒細(xì)胞性白血病、肝癌、小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌。這些適配子對(duì)靶細(xì)胞都具有較高的特異性［10]，這些結(jié)果均表明在不知道任何細(xì)胞表面蛋白種類和數(shù)量的情況下，也可通過(guò)該技術(shù)篩選適配子。

Cell-SELEX技術(shù)也用于體細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞研究中［13]。Iwagawa等［14]利用RNA庫(kù)，以胚胎干細(xì)胞為目標(biāo)進(jìn)行篩選，得到的適配子能與胚胎干細(xì)胞高效結(jié)合。此外，鼠胚胎干細(xì)胞的分化過(guò)程也可以通過(guò)熒光標(biāo)記的適配子進(jìn)行監(jiān)控。干細(xì)胞研究對(duì)于再生醫(yī)學(xué)和發(fā)育生物學(xué)非常重要，因此開發(fā)新的、可用于干細(xì)胞研究的分子探針是及其必要的。

此外，Cell-SELEX技術(shù)也可以篩選一些能與病毒感染的細(xì)胞進(jìn)行特異結(jié)合的DNA適配子。病毒感染后，宿主細(xì)胞表面被病毒蛋白所修飾，這些變化正好可作為病毒特異性目標(biāo)，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性分子探針來(lái)識(shí)別被病毒感染的細(xì)胞。Tang等［15]通過(guò)Cell-SELEX方法，以牛痘病毒感染的腺癌上皮細(xì)胞A549為目標(biāo)，結(jié)合負(fù)篩選過(guò)程，成功得到特異性DNA適配子。分離得到的適配子可結(jié)合到幾種被病毒感染的細(xì)胞系，證實(shí)適配子能識(shí)別宿主細(xì)胞表面的病毒蛋白。

3 生物標(biāo)記物篩選

Cell-SELEX可以用于靶細(xì)胞新生物標(biāo)記物的識(shí)別。Blank等［16]報(bào)道利用Cell-SELEX技術(shù)進(jìn)行大鼠YPEN-1內(nèi)皮細(xì)胞和小鼠N9噬神經(jīng)細(xì)胞的正負(fù)篩選。許多篩選到的適配子能結(jié)合到膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的病理性微管上，其中一個(gè)適配子只在實(shí)體瘤生長(zhǎng)區(qū)域顯示出與脈管非常強(qiáng)的結(jié)合力，然后他們將該適配子的靶蛋白通過(guò)質(zhì)量指紋圖譜和多肽測(cè)序進(jìn)行分析，最終發(fā)現(xiàn)該蛋白是內(nèi)皮分化的調(diào)控蛋白，在腫瘤的微血管中過(guò)表達(dá)。Berezovski等［17]發(fā)展出多種系統(tǒng)程序用于目標(biāo)細(xì)胞的新生物標(biāo)記物的識(shí)別，他們將該程序命名為 AptaBiD，包括3步：首先，通過(guò)Cell-SELEX技術(shù)構(gòu)建適配子庫(kù)；接下來(lái)利用適配子庫(kù)的結(jié)合活性，親和分離候選的生物標(biāo)記物。最后，通過(guò)肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定分離到的候選蛋白。Shoji等［18]構(gòu)建了DNA適配子庫(kù)，利用Cell-SELEX技術(shù)作用于未成熟和成熟的樹突細(xì)胞，使用生物素標(biāo)記的DNA庫(kù)，從目標(biāo)細(xì)胞裂解液中分離候選的生物標(biāo)記物，通過(guò)LC-MS分析經(jīng)胰蛋白酶處理的候選蛋白，最終分別從未成熟的細(xì)胞中得到6個(gè)，從成熟的細(xì)胞中得到3個(gè)生物標(biāo)記物，其中6個(gè)是以前未知的生物標(biāo)記物。

4 基于SELEX技術(shù)的細(xì)胞攝取

Cell-SELEX 篩選得到的適配子不僅可以結(jié)合靶細(xì)胞，還可以進(jìn)行胞內(nèi)運(yùn)輸。例如從活的T. brucei細(xì)胞篩選的一個(gè)適配子能夠通過(guò)胞吞作用迅速內(nèi)化，通過(guò)小泡輸送轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體［7，10]。適配子這種內(nèi)化特性可以使其進(jìn)行胞內(nèi)的藥物傳遞［19]，利用適配子介導(dǎo)的短RNA干擾已被試驗(yàn)證實(shí)［20，21]。為產(chǎn)生能介導(dǎo)向目標(biāo)特異細(xì)胞進(jìn)行胞內(nèi)藥物運(yùn)輸?shù)倪m配子，Wu等［22]開發(fā)出一套獨(dú)特的SELEX策略，正是基于胞內(nèi)運(yùn)輸。他們利用一個(gè)隨機(jī)庫(kù)與靶細(xì)胞孵育，通過(guò)嚴(yán)苛條件（0.2 mol/L glycine-HCl，pH4.0）洗脫，而后將這些洗脫的變異體合并，通過(guò)加入蛋白酶和清洗劑細(xì)胞裂解，進(jìn)行選擇性回收。應(yīng)用這種方法得到的DNA基元可以高效的運(yùn)輸?shù)饺寺粤馨图?xì)胞白血病B細(xì)胞［23]。相同的策略也被用于生產(chǎn)tRNA衍生物，可被分離的線粒體吸收［24]。這些RNA基元可以被構(gòu)建成與線粒體疾病治療相關(guān)的新載體。

對(duì)于用于胞內(nèi)藥物投遞的適配子，不僅要細(xì)胞攝取效率高，而且對(duì)于其吸收、分布、代謝和排泄等藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)有一定的限制。Mi等［25]發(fā)展出基于SELEX的細(xì)胞攝取，用于活腫瘤動(dòng)物模型的體內(nèi)篩選。他們將隨機(jī)的RNA庫(kù)靜脈注射進(jìn)肝癌移植小鼠中，循環(huán)20 min后，收集肝癌細(xì)胞后提取腫瘤細(xì)胞中的變異體，然后進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)而進(jìn)行下一輪的注射。發(fā)現(xiàn)一個(gè)變異體對(duì)于腫瘤細(xì)胞的粗提物顯示出增強(qiáng)的親和力，而對(duì)正常的結(jié)腸細(xì)胞無(wú)親和性。然后他們將熒光標(biāo)記的適配子進(jìn)行尾部靜脈注射發(fā)現(xiàn)，適配子只定植于肝癌細(xì)胞，從而證實(shí)了該程序的可行性。最終的肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定分析結(jié)果顯示，得到的適配子能夠識(shí)別RNA解旋酶p68。

5 給藥系統(tǒng)開發(fā)

細(xì)胞結(jié)合適配子可以用于研發(fā)目標(biāo)細(xì)胞特異性分子探針和進(jìn)行藥物投遞系統(tǒng)的開發(fā)。Douglas等［26]使用DNA適配子進(jìn)行藥物給藥研究。他們將藥物分子，主要是可與細(xì)胞表面結(jié)合的抗體，包裹在一個(gè)三維DNA紙盒（DNA origami box）中，適配子與其反義的DNA寡聚物雜交使盒子關(guān)閉。當(dāng)細(xì)胞上的目標(biāo)分子與適配子結(jié)合后，適配子構(gòu)象改變使雜交解鏈，從而打開盒子，暴露出藥物。只有當(dāng)細(xì)胞展示適配子的靶分子時(shí)，藥物才會(huì)暴露出來(lái)，這是一種高度特異性給藥系統(tǒng)。通過(guò)Cell-SELEX 技術(shù)得到的適配子在該系統(tǒng)中作為開關(guān)而存在。

另外，與細(xì)胞結(jié)合適配子也可用于開發(fā)細(xì)胞操作系統(tǒng)。例如，適配子固定的樹脂可被用于特定目標(biāo)細(xì)胞的回收［27，28]。利用適配子的優(yōu)點(diǎn)是它們可以在溫和條件下，如反義雜交和二價(jià)陽(yáng)離子的螯合作用下進(jìn)行可逆失活。因此，可以在溫和條件下使用樹脂反復(fù)分離結(jié)合的細(xì)胞。同時(shí)，細(xì)胞特異性適配子還能夠用于特定細(xì)胞的粘附［29，30]。Schroeder等［31]開發(fā)出一個(gè)活細(xì)胞芯片，由肽配體和DNA芯片組成。靶細(xì)胞結(jié)合的肽配體與DNA寡聚物連接，通過(guò)雜交排列在DNA芯片上，當(dāng)細(xì)胞加入芯片上后，靶細(xì)胞可通過(guò)與排列的肽配體親和附著在特定位置上。Gartner和Bertozzi 將多種類型的細(xì)胞進(jìn)行空間排布，通過(guò)DNA雜交固定到細(xì)胞表面，這種細(xì)胞操作系統(tǒng)可用于細(xì)胞通訊研究［32]。

6 展望

適配子憑借其獨(dú)特的性質(zhì)已應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中，利用Cell-SELEX技術(shù)，篩選得到的可與細(xì)胞結(jié)合的適配子應(yīng)用程序?yàn)槿藗儼l(fā)展新的醫(yī)藥和生物技術(shù)打開了一扇新的大門，其作用是傳統(tǒng)的生物親和物抗體所不能實(shí)現(xiàn)的。Cell-SELEX技術(shù)提供一種高效的生產(chǎn)大量適配子的方法，這些適配子可作為探針特異性錨定各種癌細(xì)胞。適配子已用于癌細(xì)胞生物學(xué)研究的多個(gè)領(lǐng)域中，未來(lái)的研究也會(huì)演化更多的研究方向，如位點(diǎn)特異性化學(xué)修飾可使適配子與金納米顆?；蛄孔狱c(diǎn)交聯(lián)，使用比色或熒光的方法檢測(cè)癌細(xì)胞。由于具有較高的靈敏度，因此可以用于癌癥的早期診斷。同時(shí)，通過(guò)適配子對(duì)癌細(xì)胞的高度特異性，可以用于藥物靶向試劑的研發(fā)，從而得到低毒、高效的治療性藥物。另外，使用Cell-SELEX篩選的適配子可以釣取目的蛋白，用于新癌癥生物學(xué)標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)。同時(shí)，也可作為調(diào)控子抑制或激活某些信號(hào)途徑從而進(jìn)行癌癥發(fā)育研究。這種基于適配子的化學(xué)生物學(xué)方法也可以用于其他疾病的研究。不同的適配子可以特異的與各種不同類型的疾病細(xì)胞結(jié)合，未來(lái)的個(gè)性化用藥將成為現(xiàn)實(shí)。

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