誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的萘酰亞胺類化合物的篩選及意義

牛 瑩，劉 健，劉為國

（大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116622）

細(xì)胞凋亡是人體自身耐受機制的重要步驟，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡在參與免疫應(yīng)答以及免疫豁免的調(diào)控中均起重要的作用，同時與多種遺傳性疾病以及腫瘤的發(fā)生具有密切聯(lián)系。細(xì)胞凋亡是復(fù)雜的分子機制調(diào)控過程，可被生理或病理性因素誘發(fā)，是細(xì)胞對所處環(huán)境的某些特定信息的一種應(yīng)答。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡近年成為腫瘤信號通路研究領(lǐng)域的重點內(nèi)容，其中研究的重要貢獻(xiàn)是設(shè)計了核酸的嵌入劑和切斷劑并進(jìn)行開發(fā)用于多種腫瘤的治療，取得重要突破。目前以核酸嵌入劑為靶點的抗腫瘤藥物的研發(fā)階段成為學(xué)者的研究熱點之一[1]。DNA 嵌插劑利用癌變細(xì)胞與正常細(xì)胞DNA 的差異性[2]，通過芳香環(huán)系統(tǒng)插入DNA 堿基對間，使DNA 構(gòu)象發(fā)生變化，誘發(fā)細(xì)胞凋亡達(dá)到抗腫瘤效果。因此，DNA 嵌入劑尤其是萘酰亞胺類嵌入劑在抗腫瘤方面作用顯著，將萘酰亞胺類嵌入劑作為抗腫瘤藥物的靶點，活化細(xì)胞凋亡是一種理想的選擇。

萘酰亞胺系列化合物通過嵌入DNA 堿基對之間，引起核酸結(jié)構(gòu)發(fā)生變化誘發(fā)細(xì)胞凋亡[3]，因此如果提高它和DNA 之間的結(jié)合能力可大大增加其抗腫瘤作用,這一點對其細(xì)胞毒性至關(guān)重要；同時，側(cè)鏈上的氮原子與酰亞胺環(huán)中的氮原子間隔兩個碳原子時，化合物的活性最高。萘酰亞胺化合物嵌入DNA 的萘環(huán)中，如果同一取代基占據(jù)不同的位置時，活性不一樣，取代基不同，藥物的活性也會發(fā)生很大的變化。因此取代基特別是硝基對于萘酰亞胺的活性而言是必需基團(tuán)，為了提高這類化合物對DNA 的親和力，對母環(huán)上的取代基及母環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改造以提高化合物的水溶性和細(xì)胞毒作用[4]。

本實驗設(shè)計人工合成11 種萘酰亞胺類化合物，然后用生物活性測試法（MTT）檢驗它們對不同實驗組的腫瘤細(xì)胞的抑制作用從而進(jìn)行篩選，根據(jù)實驗組的不同數(shù)據(jù)結(jié)果篩選出誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用比較明顯的萘酰亞胺類化合物C8。

1 實驗試劑、儀器和細(xì)胞株

MCF-7 細(xì)胞系（人乳腺癌）、Hela 細(xì)胞系（人宮頸癌）、SMMC-7721 細(xì)胞系（人肝癌）、U-251 細(xì)胞系（人星形膠質(zhì)瘤）均購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，小牛血清、RPMI1640（Hyclone，New Zealand），胰蛋白酶（北京拜爾迪生物公司）

熒光倒置顯微鏡（日本OLYMPUS）、冷凍離心機（Kendro）、電子天平（上海精密科學(xué)儀器廠）、酶標(biāo)儀（TECAN）、滅菌鍋（日本TOMY 有限公司）

2 實驗方法

2.1 化合物合成及細(xì)胞培養(yǎng)

本實驗所用化合物全部以雙萘酰亞胺為母體進(jìn)行合成而得到，其代碼按照分子量由小到大的順序分別為SE5、SE6、B1、B2、E1、E2、D1、C8、D2、E3、D3 共11 種化合物。取繁殖期的Hela、MCF-7、U-251 和SMMC-7721 細(xì)胞，加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，于37℃ 5%CO2 環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)和細(xì)胞傳代，然后用適量0.25%胰蛋白酶消化液進(jìn)行消化、離心后再在培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)達(dá)到對數(shù)生長周期。

2.2 MTT 法分析化合物對細(xì)胞的抑制活性

取對數(shù)生長周期的腫瘤細(xì)胞，Hela 細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞、U-251 細(xì)胞和SMMC-7721 細(xì)胞，加入細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行消化，直至調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×104 個/mL。加于每板為96 孔的培養(yǎng)板中，然后在飽和濕度為5%CO237℃條件下培養(yǎng)12 h 后，在每孔加入5 g/L的MTT 10 μL，然后加入化合物培育48 h，棄MTT原液，將每孔加入10%十二烷基硫酸鈉溶液100 μL靜置24 h，于570 nm 測定光吸收值（參考波長為655 nm）。計算不同濃度藥物的抑制率（%）并計算IC50值（半數(shù)抑制濃度）使用Bliss 法計算，然后根據(jù)IC50值確定后續(xù)實驗化合物的濃度。

3 實驗結(jié)果與分析

本實驗通過MTT 法測試分析了目標(biāo)化合物對培養(yǎng)的不同腫瘤細(xì)胞株(MCF-7 細(xì)胞系、Hela 細(xì)胞系、U-251 細(xì)胞系以及SMMC-7721 細(xì)胞系)的細(xì)胞毒性，結(jié)果見圖1、2、3、4。可以看出，大多數(shù)化合物的體外抗腫瘤活性優(yōu)于對照組，目標(biāo)化合物C8 對腫瘤細(xì)胞具有比其它萘酰亞胺類化合物更強的毒性，而更低濃度的化合物C8 在作用18 h 后就顯著抑制以上4種細(xì)胞的生長并隨作用時間延長而增強。其中化合物SE5、SE6、B1、B2 和C8 對Hela(人宮頸癌)、MCF-7(人乳腺癌)和SMMC-7721(人肝細(xì)胞)具有良好的選擇性，尤其C8 具有良好的多胺轉(zhuǎn)運體識別能力及腫瘤細(xì)胞靶向性。

圖1 不同濃度B1、B2、C8、D2、D3、E1、E2、E3、SE5、SE6(μm)作用12 h 對MCF-7 細(xì)胞的抑制率（%）

圖2 不同濃度B1、B2、C8、D2、D3、E1、E2、E3、SE5、SE6(μm)作用12 h 對Hela 細(xì)胞的抑制率（%）

圖3 不同濃度B1、B2、C8、D2、D3、E1、E2、E3、SE5、SE6(μm)作用12 h 對U-251 細(xì)胞的抑制率（%）

圖4 不同濃度B1、B2、C8、D2、D3、E1、E2、E3、SE5、SE6(μm)作用12 h 對SMMC7721 細(xì)胞的抑制率（%）

化合物C8 (0～80 μM)作用12 h、18 h 和24 h 后，其半數(shù)抑制濃度值見表1。從表1 可以看出化合物C8 作用12 h、18h 以及24h 后其抑制效果隨濃度不同而增強，尤其作用24h 后，IC50 值分別為18.8267、13.0274 和53.6733（μM），最低值同Hela 組相比，相差近4 倍，這表明此類化合物對腫瘤細(xì)胞具有選擇性抑制作用。C8 對U-251 等三種細(xì)胞在不同時間點測得的IC50 值均不同，并隨作用時間的延長，對其細(xì)胞作用的IC50 值逐漸減?。╬<0.05），但對Hela細(xì)胞的抑制作用不顯著（P＞0.05）。當(dāng)作用時間相同，而來源不同組織的細(xì)胞，C8的IC50有顯著的差異性，IC50 值由低到高的順序為：SMMC-7721

表1 化合物C8 分別作用于腫瘤細(xì)胞株12 h、18 h 和24 h 后的IC50 濃度值

4 結(jié)論

由表1 的結(jié)果可以表明，化合物C8 對四組腫瘤細(xì)胞都具有生長抑制作用，并且隨藥物濃度增大和作用時間增長而增強。由圖1-4 的結(jié)果分析，11 種萘酰亞胺類化合物中，化合物C8 的抑制作用最強，其抑制強度與作用時間和劑量呈正相向依賴關(guān)系。

此外，化合物C8 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用可能存在組織特異性，它對MCF-7、U-251 和SMMC-7721 三種細(xì)胞的生長抑制作用顯著，而Hela 細(xì)胞對化合物C8的敏感性不高，提示化合物C8 抑制細(xì)胞生長作用可能具有選擇性。但是，本研究并沒有觀察到化合物C8 抑制細(xì)胞活性作用具有明顯的組織特異性。

5 討論

萘酰亞胺化合物具有共軛平面結(jié)構(gòu)[5]，能夠嵌入DNA 結(jié)構(gòu)從而顯示較強的抗腫瘤活性，近年來受到廣泛關(guān)注隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，成為抗腫瘤藥物的研究熱點之一[6]。Brna 等合成的萘酞亞胺類雙重嵌插劑,，芳環(huán)部分選擇了氨基或硝基，它們能有效嵌入DNA 的堿基對之間[7]，在細(xì)胞體內(nèi)抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，從而對腫瘤細(xì)胞株的生長有明顯的抑制作用[8]。 本實驗通過圖1-4 分析，提示化合物C8 對所有實驗組均有抑制作用，但對不同組織來源細(xì)胞的抑制強度不同，對MCF-7、U-251 和SMMC-7721 腫瘤細(xì)胞生長有顯著的抑制作用，相反對Hela 細(xì)胞系則不明顯（P>0.5），推測化合物C8 的敏感性因組織來源不同而不同，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用具有組織特異性。此實驗結(jié)果與河南大學(xué)王超杰研究組合成了6 個萘酰亞胺多胺綴合物，經(jīng)MTT 法對K562 白血病細(xì)胞、MB－231 人乳腺癌細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞進(jìn)行了體外活性測試結(jié)果相符，推測其通過抑制Akt 磷酸化從而引起一系列的信號分子發(fā)生改變，如14－3－3 蛋白與Bad 解離并與Bcl-xL 結(jié)合，隨后引起cytochromeC釋放及caspase-9 及caspase-3 活化并最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；此外；還能誘導(dǎo)mTOR 和p70S6K 脫磷酸化，Cdk4 下調(diào)及p27kip1 上調(diào)并最終誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G0/G1 期。

本實驗還觀察到萘酞亞胺類化合物C8 作用時間越久，這些腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變就越明顯，如細(xì)胞出現(xiàn)伸展不良，胞漿內(nèi)有大量顆粒狀沉積物，一些細(xì)胞出現(xiàn)不貼壁現(xiàn)象，而且細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變隨藥物濃度增加更明顯,提示化合物C8 可能通過線粒體等途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

總之，萘酰亞胺類化合物具有良好的抑腫瘤作用，改善其長鏈或短鏈衍生物結(jié)構(gòu)是提高其抗腫瘤藥物活性的重要方法。通過合成新的萘酰亞胺類化合物，使其具有更強的抗腫瘤活性，更低的毒副作用，更穩(wěn)定的生物溶解性，從而為新一代抗腫瘤藥物研發(fā)提供方向。

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