煙酰胺超載對大鼠血漿內(nèi)甲基化反應水平的影響

倫永志，孫 杰，駱 寧，姚曉坤，周士勝

（1. 大連大學 醫(yī)學院 遼寧省高校生物物理學重點實驗室，遼寧 大連 116622；2. 大連港醫(yī)院 檢驗科, 遼寧 大連 116013）

代謝綜合征指一組多種代謝紊亂伴隨發(fā)生的集群，包括肥胖、胰島素抵抗、高血壓和血脂異常等，是2 型糖尿病和心血管疾病的主要危險因素[1]。近年來，代謝綜合征的發(fā)病率不僅在成年人群中呈現(xiàn)指數(shù)增長，在青少年、兒童群體中也增長顯著[1]。雖然關于代謝綜合征發(fā)生的精確機制仍不清楚，但是逐漸增多的證據(jù)提示，氧化應激[2]和甲基化代謝紊亂，如改變的血漿甲基供體[3]，同型半胱氨酸[4]和DNA 甲基化樣式[5]在代謝綜合征的形成過程中發(fā)揮重要作用。因此，從氧化應激和不正常甲基化樣式方面尋找代謝綜合征的成因，將有助于闡明該病的病理機制。

尼亞新（維生素B3，煙酸或煙酰胺）作為一種主要的合成營養(yǎng)素，是NAD 和NADP 的前體物質(zhì)[6]，因此煙酰胺的代謝平衡對于維持細胞的正常功能非常重要。過量的煙酰胺攝入能夠觸發(fā)氧化應激和胰島素抵抗[7,8]。在煙酰胺負荷實驗中已證實，煙酰胺攝入可以顯著抑制兒茶酚胺的降解[9]。由此我們推測，高煙酰胺攝入也將影響機體其他甲基化反應。為了驗證以上假設，本實驗進行了長期煙酰胺大鼠喂養(yǎng)實驗，以觀察煙酰胺喂養(yǎng)對機體甲基化反應的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康，雄性SD 大鼠，5 周齡，由大連醫(yī)科大學動物中心提供。實驗動物置于室溫和光照可控的飼養(yǎng)室內(nèi)（22±2°C，12/12 h: 6:00 a.m.到6:00 p.m.），自由進食水。

1.2 主要試劑與儀器

煙酰胺（Sigma，美國）；N1-甲基煙酰胺（Osaka，日本）；N1-ethylnicotinamide，2Py（見文獻[10,11]合成）；同型半胱氨酸（Sigma，美國）；甜菜堿（Sigma，美國）；Hypersil ODS C18 column（Thermo，美國）；SupelcosilTMLC-SCX column（Supelco，美國）；Waters 470 fluorescence detector（Milford，美國）；UV3000 detector（Thermo，美國）；Bio-Rad model 550-microplate reader（Bio-Rad，美國）。

1.3 動物飼養(yǎng)及組織樣本采集

實驗大鼠分為三組：對照組和兩個煙酰胺負荷組，兩個煙酰胺負荷組的鼠糧中分別加入煙酰胺1 或4 g /kg。喂養(yǎng)時間：20 周；飼養(yǎng)期間記錄每天飲食量，每周監(jiān)測體重、血糖，每4 周進行一次糖耐量實驗；煙酰胺負荷結束，20 %烏拉坦麻醉，后眼眶靜脈叢采血，EDTA 抗凝后離心收集血漿，-80°C 保存。

1.4 血漿學指標測定

1.4.1 煙酰胺、N1-甲基煙酰胺、同型半胱氨酸、甜菜堿測定

樣品經(jīng)預處理后，加入標準品作為內(nèi)標進色譜分析。

煙酰胺、N1-甲基煙酰胺的流動相配置及樣品檢測：10 mM 庚烷磺酸鈉，50 mM 三乙胺水溶液（pH 3.20），乙腈（78:22 v/v），0.45 μm 微孔濾膜過濾之后，超聲脫氣30 min；流速：1.0 mL/min；色譜柱：Hypersil ODS C18 column；進樣量：20 μL；熒光檢測器激發(fā)波長為366 nm，發(fā)射波長為418 nm。

同型半胱氨酸的流動相配置和樣品檢測：含30 mL/L 甲醇的0.1 mol/L 醋酸鹽緩沖液（pH 4.6），0.45 μm 微孔濾膜過濾后，超聲脫氣30 min；流速0.8 mL/min；色譜柱：Hypersil ODS C18 column；進樣量：20 μL；熒光檢測器激發(fā)波長為385 nm，發(fā)射波長為515 nm。

甜菜堿的流動相配置和樣品檢測：22 mmol/L 膽堿溶于100 mL/L 雙蒸水，加入900 mL/L 乙腈，0.45 μm 微孔濾膜過濾后，超聲脫氣30 min；流速1.2 mL/min；色譜柱：SupelcosilTMLC-SCX column；進樣量：20 μL；紫外檢測器檢測波長為254 nm。

1.4.2 膽堿測定

膽堿測定按照美國 Biovision 公司生產(chǎn)的Choline/Acetylcholine Quantification kit 試劑盒標準步驟完成，反應生成物于Bio-Rad model 550 酶標儀檢測，檢測波長570 nm。

1.5 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x-±SD）表示，組間采用t檢驗，多組間采用單因素方差分析，P<0.05 顯著性差異。

2 結果

煙酰胺主要利用S-腺苷蛋氨酸介導的甲基化反應，生成N1-甲基煙酰胺進行代謝清除。如圖1 所示，大鼠煙酰胺超載的情況下，血漿煙酰胺（圖1A），N1-甲基煙酰胺（圖1B）和膽堿水平（圖1D）升高 ，血漿甜菜堿水平顯著下降（圖1E）。血漿同型半胱氨酸水平在1 g 煙酰胺喂養(yǎng)的狀況下略有下降，4 g 煙酰胺喂養(yǎng)的情況下略有上升（圖1C），這些結果均說明，高煙酰胺攝入所誘發(fā)的甲基耗竭，影響了機體的甲基代謝平衡。

圖1 尼克酰胺負荷后，血漿中煙酰胺、N1-甲基煙酰胺、同型半胱氨酸、膽堿與甜菜堿水平

棒狀圖：mean±SD；NM:尼克酰胺.；*P<0.05，**P<0.001 vs Control

3 討論

逐漸增多的證據(jù)顯示，氧化應激[2]和異常的甲基化狀態(tài)[3-5]在代謝綜合征的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色?？梢韵胂蟮氖?，飲食甲基供體的平衡（缺乏或者過量）將對機體甲基化反應產(chǎn)生顯著的影響。因此，煙酰胺有可能通過誘導甲基耗竭來影響其他甲基化反應，例如該研究中，煙酰胺喂養(yǎng)后，大鼠甲基供體甜菜堿含量顯著下降。相似的是，也有人研究發(fā)現(xiàn)，協(xié)同服用甜菜堿將緩解尼亞新耗竭S-腺苷蛋氨酸引起肝臟毒性[12]。有趣的是，當大鼠喂養(yǎng)高水平煙酰胺時，血漿另一種甲基供體，膽堿水平顯著提升。一般來說，體內(nèi)膽堿水平的維持由多種途徑參與：如兩個膽堿獲取途徑（飲食攝入和PEMT 合成途徑）和兩個膽堿消耗途徑（膽堿氧化和膽汁磷脂酰膽堿分泌），因此任何一條膽堿獲取或代謝途徑出現(xiàn)異常，將顯著影響膽堿平衡[13]。由此我們推測，煙酰胺觸發(fā)的氧化應激，可能通過誘導細胞膜膽堿前體磷脂酰膽堿的釋放，進而提高血漿膽堿水平。

值得注意的是，血漿同型半胱氨酸，在1 g 煙酰胺喂養(yǎng)的情況下呈降低趨勢，而在4 g 煙酰胺喂養(yǎng)的狀況下反而升高。一些相似的研究也發(fā)現(xiàn)，高同型半胱氨酸血癥在代謝綜合征中很少被觀察到，但在其最初的臨床結局中，如2 型糖尿病和心血管疾病中卻經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)[1]。這些現(xiàn)象似乎也反映了，機體的同型半胱氨酸在向蛋氨酸或者胱硫醚轉換時具備自身調(diào)節(jié)能力，并且這種調(diào)節(jié)也受到許多因素的影響，如血漿同型半胱氨酸的水平被發(fā)現(xiàn)伴隨年齡的增加而升高[14,15]。并且，由于飲食是決定血漿同型半胱氨酸水平的主要因素[16]，因此代謝綜合征的患者，即使心血管疾病患者，在進行低甲基消耗物質(zhì)飲食時，或者具備一個高效的同型半胱氨酸轉變?yōu)榈鞍彼崮芰Φ臅r候，其血漿同型半胱氨酸水平也將顯著降低。從該觀點和當前的實驗結果分析，血漿同型半胱氨酸水平似乎并不是一個能夠良好預測甲基供給和消耗間平衡的良好指標。

煙酰胺的過量攝入誘導的甲基耗竭可能會干擾內(nèi)源性底物的甲基化代謝，例如影響DNA 甲基化和單胺神經(jīng)遞質(zhì)的甲基化滅活，因為所有的內(nèi)源性和外源性底物共用相同的甲基供體庫進行甲基化反應。我們近期的研究證實，煙酰胺在進行甲基化降解的同時，會通過抑制兒茶酚胺的甲基化清除，顯著增加了血漿兒茶酚胺濃度[9]。之后的研究提示，煙酰胺誘導的自由甲基缺乏將干擾DNA 的甲基化反應，包括全基因組DNA 低甲基化和部分基因啟動子核心調(diào)控區(qū)域甲基樣式的改變[17]。

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