八角蓮中鬼臼毒素的含量測定技術(shù)

孫海峰

【摘要】目的：建立高效液相色譜法測定八角蓮中鬼臼毒素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱為Diamonsiltm C18柱；流動相：甲醇-0.1mol/L磷酸二氫鉀水溶液（50∶50）；流速：1.0ml/min；檢測波長：290nm。結(jié)果：鬼臼毒素在0.04769～0.4769mg/ml呈良好線性關(guān)系（r=0.9996），平均回收率為99.94%，RSD=1.71%（n=5）。結(jié)論：采用高效液相色譜法測定八角蓮中鬼臼毒素的含量，操作簡便、準確，專屬性強。

【關(guān)鍵詞】八角蓮；鬼臼毒素；含量測定

八角蓮為小檗科植物八角蓮Dysosma versipellis（Hance.）M. cheng（Podophyllum versipelle Hance.）的根及根莖。具有清熱解毒、化痰散結(jié)、祛痰消腫之功能。用于癰腫疔瘡、瘰疬、咽喉腫痛、跌打損傷、毒蛇咬傷等。筆者曾對八角蓮的性狀、顯微結(jié)構(gòu)進行過研究[1]。本實驗采用高效液相色譜法測定八角蓮中鬼臼毒素的含量，為完善八角蓮藥材的質(zhì)量標準及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1、儀器與試藥

1.1儀器

戴安UltiMateTM3000型高效液相色譜儀，包括四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器、變色龍（chromeleon）軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；島津AUW120D分析天平（d=0.1mg/0.01mg）；UP5200H超聲波清洗器（熊貓集團南京 電子 計量有限公司）。

1.2試藥

甲醇為色譜純（中國上海陸都化學(xué)試劑廠）；磷酸二氫鉀為分析純。鬼臼毒素對照品（含量測定用，以93.5%計，批號111645-200301）由中國藥品生物制品檢定所提供；八角蓮Dysosma versipellis（Hance.）M.Cheng（Podophyllum versipelle Hance.），由中南民族大學(xué)萬定榮教授鑒定和提供。

2、方法與結(jié)果

2.1色譜條件

Diamonsiltm C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為甲醇-0.1mol/L磷酸二氫鉀（50∶50）；檢測波長290nm；流速1.0ml/min；柱溫30℃；靈敏度：0.1AUFS；理論塔板數(shù)按鬼臼毒素峰計算不低于1500。

2.2對照品溶液的制備

精密稱取在五氧化二磷干燥器中減壓干燥12h的鬼臼毒素對照品適量，加甲醇制成每毫升約含0.5mg的溶液，搖勻，微孔濾膜過濾（0.45μm），得鬼臼毒素對照品溶液。

2.3供試品溶液的制備

分別取八角蓮根莖和根粉末（過3號篩）各約0.5g，精密稱取，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，放置12h，稱定重量，超聲處理30min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，微孔濾膜過濾（0.45μm），得八角蓮根莖和根的供試品溶液。

2.4八角蓮根莖和根HPLC譜圖比較

分別取八角蓮根莖和根供試品溶液10μl，注入高效液相色譜儀中，對其HPLC圖進行比較，比較可以看出，八角蓮根中基本不含鬼臼毒素成分。

2.5線性關(guān)系考察

精密稱取在五氧化二磷干燥器中減壓干燥12h的鬼臼毒素對照品25.5mg，置50ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻（0.51×93.5%=0.4769mg/ml），精密量取溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml，分別置10ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標，鬼臼毒素含量為橫坐標，繪制標準曲線，統(tǒng)計學(xué)計算回歸方程為：Y=0.01108X+8.6782×10-3，r=0.9996。結(jié)果表明，鬼臼毒素的進樣量在0.04769～0.4769mg/ml的范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好。

2.6精密度實驗

精密吸取鬼臼毒素對照品溶液10μl，按上述色譜條件，連續(xù)進樣5次，依次測定各峰的峰面積值，結(jié)果鬼臼毒素對照品RSD=0.24%，表明儀器精密度良好。

2.7穩(wěn)定性實驗

精密吸取密封室溫保存的八角蓮根莖供試品溶液10μl，分別于0，2，5，8，10h進樣，測定其峰面積值，計算RSD=0.84%（n=3），結(jié)果表明，供試品溶液在10h內(nèi)檢測對結(jié)果無影響，穩(wěn)定性良好。

2.8重現(xiàn)性實驗

取同一批八角蓮根莖樣品，按供試品溶液制備方法平行制備5份供試液，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，測定5份供試品中鬼臼毒素的含量，結(jié)果RSD=1.50%。

2.9樣品測定

取3批八角蓮根莖樣品，按供試品溶液制備方法操作，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，用外標法測定，計算樣品中鬼臼毒素的含量。

2.10加樣回收率實驗

取已知含量的八角蓮根莖樣品5份，各約0.25g，精密稱定，分別加入鬼臼毒素對照品2.55mg（2.55×93.5%=2.3843mg），按供試品溶液制備方法操作，照上述色譜條件測定，計算回收率，結(jié)果平均回收率為99.94%，RSD=1.71%。

3、討論

3.1八角蓮中鬼臼毒素的含量與提取方法有關(guān)

八角蓮的有效成分為鬼臼毒素，有文獻報道八角蓮經(jīng)80%甲醇超聲提取，測得鬼臼毒素的含量為0.94%，采用文中所用的甲醇超聲提取測得鬼臼毒素的含量為1.01%，結(jié)果表明，八角蓮中鬼臼毒素的含量可能與提取溶劑、方法等有一定關(guān)系，值得進一步研究。

3.2八角蓮根中基本不含鬼臼毒素

通過比較八角蓮根與根莖的HPLC圖可以看出，八角蓮根中基本不含鬼臼毒素，實驗結(jié)果表明，主要是八角蓮的根莖具有鬼臼毒素的抗癌抗病毒活性。

本法測定八角蓮中鬼臼毒素的含量，樣品預(yù)處理簡單，有效成分分離良好，而且無其他成分干擾，對八角蓮藥材的質(zhì)量控制有一定的參考價值。

參考文獻

[1]陳黎，涂自良，陳吉炎.高效液相色譜法測定八角蓮中鬼臼毒素的含量.論文網(wǎng)，2011.08