石墨烯-殼聚糖修飾玻碳電極檢測牛奶中的三聚氰胺

楊曉蕊，徐 婧，馬麗娜，郭 明

（大連大學 環(huán)境與化學工程學院，遼寧 大連 116622）

自2007 年玫瑰寵物食品中毒事件[1]和2008 年三鹿嬰幼兒奶粉事件[2]等食品安全問題后，三聚氰胺（Melamine, C3H6N6）的危害引起人們的廣泛關注。人體攝入三聚氰胺將導致生殖、泌尿系統(tǒng)疾病，如腎結(jié)石、膀胱癌等[2]。目前，檢測三聚氰胺的方法主要有：電位滴定法[3]，毛細管電泳[4-5]，高效液相色譜法[6]，高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[7]，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8]，高效液相色譜-紫外法[9]，高效液相色譜-二極管陣列法[10]及其他電化學檢測方法[11-15]等。但這些方法儀器設備較復雜，移動不方便，現(xiàn)場應用較難。電化學工作站作為一種操作簡便、分析成本低的儀器[16]，對三聚氰胺的檢測具有良好的應用前景。目前，以電化學法檢測三聚氰胺的應用已有報道。張義根等[17]使用溶膠-凝膠分子印跡技術，以電化學分析法檢測了三聚氰胺，線性范圍為1.0×10-7~1.0×10-3mol/L。金根娣等[18]用裸玻碳工作電極，以電化學法建立測定牛奶中三聚氰胺的方法，線性范圍和檢出限分別為15~345 mg/kg 和5 mg/kg。

石墨烯(Graphene, GR)作為目前發(fā)現(xiàn)的最薄的二維材料，碳原子緊密堆積形成單層二維蜂窩狀晶格結(jié)構，具有良好的導電性[19-20]。石墨烯制備簡單、成本低、具有獨特的超導性能以及新型的量子霍爾效應[21-23]等優(yōu)點，已應用于雙酚A[24-26]、抗壞血酸[27]、蘇丹紅[28]、咖啡因[29]、克倫特羅[30-31]等樣品的檢測。本文將石墨烯分散于殼聚糖（Chitosan, CTS）中修飾于玻碳電極（Glassy Carbon Electrode, GCE）表面，以石墨烯-殼聚糖修飾電極（CTS/GR/GCE），分析研究了三聚氰胺在CTS/GR/GCE 上的電化學行為，對于實際樣品的定性和定量檢測效果明顯，可用于實際樣品檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI600C 電化學工作站(上海辰華儀器公司）、CS300 電化學工作站(武漢科斯特儀器公司）、（三電極系統(tǒng)：玻碳電極GC 為工作電極，Ag/AgCl 為參比電極，鉑電極為對電極）、KQ-100DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、Mettler Toledo PL 203 電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、掃描電子顯微鏡（HITACHI S-4800）

三聚氰胺、殼聚糖（配制成0.3 g/L 殼聚糖乙酸溶液）等試劑均為分析純。

1.2 石墨烯殼聚糖電極的制備

1.2.1 玻碳電極（GC）預處理

先將玻碳電極在金相砂紙上打磨，接著分別以粒徑為1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm 的Al2O3拋光粉在濕潤的麂皮上拋光打磨成鏡面，然后依次用去離子水、HNO3（濃HNO3:水＝1:1，V/V）、無水乙醇、去離子水在超聲波清洗器中清洗10 min。為增加電極表面電活性點的濃度，將電極在0.5 mol /L H2SO4中活化，直到得到穩(wěn)定的伏安曲線。

1.2.2 石墨烯-殼聚糖修飾電極（CTS/GR/GCE 電極）的制備

采用Hummers 法[25]將石墨粉制備得到氧化石墨烯，對制得的氧化石墨烯進行還原，得到石墨烯粉末。圖1 為掃描電子顯微鏡（SEM）對合成的石墨烯進行的分析測試。由圖可見，合成的石墨烯為片層結(jié)構，邊緣少量褶皺為石墨烯聚集的結(jié)果。

圖1 石墨烯的掃描電子顯微鏡

配制25 mL 石墨烯-殼聚糖修飾液：取1.5 g/L 石墨烯溶液與0.3 g/L 殼聚糖乙酸以體積比為1:2 混合，超聲使其分散均勻，即可得到石墨烯濃度為0.5 g/L石墨烯-殼聚糖修飾液。

移取5μL 0.5 g/L 石墨烯-殼聚糖修飾液于GCE表面，紅外燈下烘干30 min 得到灰黑色修飾膜，冷卻后即得石墨烯-殼聚糖修飾電極（CTS/GR/GCE 電極）。

1.3 牛奶中三聚氰胺的測定方法

移取5 mL 牛奶加水稀釋至25 mL，加三聚氰胺標準溶液，攪拌均勻。再以2 mol /L H2SO4為溶劑稀釋到50 mL，攪拌均勻，靜置5 min。由于牛奶中的蛋白質(zhì)遇稀硫酸變質(zhì)凝固為白色絮狀沉淀，固本實驗采用常規(guī)過濾方法，用化學分析濾紙與漏斗過濾，所得到的濾出液以修飾好的CTS/GR/GCE 電極進行循環(huán)伏安法研究。

2 結(jié)果與討論

2.1 石墨烯分散劑的選擇

本實驗選擇了幾種石墨烯的分散劑，如水、石蠟、聚乙二醇等，最后發(fā)現(xiàn)殼聚糖效果較好，圖2 為采用差分脈沖法（DPV）以H2O、殼聚糖為石墨烯的分散劑對比裸玻碳電極（GCE），以1 mol /L H2SO4為溶劑，檢測1×10-4mol /L 三聚氰胺溶液的實驗結(jié)果。實驗中采用的電壓范圍為0～1.5 V，振幅為0.05，電位增量為0.004 V，脈沖寬度為0.05 s，脈沖周期為0.2 s，采樣間隔為0.001 s。 由圖2 可知：與GCE 相比，在0.5 V 附近，三聚氰胺在以殼聚糖為石墨烯分散劑修飾電極（CTS/GR/GCE 電極）上的電流相應信號最大，特征峰值最大，說明CTS/GR/GCE 電極對三聚氰胺具有較好的電催化效應。這是由于石墨烯具有的獨特納米網(wǎng)狀結(jié)構加大了玻碳電極的比表面積，使得三聚氰胺在CTS/GR/GCE 電極上的電流相應信號增大，反應活性明顯增強[32]。故本實驗選取殼聚糖為石墨烯的分散劑。

圖2 石墨烯分散劑的差分脈沖（DPV）對比圖

2.2 三聚氰胺在石墨烯殼聚糖電極上的電化學行為

本實驗以修飾好的CTS/GR/GCE 電極為工作電極，Ag/AgCl 參比電極、鉑電極對電極進行循環(huán)伏安法研究。經(jīng)過多次實驗，選取了三聚氰胺的最佳測定條件：以1 mol/L H2SO4為溶劑，掃描電壓范圍為0～1.9 V，掃描速度為100 mV/s，檢測1×10-3mol/L 三聚氰胺溶液。實驗結(jié)果見圖3，結(jié)果表明：在0.8 V和0.765 V 處出現(xiàn)一對明顯的氧化還原峰。由于這對特征峰的峰電流值與三聚氰胺的濃度呈正比關系，故可以對三聚氰胺待測液進行定性定量檢測。

圖3 三聚氰胺在CTS/GR/GCE 電極上的循環(huán)伏安圖

2.3 溶劑的選擇

實驗中分別選取了H2O、pH=4.0 的HAc-NaAc、pH=7.5 的PBS、10%三氯乙酸、1 mol /L 的H2SO4等為三聚氰胺的溶劑，在電壓范圍為0～1.9 V，掃描速度為100 mV/s 時，采用循環(huán)伏安法掃描含三聚氰胺溶液。實驗結(jié)果表明，以1 mol /L H2SO4為三聚氰胺的溶劑時，三聚氰胺在0.8 V 附近出現(xiàn)一對明顯的氧化還原峰，而選用其他溶劑時，峰型及峰電流較差。說明酸度為該氧化還原過程關鍵，故本實驗選取1 mol /L H2SO4為測定三聚氰胺的溶劑。

2.4 掃描速率與掃描時間

為獲得最佳的測定結(jié)果，采用修飾好的CTS/GR/GCE 電極分別在1 mol /L H2SO4為溶劑、對1×10-3mol /L 三聚氰胺溶液進行測定，重點考察了掃描速率和掃描時間兩個參數(shù)。實驗結(jié)果表明，掃描速率在50～500 mV/s 時，三聚氰胺在CTS/GR/GCE 電極上反應受吸附控制。當v＞100 mV/s，吸附時間隨掃描速率的增大而減小，峰形逐漸變差，且掃描速率較大時靈敏度會降低，故為減少實驗時間增加實驗靈敏度，本實驗選擇100 mV/s 作為掃描速度。

本實驗還考察了不同掃描圈數(shù)對三聚氰胺峰電流的影響。實驗結(jié)果表明：平均100 圈后，三聚氰胺開始在CTS/GR/GCE 電極上吸附，出現(xiàn)氧化還原峰。但隨著掃描圈數(shù)的增加，峰電流值的增加緩慢，為節(jié)省實驗時間，本實驗中掃描圈數(shù)最多為150 圈。

2.5 線性范圍及檢出限

如圖4 所示，以循環(huán)伏安法在最佳測定條件下測定時，不同濃度的三聚氰胺與一對氧化還原峰之間符合線性關系。經(jīng)測定：三聚氰胺的線性檢測范圍為5×10-3～5×10-5mol/L，氧化峰與三聚氰胺濃度的線性回歸方程為I=0.0035 C+9×10-6，相關系數(shù)R= 0.9917；還原峰與三聚氰胺濃度的線性回歸方程為I=-0.0005 C-5×10-6，相關系數(shù)R=0.9938。在該檢測條件下，檢出限為1×10-5mol/L。

圖4 不同濃度三聚氰胺在CTS/GR/GCE 電極上的循環(huán)伏安圖

曲線1~8 分別為三聚氰胺濃度5×10-3、2×10-3、1×10-3、6×10-4、2×10-4、1×10-4、8×10-5、5×10-5mol/ L；右下角圖為氧化峰、還原峰與三聚氰胺濃度的標準曲線圖。

2.6 重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

在最佳測定條件下，以同一根修飾好的CTS/GR/GCE 電極分別測定1×10-3mol/L 三聚氰胺樣品溶液，重復測定6 次，峰電流分別為1.29×10-5A，

1.30×10-5A，1.29×10-5A，1.26×10-5A，1.28×10-5A，1.31×10-5A，平均峰電流為1.288×10-5A，相對標準偏差RSD 為1.23 %，表明該電極具有良好的重現(xiàn)性。

2.7 電極穩(wěn)定性實驗

將該電極室溫放置48 h 后重復上述實驗，結(jié)果表明，峰電流略有下降，峰電流為1.16×10-5A，約為上述實驗測定值的90.1 %，表明該電極具有良好的穩(wěn)定性。

2.8 干擾實驗

在最佳測定條件下，在1×10-3mol /L 三聚氰胺溶液中，分別加入常見無機鹽和有機化合物，研究其對三聚氰胺的干擾情況。實驗結(jié)果表明：500 倍的常見無機鹽NaCl、KNO3，100 倍的葡萄糖、牛血清白蛋白（BSA）和尿素等均不干擾三聚氰胺的檢測。由此可見，該方法具有良好的選擇性，可以有效地應用于實際樣品的檢測。

2.9 樣品的測定

選取市場上銷售的某兩種知名品牌的牛奶，以實驗方法1.3 進行研究，實驗結(jié)果見表1。實驗結(jié)果表明，該方法對實際樣品的檢測效果明顯，加標回收率為93%～101%。

表1 樣品中三聚氰胺含量的測定（n=3）

3 結(jié)語

利用石墨烯-殼聚糖修飾電極（CTS/GR/GCE 電極）構建了一種檢測牛奶中三聚氰胺的新方法。三聚氰胺的線性檢測范圍為5×10-3～5×10-5mol/L，檢出限為1×10-5mol/L，相對標準偏差RSD 為1.23%。該方法準確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，在實際樣品的檢測中具有良好的應用前景。

[1] 聶艷, 尹春, 唐曉純, 等. 1985-2011 年我國食物中毒特點分析及應急對策研究[J]. 食品科學, 2013(05): 218-222.

[2] 馬永嬌. 食品安全檢測引入第三方機制—首批三聚氰胺檢測機構名錄公布[J]. 食品安全導刊, 2008(06): 39.

[3] 井偉, 李小晶, 呂水源, 等. CdS 修飾玻碳電極電化學發(fā)光法檢測三聚氰胺[J]. 分析科學學報, 2011(05): 607-610.

[4] 李志偉, 霍云霞, 劉佳, 等. 高效毛細管電泳法測定奶制品中三聚氰胺含量[J]. 食品科學, 2010, 31: 131-133.

[5] Vittd, Himmelsbach M, et al. Improved analysis of melamine- formaldehyde resins by capillary zone electrophoresis- mass spectrometry using ion-trap and quadrupole-time-offlight mass spectrometers [J]. Journal of Chromatography A, 2008, 1213: 83-87.

[6] Ehling S, Tefera S, Ho I P. High-performance liquid chromatographic method for the simultaneous detection of the adulteration of cereal flours with melamine and related triazine by-products ammeline, ammelide, and cyanuric acid [J]. Food Additives Contaminants, 2007, 24: 1319-1325.

[7] Garber, Eric A E. Detection of Melamine Using Commercial Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Technology [J]. Journal of Food Protection, 2008, 71: 590-593.[8] Yang S P, Ding J H, et al. Detection of melamine in milk products by surface desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry [J]. Anal Chem, 2009, 81(7): 2426-2436.

[9] Baynes R E, Smith G, Mason S E. Pharmacokinetics of melamine in pigs following intravenous administration [J]. Food and Chemical Toxicology, 2008, 46: 1196-1199.

[10] Kim B, Perkins LB, Bushway R J. Determination of Detection, and Ultra-Performance Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometry [J]. J AOAC Int, 2008, 91: 408-411.

[11] 干寧, 王峰, 王魯雁, 等. 基于納米磁珠修飾印刷電極的牛奶中三聚氰胺檢測安培免疫傳感器[J]. 傳感技術學報, 2009, 22(4): 456-461.

[12] Cao Q, Zhao H, et al. Electrochemical determination of melamine using oligonucleotides modified gold electrodes [J]. Talanta, 2009, 80: 484-488.

[13] Liao C, Chen Y, Chang J L, et al. A sensitive electrochemical approach for melamine detection using a disposable screen printed carbon electrode [J]. Electroanalysis, 2011, 23: 573-576.

[14] Zhu H, Zhang S X, Li M X, et al. Electrochemical sensor for melamine based on its copper complex [J]. Chem Commun, 2010, 46: 2259-2261.

[15] Cao Q, Zhao H, He Y J, et al. Electrochemical sensing of melamine with 3,4-dihydroxyphenylacetic acid as recogni- tion element [J]. Anal Chim Acta, 2010, 675: 24-28.

[16] 王朝霞, 陳美鳳, 馬心英. 石墨烯修飾玻碳電極用于循環(huán)伏安法測定抗壞血酸[J]. 理化檢驗, 2012,48:321-327.

[17] 張義根, 齊文靜, 劉瑛, 等. 溶膠-凝膠分子印跡檢測三聚氰胺[J]. 分析試驗室, 2011,30(2): 21-24.

[18] 金根娣, 杜詩, 胡效亞. 電化學方法快速測定牛奶中的三聚氰胺[J]. 食品科學, 2011(32): 291-295.

[19] Geim A K, Novoselov K S .The rise of grapheme [J]. Nature Mater, 2007, 6: 183-187.

[20] Avouris P, Chen Z H, Perebeinos V. Carbon-based electronics [J]. Nature Nanotechn, 2007, 2: 605-609.

[21] Williams J R, Dicarlo L C, Marcus C M. Quantum Hall effect in a gate-controlled p-n junction of grapheme [J]. Science, 2007, 317: 638-643.

[22] Novoselov K S, Jiang A, Zhang Y, et al. Room-temerature uantum hall effect in grapheme [J]. Science, 2007, 315: 1379-1385.

[23] Du X, Skachko I, Durr F, et al. Fractional quantum Hall effect and insulating phase of Dirac electrons in grapheme [J]. Nature, 2009, 42: 192-197.

[24] Bolotin K I, Ghahari F, Shuiman M D, et al. Observation of the fractional quantum Hall effect in grapheme [J]. Nature, 2009, 42: 196-201.

[25] 匡云飛, 鄒建陵, 李薇, 等. 雙酚A 在殼聚糖石墨烯復合膜電化學傳感器上的電化學行為及測定[J]. 分析試驗室, 2013(03): 33-37.

[26] Niu X L, Wu Y, et al. A novel electrochemical sensor of bisphenol A based on stacked graphene nanofibers/gold nanogarticles composite modified glassy carbon electrode [J]. Electrochimica Acta, 2013, 98: 167-175.

[27] Wang Q X, Wang Y H, et al. Voltammetric detection of bisphenol a by a chitosan-graphene composite modified carbon ionic liquid electrode [J]. Thin Solid Film, 2012, 520: 4459-4464.

[28] 羅宿星, 代小容, 等. 蘇丹紅在殼聚糖-氧化石墨烯自組裝膜修飾玻碳電極上的電化學行為及其測定[J]. 分析測試學報, 2012(12): 1562-1566.

[29] 盧先春, 黃克靖, 等. 氧化石墨烯/鐵氰化鈰修飾玻碳電極同時測定撲熱息痛和咖啡因[J]. 分析化學, 2012(03): 452-456.

[30] Lai Y J, Bai J, et al. Graphene oxide as nanocarrier for sensitive electrochemical immunoassay of clenbuterol based on labeling amplification strategy [J]. Talanta, 2013, 107: 176-182.

[31] Wu C, Sun D, et al. Electrochemical sensor for toxic ractopamine and clenbuterol based on the enhancement effect of grapheme oxide [J]. Sensors and Actuators B, 2012, 168: 178-184.

[32] 賴麗燕, 劉錚, 袁帥. 石墨烯在生物傳感器中的應用[J]. 理化檢測, 2013(49): 370-375.