謝立信：臨床與基礎(chǔ)研究，如何良好互動(dòng)？

蘇暄

3月14日，正是草長(zhǎng)鶯飛、迎春花粲然報(bào)春之時(shí)。

在這大好春光中，業(yè)界專家學(xué)者云集于北京大學(xué)英杰交流中心，參加第六屆中國(guó)眼科學(xué)基礎(chǔ)研究大會(huì)暨研究生導(dǎo)師論壇。中國(guó)工程院院士、山東省眼科研究所所長(zhǎng)謝立信教授在開幕發(fā)言中指出了眼表重建領(lǐng)域應(yīng)用基礎(chǔ)研究的發(fā)展方向。

眼表重建在中國(guó)：高難度挑戰(zhàn)沒商量？

眼表（ocular surface）包括結(jié)膜上皮、角膜上皮及淚膜。眼表涉及的解剖部位除了角膜和結(jié)膜外，還有眼瞼和淚腺組織。臨床上，眼表疾?。╫cular surface disease，OSD）主要是指角膜上皮和結(jié)膜上皮的病變。角膜上皮的完整是維持角膜正常功能和視覺質(zhì)量的關(guān)鍵，其穩(wěn)定性受益于角膜緣基底部干細(xì)胞不斷地增殖分化和向心性移動(dòng)。當(dāng)各種因素導(dǎo)致角膜緣干細(xì)胞的破壞，會(huì)引起角膜緣干細(xì)胞的衰竭。

謝立信院士認(rèn)為，眼表疾病是眼科界面臨的棘手疾病之一，其中角膜緣干細(xì)胞缺乏是引起眾多眼表疾病的主要原因之一。角膜緣干細(xì)胞缺乏常會(huì)引起角膜上皮缺損、角膜新生血管、角膜結(jié)膜化、角膜潰瘍甚至自溶，嚴(yán)重者還會(huì)引起瞼球粘連、結(jié)膜囊閉鎖，不但影響外觀，有的甚至?xí)鹗?。近年來，由于角膜緣干?xì)胞理論和組織工程技術(shù)的完善和發(fā)展，眼表疾病的治療也有了較大進(jìn)展。目前眼表重建手術(shù)是治療眼表疾病的重要手段，而干細(xì)胞移植則是眼表重建手術(shù)中的關(guān)鍵，包括自體或同種異體角膜緣干細(xì)胞移植、體外培養(yǎng)角膜緣干細(xì)胞移植以及口腔黏膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)移植。

迄今為止，《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》共報(bào)道了3篇對(duì)眼表重建研究領(lǐng)域十分重要的論文，都是關(guān)于干細(xì)胞移植重建眼表的臨床研究。2000年，知名眼表疾病專家、臺(tái)灣蔡瑞芳醫(yī)師在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》發(fā)表文章，采用羊膜為載體構(gòu)建培養(yǎng)的自體重組角膜上皮膜片，對(duì)6例單側(cè)角膜緣干細(xì)胞缺乏患者進(jìn)行了移植治療，術(shù)后5例視力明顯提高。2004年，日本大阪大學(xué)眼科學(xué)系主任Kohji Nishida教授等改變了載體，用溫敏材料載體構(gòu)建培養(yǎng)的自體重組口腔黏膜上皮膜片，對(duì)4例雙側(cè)角膜緣干細(xì)胞缺乏患者進(jìn)行了移植治療，

術(shù)后眼表穩(wěn)定、角膜透明性和視力都有所改善。2010年，意大利Pellegrini教授在細(xì)胞培養(yǎng)的載體方面又進(jìn)行了改進(jìn)，把載體換成了纖維蛋白膠，構(gòu)建了自體重組角膜上皮膜片，完成了112例角膜緣干細(xì)胞缺乏癥患者的移植治療，其中76.6%的患者角膜恢復(fù)了透明，平均隨訪2.91年，其中最長(zhǎng)的為5年，部分病例是先改善眼表功能，然后再進(jìn)行穿透角膜移植手術(shù)恢復(fù)視力。

從目前的報(bào)道來看，培養(yǎng)的干細(xì)胞移植成功率多在75%左右，但決定成功率的關(guān)鍵是培養(yǎng)的重組上皮膜片中含有一定比例的干細(xì)胞，阻擋了新生血管向角膜的生長(zhǎng)。在此情況下再做穿透角膜移植術(shù)，成功率就會(huì)較高。而且，他們選取的病例損傷程度較輕，基本都局限在角膜部位，結(jié)膜和其他眼表功能相對(duì)正常，沒有明顯的角膜基質(zhì)和角膜內(nèi)皮損害，血管膜切除方便；此外，多采用患者自體角膜緣干細(xì)胞移植，涉及到的免疫排斥反應(yīng)問題也比較少。

“國(guó)內(nèi)幾個(gè)中心開展的眼表重建手術(shù)大多是參考國(guó)外的最先進(jìn)技術(shù)，但我國(guó)眼表重建手術(shù)面臨的臨床科學(xué)問題與發(fā)達(dá)國(guó)家明顯不同?；颊卟∏閺?fù)雜，不但有角膜緣干細(xì)胞的缺乏，且結(jié)膜和眼瞼都有不同程度的損傷，必須先重建結(jié)膜囊，恢復(fù)眼表的功能，再進(jìn)行角膜功能重建，板層角膜移植或穿透角膜移植手術(shù)進(jìn)行復(fù)明；此外，患者多為雙眼燒傷，沒有自體角膜緣干細(xì)胞可用，這就要求我們用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)的基礎(chǔ)研究來解決這些臨床問題。

既然臨床上需要大的細(xì)胞膜片才能重建結(jié)膜囊，那么干細(xì)胞的體外大量擴(kuò)增就成為了關(guān)鍵問題。有人說，這個(gè)細(xì)胞膜片可來自患者自體口腔黏膜，但重建結(jié)膜囊采用培養(yǎng)的口腔粘膜移植后近期效果很好，2年后，仍有新生血管長(zhǎng)入，因?yàn)榇祟惻囵B(yǎng)的上皮組織缺少抗新生血管的因子。這就需要改進(jìn)干細(xì)胞培養(yǎng)的方法，當(dāng)然目前也有很多細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法，但效率還比較低。我們科研團(tuán)隊(duì)的研究人員采用羊膜作為載體，探索通過加入一種稱為“Rho蛋白激酶抑制劑”的小分子化合物Y-27632，來實(shí)現(xiàn)角膜緣干細(xì)胞的大量擴(kuò)增，構(gòu)建重組角膜上皮膜片，發(fā)現(xiàn)其中干細(xì)胞的數(shù)量和比例均明顯增加。

角膜緣干細(xì)胞擴(kuò)增，要突破更要安全

謝立信院士還介紹說，我們科研團(tuán)隊(duì)擴(kuò)增培養(yǎng)構(gòu)建出角膜緣上皮細(xì)胞膜片后，首先考慮的不是馬上應(yīng)用于臨床，而要想到其在臨床應(yīng)用上的安全性。此前，我們已取得衛(wèi)生行政部門的臨床應(yīng)用批件，可開展組織工程化角結(jié)膜上皮移植治療技術(shù)臨床應(yīng)用。

目前小分子化合物Y-27632的分子機(jī)制明確，已有不少臨床應(yīng)用的報(bào)道證實(shí)其使用是安全的，但我們發(fā)現(xiàn)其主要功能是提高干細(xì)胞的抗氧化能力。既然要移植大的細(xì)胞膜片，就要盡量提高其存活能力，使其能在患者眼表很好地存活。首先，我們盡量采用比較成熟的角膜上皮膜片的制備方法和技術(shù)，也在很多方面做了改進(jìn)，羊膜復(fù)合角膜緣干細(xì)胞膜片的制備方法已獲得國(guó)家發(fā)明專利。

第二個(gè)重點(diǎn)是，經(jīng)擴(kuò)增后，上皮細(xì)胞膜片里的干細(xì)胞數(shù)量是否減少，所占比例是否會(huì)下降？我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過Y-27632擴(kuò)增培養(yǎng)構(gòu)建的角膜上皮細(xì)胞膜片，保持了原代角膜緣干細(xì)胞的正常比例，并略有增加。

另外，我們還要觀察，經(jīng)過擴(kuò)增培養(yǎng)構(gòu)建的將投入臨床應(yīng)用的角膜上皮膜片，是否具有正常角膜上皮細(xì)胞的解剖結(jié)構(gòu)和生理特征。對(duì)此我們也做了對(duì)照研究，發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的重組角膜上皮膜片具有與正常角膜上皮類似的結(jié)構(gòu)和功能特征。

最后，我們還要到臨床上去驗(yàn)證重組角膜上皮膜片的治療效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些重組的角膜上皮膜片用于重建患者結(jié)膜囊的臨床效果非常好，而且對(duì)于非常嚴(yán)重的患者，我們還可以進(jìn)行二次移植，多數(shù)患者在一到兩次移植后都恢復(fù)了較為正常的眼表功能，患者的滿意度很高，因?yàn)槿绱藝?yán)重的疾病目前在其他地方都沒有辦法解決。

培養(yǎng)的角膜緣上皮干細(xì)胞臨床應(yīng)用效果endprint

一次移植

二次移植

眼表重建的機(jī)制假說，新謎團(tuán)待解

謝立信院士說，我們?cè)谶M(jìn)行二次干細(xì)胞移植或進(jìn)行穿透角膜移植術(shù)時(shí)，可以獲得一個(gè)病變的血管膜或角膜組織，使用取下的病變組織做進(jìn)一步的DNA基因分型和干細(xì)胞的病理檢測(cè)，結(jié)合臨床隨訪、術(shù)中印跡細(xì)胞學(xué)檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 移植后3～60個(gè)月，19例角膜組織印跡細(xì)胞學(xué)檢查和印跡組織和5例受體角膜組織均未檢測(cè)到供體DNA，全為受體表型。

這些移植的供體干細(xì)胞都去了何處？這給我們又設(shè)了一個(gè)新的謎團(tuán)。一些病例3個(gè)月內(nèi)供體DNA是表達(dá)的，還有一些病例在3個(gè)月至半年、甚至更長(zhǎng)時(shí)間也有表達(dá)，但在一年后基本都找不到供體DNA的表達(dá)，都變成了受體自身的表型。

為解釋供體干細(xì)胞消失的原因，我們團(tuán)隊(duì)的研究人員提出了三個(gè)新的假說：

第一種假說是，干細(xì)胞可能來源于受體的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；也就是說骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞受到刺激后，歸巢到角膜組織。此外，我們觀察到植片移植后干細(xì)胞的情況，發(fā)現(xiàn)眼表環(huán)境改善后，歸巢到角膜組織的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞明顯增多。

第二種假說是，這一現(xiàn)象是由于受體角膜緣干細(xì)胞復(fù)蘇而造成。也就是說，自體角膜緣干細(xì)胞未完全死亡，只是由于病變的環(huán)境使之處于潛伏狀態(tài)。當(dāng)干細(xì)胞移植使病情緩解或微環(huán)境改善后，有一部分的自體角膜緣干細(xì)胞即行復(fù)蘇。

第三種假說是，由于是重建結(jié)膜囊，殘存的結(jié)膜部位仍有干細(xì)胞，移植的羊膜載體的角膜上皮膜片為殘存的結(jié)膜干細(xì)胞提供合適的微環(huán)境和移行的支架。為驗(yàn)證第一種假說，我們進(jìn)行了小鼠眼部化學(xué)傷后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢到角膜組織的檢測(cè)及影響因素分析的實(shí)驗(yàn)研究。我們?cè)O(shè)計(jì)建立了動(dòng)物模型，進(jìn)行骨髓功能正常組、骨髓功能動(dòng)員組和球結(jié)膜下注射組三組對(duì)照實(shí)驗(yàn)，試圖分析小鼠眼部化學(xué)傷后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢到角膜組織的影響因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有一定的“歸巢效應(yīng)”，眼表微環(huán)境改善后，歸巢到角膜組織的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞明顯增多，并有利于眼表向角膜上皮表型分化，應(yīng)用粒細(xì)胞集落刺激因子進(jìn)行骨髓動(dòng)員可以提高歸巢效率；經(jīng)骨髓動(dòng)員或球結(jié)膜下注射的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均聚集在角膜緣處，不向角膜中央發(fā)生移動(dòng)。但這是不是移植角膜緣干細(xì)胞消失的主要原因？我們分析，通過血液到達(dá)角膜緣的干細(xì)胞數(shù)量非常少，這一想法還有待其他研究來證實(shí)。

謝立信院士還指出，由于移植的角膜緣上皮干細(xì)胞細(xì)胞是來源于同種異體，術(shù)后常會(huì)面臨免疫排斥反應(yīng)問題，其主要臨床特征是睫狀充血、角膜周邊部可見環(huán)狀上皮排斥線及上皮缺損區(qū)，角膜緣處大量新生血管充盈、怒張，臨床診斷并不困難。我們統(tǒng)計(jì)免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生率為23.3%。此外，通過臨床共聚焦顯微鏡檢查，我們發(fā)現(xiàn)在角膜緣和角膜上皮缺損部位可見大量朗格漢斯（Langhans）細(xì)胞浸潤(rùn)；還可以通過免疫印跡細(xì)胞學(xué)檢查，觀察到角膜周邊和中央CD4、CD8陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)；經(jīng)抗免疫排斥反應(yīng)藥物（糖皮質(zhì)激素、環(huán)孢素A）治療有效，眼表穩(wěn)定。我們總結(jié)的角膜緣上皮干細(xì)胞移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)病例的文章發(fā)表在2013年第5期的Ophthalmology雜志上。

對(duì)于眼表重建手術(shù)，我們還需要知道的更多，有很多問題要弄清楚，比如干細(xì)胞的臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的制定，這是基礎(chǔ)向臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵；其次要研究移植后干細(xì)胞的去向和新的干細(xì)胞來源；以及隨訪了解移植角膜緣干細(xì)胞的功能究竟是短期還是長(zhǎng)期的等諸多問題。這些科學(xué)問題都需要我們開展大量的臨床和基礎(chǔ)工作以進(jìn)一步研究論證。

如何進(jìn)行高效的科研？

針對(duì)怎樣創(chuàng)造科研高效率的問題，謝院士表示，要先在臨床上把科學(xué)問題提出來，然后在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行應(yīng)用基礎(chǔ)研究，有了應(yīng)用基礎(chǔ)研究結(jié)果，再與臨床問題結(jié)合，進(jìn)行驗(yàn)證和總結(jié)后，投到比較有影響力的學(xué)術(shù)刊物上。也就是說，首先要善于發(fā)現(xiàn)臨床醫(yī)學(xué)中的科學(xué)問題，然后組織科研團(tuán)隊(duì)進(jìn)行有目的的集中研究，發(fā)現(xiàn)科學(xué)證據(jù)后，再迅速向臨床轉(zhuǎn)化，同時(shí)要重視轉(zhuǎn)化后的臨床效果、評(píng)價(jià)及推廣。

我們團(tuán)隊(duì)目前參與了一項(xiàng)973計(jì)劃，里面有一只很大的“攔路虎”，就是關(guān)于同種異體來源的干細(xì)胞移植安全和標(biāo)準(zhǔn)的問題。我國(guó)相關(guān)部門對(duì)此研究的審批過程非常嚴(yán)格，難度很大。如果應(yīng)用自體的干細(xì)胞移植較為容易，用自體口腔黏膜可以重建結(jié)膜囊，但要重建結(jié)膜上皮，恢復(fù)眼表的功能還需解決很多問題。而且，如果我們只能使用患者很少的一點(diǎn)自體干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，就必須要有工程化技術(shù)手段來解決，因此需要細(xì)胞生物學(xué)專家?guī)椭覀兘鉀Q這個(gè)問題。要把臨床應(yīng)用再次出現(xiàn)的問題逐一解決，這就帶來了很多后續(xù)研究，而這些研究不僅需要國(guó)家自然科學(xué)基金，還需要國(guó)家973等大項(xiàng)目的支持。

北京同仁醫(yī)院王寧利教授表示，現(xiàn)在學(xué)術(shù)界注重的是看成果對(duì)本行業(yè)發(fā)展的引領(lǐng)作用，謝院士的文章都是在Ophthalmology、Iovs、Ajo等眼科頂尖雜志發(fā)表，其中有的是作為封面文章發(fā)表。臨床問題驅(qū)動(dòng)型科研是當(dāng)前很重要的研究方式。我們呼喚“在思考中開刀，在開刀中思考”的醫(yī)生。

謝立信院士就是從臨床問題提練出科學(xué)問題，從科學(xué)問題、技術(shù)問題，找出假說再去驗(yàn)證。如果我們從角膜緣殘留的細(xì)胞中找出干細(xì)胞，讓它去擴(kuò)增成為移植的來源，這可能是最理想的干細(xì)胞獲取方式。但對(duì)于完全沒有自體干細(xì)胞的患者來說，如何獲得干細(xì)胞是眼科人亟需解決的問題。這個(gè)問題已超越眼科，成為一個(gè)大科學(xué)問題，需要統(tǒng)籌安排。endprint

一次移植

二次移植

眼表重建的機(jī)制假說，新謎團(tuán)待解

謝立信院士說，我們?cè)谶M(jìn)行二次干細(xì)胞移植或進(jìn)行穿透角膜移植術(shù)時(shí)，可以獲得一個(gè)病變的血管膜或角膜組織，使用取下的病變組織做進(jìn)一步的DNA基因分型和干細(xì)胞的病理檢測(cè)，結(jié)合臨床隨訪、術(shù)中印跡細(xì)胞學(xué)檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 移植后3～60個(gè)月，19例角膜組織印跡細(xì)胞學(xué)檢查和印跡組織和5例受體角膜組織均未檢測(cè)到供體DNA，全為受體表型。

這些移植的供體干細(xì)胞都去了何處？這給我們又設(shè)了一個(gè)新的謎團(tuán)。一些病例3個(gè)月內(nèi)供體DNA是表達(dá)的，還有一些病例在3個(gè)月至半年、甚至更長(zhǎng)時(shí)間也有表達(dá)，但在一年后基本都找不到供體DNA的表達(dá)，都變成了受體自身的表型。

為解釋供體干細(xì)胞消失的原因，我們團(tuán)隊(duì)的研究人員提出了三個(gè)新的假說：

第一種假說是，干細(xì)胞可能來源于受體的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；也就是說骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞受到刺激后，歸巢到角膜組織。此外，我們觀察到植片移植后干細(xì)胞的情況，發(fā)現(xiàn)眼表環(huán)境改善后，歸巢到角膜組織的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞明顯增多。

第二種假說是，這一現(xiàn)象是由于受體角膜緣干細(xì)胞復(fù)蘇而造成。也就是說，自體角膜緣干細(xì)胞未完全死亡，只是由于病變的環(huán)境使之處于潛伏狀態(tài)。當(dāng)干細(xì)胞移植使病情緩解或微環(huán)境改善后，有一部分的自體角膜緣干細(xì)胞即行復(fù)蘇。

第三種假說是，由于是重建結(jié)膜囊，殘存的結(jié)膜部位仍有干細(xì)胞，移植的羊膜載體的角膜上皮膜片為殘存的結(jié)膜干細(xì)胞提供合適的微環(huán)境和移行的支架。為驗(yàn)證第一種假說，我們進(jìn)行了小鼠眼部化學(xué)傷后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢到角膜組織的檢測(cè)及影響因素分析的實(shí)驗(yàn)研究。我們?cè)O(shè)計(jì)建立了動(dòng)物模型，進(jìn)行骨髓功能正常組、骨髓功能動(dòng)員組和球結(jié)膜下注射組三組對(duì)照實(shí)驗(yàn)，試圖分析小鼠眼部化學(xué)傷后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢到角膜組織的影響因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有一定的“歸巢效應(yīng)”，眼表微環(huán)境改善后，歸巢到角膜組織的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞明顯增多，并有利于眼表向角膜上皮表型分化，應(yīng)用粒細(xì)胞集落刺激因子進(jìn)行骨髓動(dòng)員可以提高歸巢效率；經(jīng)骨髓動(dòng)員或球結(jié)膜下注射的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均聚集在角膜緣處，不向角膜中央發(fā)生移動(dòng)。但這是不是移植角膜緣干細(xì)胞消失的主要原因？我們分析，通過血液到達(dá)角膜緣的干細(xì)胞數(shù)量非常少，這一想法還有待其他研究來證實(shí)。

謝立信院士還指出，由于移植的角膜緣上皮干細(xì)胞細(xì)胞是來源于同種異體，術(shù)后常會(huì)面臨免疫排斥反應(yīng)問題，其主要臨床特征是睫狀充血、角膜周邊部可見環(huán)狀上皮排斥線及上皮缺損區(qū)，角膜緣處大量新生血管充盈、怒張，臨床診斷并不困難。我們統(tǒng)計(jì)免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生率為23.3%。此外，通過臨床共聚焦顯微鏡檢查，我們發(fā)現(xiàn)在角膜緣和角膜上皮缺損部位可見大量朗格漢斯（Langhans）細(xì)胞浸潤(rùn)；還可以通過免疫印跡細(xì)胞學(xué)檢查，觀察到角膜周邊和中央CD4、CD8陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)；經(jīng)抗免疫排斥反應(yīng)藥物（糖皮質(zhì)激素、環(huán)孢素A）治療有效，眼表穩(wěn)定。我們總結(jié)的角膜緣上皮干細(xì)胞移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)病例的文章發(fā)表在2013年第5期的Ophthalmology雜志上。

對(duì)于眼表重建手術(shù)，我們還需要知道的更多，有很多問題要弄清楚，比如干細(xì)胞的臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的制定，這是基礎(chǔ)向臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵；其次要研究移植后干細(xì)胞的去向和新的干細(xì)胞來源；以及隨訪了解移植角膜緣干細(xì)胞的功能究竟是短期還是長(zhǎng)期的等諸多問題。這些科學(xué)問題都需要我們開展大量的臨床和基礎(chǔ)工作以進(jìn)一步研究論證。

如何進(jìn)行高效的科研？

針對(duì)怎樣創(chuàng)造科研高效率的問題，謝院士表示，要先在臨床上把科學(xué)問題提出來，然后在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行應(yīng)用基礎(chǔ)研究，有了應(yīng)用基礎(chǔ)研究結(jié)果，再與臨床問題結(jié)合，進(jìn)行驗(yàn)證和總結(jié)后，投到比較有影響力的學(xué)術(shù)刊物上。也就是說，首先要善于發(fā)現(xiàn)臨床醫(yī)學(xué)中的科學(xué)問題，然后組織科研團(tuán)隊(duì)進(jìn)行有目的的集中研究，發(fā)現(xiàn)科學(xué)證據(jù)后，再迅速向臨床轉(zhuǎn)化，同時(shí)要重視轉(zhuǎn)化后的臨床效果、評(píng)價(jià)及推廣。

我們團(tuán)隊(duì)目前參與了一項(xiàng)973計(jì)劃，里面有一只很大的“攔路虎”，就是關(guān)于同種異體來源的干細(xì)胞移植安全和標(biāo)準(zhǔn)的問題。我國(guó)相關(guān)部門對(duì)此研究的審批過程非常嚴(yán)格，難度很大。如果應(yīng)用自體的干細(xì)胞移植較為容易，用自體口腔黏膜可以重建結(jié)膜囊，但要重建結(jié)膜上皮，恢復(fù)眼表的功能還需解決很多問題。而且，如果我們只能使用患者很少的一點(diǎn)自體干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，就必須要有工程化技術(shù)手段來解決，因此需要細(xì)胞生物學(xué)專家?guī)椭覀兘鉀Q這個(gè)問題。要把臨床應(yīng)用再次出現(xiàn)的問題逐一解決，這就帶來了很多后續(xù)研究，而這些研究不僅需要國(guó)家自然科學(xué)基金，還需要國(guó)家973等大項(xiàng)目的支持。

北京同仁醫(yī)院王寧利教授表示，現(xiàn)在學(xué)術(shù)界注重的是看成果對(duì)本行業(yè)發(fā)展的引領(lǐng)作用，謝院士的文章都是在Ophthalmology、Iovs、Ajo等眼科頂尖雜志發(fā)表，其中有的是作為封面文章發(fā)表。臨床問題驅(qū)動(dòng)型科研是當(dāng)前很重要的研究方式。我們呼喚“在思考中開刀，在開刀中思考”的醫(yī)生。

謝立信院士就是從臨床問題提練出科學(xué)問題，從科學(xué)問題、技術(shù)問題，找出假說再去驗(yàn)證。如果我們從角膜緣殘留的細(xì)胞中找出干細(xì)胞，讓它去擴(kuò)增成為移植的來源，這可能是最理想的干細(xì)胞獲取方式。但對(duì)于完全沒有自體干細(xì)胞的患者來說，如何獲得干細(xì)胞是眼科人亟需解決的問題。這個(gè)問題已超越眼科，成為一個(gè)大科學(xué)問題，需要統(tǒng)籌安排。endprint

一次移植

二次移植

眼表重建的機(jī)制假說，新謎團(tuán)待解

謝立信院士說，我們?cè)谶M(jìn)行二次干細(xì)胞移植或進(jìn)行穿透角膜移植術(shù)時(shí)，可以獲得一個(gè)病變的血管膜或角膜組織，使用取下的病變組織做進(jìn)一步的DNA基因分型和干細(xì)胞的病理檢測(cè)，結(jié)合臨床隨訪、術(shù)中印跡細(xì)胞學(xué)檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 移植后3～60個(gè)月，19例角膜組織印跡細(xì)胞學(xué)檢查和印跡組織和5例受體角膜組織均未檢測(cè)到供體DNA，全為受體表型。

這些移植的供體干細(xì)胞都去了何處？這給我們又設(shè)了一個(gè)新的謎團(tuán)。一些病例3個(gè)月內(nèi)供體DNA是表達(dá)的，還有一些病例在3個(gè)月至半年、甚至更長(zhǎng)時(shí)間也有表達(dá)，但在一年后基本都找不到供體DNA的表達(dá)，都變成了受體自身的表型。

為解釋供體干細(xì)胞消失的原因，我們團(tuán)隊(duì)的研究人員提出了三個(gè)新的假說：

第一種假說是，干細(xì)胞可能來源于受體的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；也就是說骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞受到刺激后，歸巢到角膜組織。此外，我們觀察到植片移植后干細(xì)胞的情況，發(fā)現(xiàn)眼表環(huán)境改善后，歸巢到角膜組織的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞明顯增多。

第二種假說是，這一現(xiàn)象是由于受體角膜緣干細(xì)胞復(fù)蘇而造成。也就是說，自體角膜緣干細(xì)胞未完全死亡，只是由于病變的環(huán)境使之處于潛伏狀態(tài)。當(dāng)干細(xì)胞移植使病情緩解或微環(huán)境改善后，有一部分的自體角膜緣干細(xì)胞即行復(fù)蘇。

第三種假說是，由于是重建結(jié)膜囊，殘存的結(jié)膜部位仍有干細(xì)胞，移植的羊膜載體的角膜上皮膜片為殘存的結(jié)膜干細(xì)胞提供合適的微環(huán)境和移行的支架。為驗(yàn)證第一種假說，我們進(jìn)行了小鼠眼部化學(xué)傷后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢到角膜組織的檢測(cè)及影響因素分析的實(shí)驗(yàn)研究。我們?cè)O(shè)計(jì)建立了動(dòng)物模型，進(jìn)行骨髓功能正常組、骨髓功能動(dòng)員組和球結(jié)膜下注射組三組對(duì)照實(shí)驗(yàn)，試圖分析小鼠眼部化學(xué)傷后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢到角膜組織的影響因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有一定的“歸巢效應(yīng)”，眼表微環(huán)境改善后，歸巢到角膜組織的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞明顯增多，并有利于眼表向角膜上皮表型分化，應(yīng)用粒細(xì)胞集落刺激因子進(jìn)行骨髓動(dòng)員可以提高歸巢效率；經(jīng)骨髓動(dòng)員或球結(jié)膜下注射的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均聚集在角膜緣處，不向角膜中央發(fā)生移動(dòng)。但這是不是移植角膜緣干細(xì)胞消失的主要原因？我們分析，通過血液到達(dá)角膜緣的干細(xì)胞數(shù)量非常少，這一想法還有待其他研究來證實(shí)。

謝立信院士還指出，由于移植的角膜緣上皮干細(xì)胞細(xì)胞是來源于同種異體，術(shù)后常會(huì)面臨免疫排斥反應(yīng)問題，其主要臨床特征是睫狀充血、角膜周邊部可見環(huán)狀上皮排斥線及上皮缺損區(qū)，角膜緣處大量新生血管充盈、怒張，臨床診斷并不困難。我們統(tǒng)計(jì)免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生率為23.3%。此外，通過臨床共聚焦顯微鏡檢查，我們發(fā)現(xiàn)在角膜緣和角膜上皮缺損部位可見大量朗格漢斯（Langhans）細(xì)胞浸潤(rùn)；還可以通過免疫印跡細(xì)胞學(xué)檢查，觀察到角膜周邊和中央CD4、CD8陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)；經(jīng)抗免疫排斥反應(yīng)藥物（糖皮質(zhì)激素、環(huán)孢素A）治療有效，眼表穩(wěn)定。我們總結(jié)的角膜緣上皮干細(xì)胞移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)病例的文章發(fā)表在2013年第5期的Ophthalmology雜志上。

對(duì)于眼表重建手術(shù)，我們還需要知道的更多，有很多問題要弄清楚，比如干細(xì)胞的臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的制定，這是基礎(chǔ)向臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵；其次要研究移植后干細(xì)胞的去向和新的干細(xì)胞來源；以及隨訪了解移植角膜緣干細(xì)胞的功能究竟是短期還是長(zhǎng)期的等諸多問題。這些科學(xué)問題都需要我們開展大量的臨床和基礎(chǔ)工作以進(jìn)一步研究論證。

如何進(jìn)行高效的科研？

針對(duì)怎樣創(chuàng)造科研高效率的問題，謝院士表示，要先在臨床上把科學(xué)問題提出來，然后在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行應(yīng)用基礎(chǔ)研究，有了應(yīng)用基礎(chǔ)研究結(jié)果，再與臨床問題結(jié)合，進(jìn)行驗(yàn)證和總結(jié)后，投到比較有影響力的學(xué)術(shù)刊物上。也就是說，首先要善于發(fā)現(xiàn)臨床醫(yī)學(xué)中的科學(xué)問題，然后組織科研團(tuán)隊(duì)進(jìn)行有目的的集中研究，發(fā)現(xiàn)科學(xué)證據(jù)后，再迅速向臨床轉(zhuǎn)化，同時(shí)要重視轉(zhuǎn)化后的臨床效果、評(píng)價(jià)及推廣。

我們團(tuán)隊(duì)目前參與了一項(xiàng)973計(jì)劃，里面有一只很大的“攔路虎”，就是關(guān)于同種異體來源的干細(xì)胞移植安全和標(biāo)準(zhǔn)的問題。我國(guó)相關(guān)部門對(duì)此研究的審批過程非常嚴(yán)格，難度很大。如果應(yīng)用自體的干細(xì)胞移植較為容易，用自體口腔黏膜可以重建結(jié)膜囊，但要重建結(jié)膜上皮，恢復(fù)眼表的功能還需解決很多問題。而且，如果我們只能使用患者很少的一點(diǎn)自體干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，就必須要有工程化技術(shù)手段來解決，因此需要細(xì)胞生物學(xué)專家?guī)椭覀兘鉀Q這個(gè)問題。要把臨床應(yīng)用再次出現(xiàn)的問題逐一解決，這就帶來了很多后續(xù)研究，而這些研究不僅需要國(guó)家自然科學(xué)基金，還需要國(guó)家973等大項(xiàng)目的支持。

北京同仁醫(yī)院王寧利教授表示，現(xiàn)在學(xué)術(shù)界注重的是看成果對(duì)本行業(yè)發(fā)展的引領(lǐng)作用，謝院士的文章都是在Ophthalmology、Iovs、Ajo等眼科頂尖雜志發(fā)表，其中有的是作為封面文章發(fā)表。臨床問題驅(qū)動(dòng)型科研是當(dāng)前很重要的研究方式。我們呼喚“在思考中開刀，在開刀中思考”的醫(yī)生。

謝立信院士就是從臨床問題提練出科學(xué)問題，從科學(xué)問題、技術(shù)問題，找出假說再去驗(yàn)證。如果我們從角膜緣殘留的細(xì)胞中找出干細(xì)胞，讓它去擴(kuò)增成為移植的來源，這可能是最理想的干細(xì)胞獲取方式。但對(duì)于完全沒有自體干細(xì)胞的患者來說，如何獲得干細(xì)胞是眼科人亟需解決的問題。這個(gè)問題已超越眼科，成為一個(gè)大科學(xué)問題，需要統(tǒng)籌安排。endprint