有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽1B1基因多態(tài)性和利福平血藥濃度對肝毒性的影響

鄧國防 孫麗珍 詹森林 李巍 吳于青 鄧群 雷建平 余少良

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·論著·

有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽1B1基因多態(tài)性和利福平血藥濃度對肝毒性的影響

鄧國防 孫麗珍 詹森林 李巍 吳于青 鄧群 雷建平 余少良

目的 觀察有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽1B1(OATP1B1，又稱編碼基因SLCO1B1)A388G基因多態(tài)性和利福平血藥濃度對肝臟毒性的影響。方法 選擇2013年9月至2014年3月來自深圳市第三人民醫(yī)院住院或門診接受治療的漢族患者，服用含利福平藥物肝功能異常的肺結(jié)核患者(簡稱“異常組”)和服用含利福平藥物肝功能正常的肺結(jié)核患者(簡稱“正常組”)各30例，其中正常組：男19例，女11例，平均年齡(37.70±11.78)歲；異常組：男21例，女9例，平均年齡(38.60±11.56)歲。分別進(jìn)行OATP1B1A388G基因分型和利福平血藥濃度檢測，使用GraphPad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，采用χ2檢驗(yàn)比較正常組與異常組的等位基因頻率差異，以t檢驗(yàn)比較正常組與異常組利福平血藥濃度差異，P<0.05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果 正常組患者OATP1B1A388G基因rs2306283位點(diǎn)基因頻率分布A：36.7% (22/60)，G：63.3% (38/60)，異常組A：23.3% (14/60)，G：76.7% (46/60)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.54，P>0.05)；正常組患者利福平血藥濃度檢測結(jié)果為(69.36±28.85) mg/L，異常組為(33.20±19.88) mg/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.16，P<0.05)。結(jié)論 OATP1B1A388G基因多態(tài)性分布與服用含利福平藥物的肝毒性無明顯相關(guān)，而利福平血藥濃度與肝毒性呈明顯相關(guān)，應(yīng)加強(qiáng)對利福平血藥濃度監(jiān)測，降低患者肝毒性。

有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)子； 多態(tài)性,單核苷酸； 利福平； 血藥濃度； 藥物性肝損傷

有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽1B1(organic anion transporting polypeptide，OATP1B1)是肝臟重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之一，它能從血液中攝取多種物質(zhì)進(jìn)入肝細(xì)胞[1]。作為一種重要的肝臟攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體，參與多種內(nèi)源性物質(zhì)及利福平、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)抑制劑、內(nèi)皮素受體拮抗劑環(huán)五肽BQ123(-D-Asp-L-Pro-D Val L-Leu-D Trp-)等藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)[2]。有研究表明，OATP1B1存在遺傳多態(tài)性，具有某些等位基因的OATP1B1的轉(zhuǎn)運(yùn)能力降低，會對多種藥物的藥物代謝動力學(xué)(簡稱“藥代動力學(xué)”)及藥物效應(yīng)動力學(xué)(簡稱“藥效學(xué)”)過程產(chǎn)生影響，OATP1B1基因多態(tài)性與藥物的不良反應(yīng)及藥物相互作用有關(guān)[3-4]。利福平是常用的一線抗結(jié)核藥物，具有較大的肝細(xì)胞毒性，聯(lián)合異煙肼和吡嗪酰胺等藥物抗結(jié)核治療，約40.4%引起肝損傷，肝功能損傷出現(xiàn)時間多數(shù)為用藥后1～3個月[5]。利福平作為OATP1B1的特異性底物，主要通過肝細(xì)胞膜表面OATP1B1轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)[6-7]。那么，是否利福平肝毒性與OATP1B1介導(dǎo)的肝臟中利福平藥物濃度密切相關(guān)？為闡述OATP1B1(又稱“編碼基因SLCO1B1”)A388G基因多態(tài)性、利福平血藥濃度及肝毒性之間的相關(guān)性，本研究對這一問題進(jìn)行了探討。

材料和方法

一、材料

1.納入標(biāo)準(zhǔn)：初治肺結(jié)核患者，均為發(fā)病期間在深圳市第三人民醫(yī)院住院或門診接受治療的患者；抗結(jié)核方案為：2HRZE/4HR。入組時肝功能均正常。既往無肝炎發(fā)作史，并排除病毒性肝炎、肝結(jié)核、酒精性肝病、脂肪肝、自身免疫其他感染性疾病等，抗結(jié)核治療前1個月及治療過程中未服用其他損傷肝臟的藥物。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有入組研究對象均簽署知情同意書。

2.患者資料和分組：收集2013年9月至2014年3月來自深圳市第三人民醫(yī)院住院或門診接受治療的漢族患者共60例?；颊咴诳菇Y(jié)核治療中肝功能保持正常者為正常組，在抗結(jié)核治療中出現(xiàn)肝功能異常者為異常組。肝功能正?；颊?0例，其中男19例，女11例，平均年齡(37.70±11.78)歲。肝功能異?；颊?0例，其中男21例，女9例，平均年齡(38.60±11.56)歲。正常組與異常組的性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.30，P>0.05；F=0.13，P>0.05)。

3.診斷標(biāo)準(zhǔn)：初治肺結(jié)核患者的診斷均符合2001年中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會制定的《肺結(jié)核診斷和治療指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；藥物性肝損傷的診斷按照Roussel Uclaf因果關(guān)系評價法(the Roussel Uclaf causality assessment method，RUCAM)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。

4.儀器、試劑與藥品：全血DNA抽提試劑盒(QIAamp DNA blood mini kit)購自德國Qiagen公司，等位基因分型試劑購自美國ABI公司，Nanodrop紫外分光光度計為美國Agilent公司產(chǎn)品，7500實(shí)時熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品，其他實(shí)驗(yàn)耗材購自Axygen公司。Agilent 1100 高效液相色譜儀，包括DE14918851型四元泵、DE14919131型自動進(jìn)樣器、JP2017368型紫外檢測器、DE14927936型柱溫控制箱、Sorvall Pico型高速離心機(jī)、MSl Minishaker型振蕩器(德國Mandel 科學(xué)公司產(chǎn)品)，G&G型電子天平、BP221S型1/10 000分析天平(最大值=220 g)、津騰GM-1.00隔膜真空泵、利福平標(biāo)準(zhǔn)品(編號130496)均購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇(色譜純)：德國Merck公司，色譜純，批號為1719107349；甲酸(分析純)：西隴化工股份有限公司，分析純，批號為120428-I。

二、方法

(一)基因分型

1. 提取基因組DNA：采集肝素鋰抗凝的外周血2.0 ml，使用全血DNA抽提試劑盒獲取基因組DNA，操作按照說明書進(jìn)行。取DNA樣本2 μl，用紫外分光光度計測定DNA純度和濃度，提取出DNA后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.rs2306283位點(diǎn)引物設(shè)計：采用7500實(shí)時熒光定量PCR儀隨機(jī)軟件Primer Express 3.0進(jìn)行引物和探針的設(shè)計。針對rs2306283位點(diǎn)等位基因設(shè)計2條探針，分別采用VIC[綠色熒光蛋白(GFP)最初是從維多利亞多管發(fā)光水母(學(xué)名：Aequoreavictoria)中分離出來的結(jié)構(gòu)蛋白，故簡稱“VIC”]和羧基熒光素(FAM)進(jìn)行熒光標(biāo)記。所有引物均由上海Invitrogen公司合成。

3.rs2306283位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymophism，SNP)分型：逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)，反應(yīng)體系為10 μl，其中包含2×TaqMan等位基因分型Mix 5 μl，40×引物探針混合液0.25 μl，DNA 2 μl，ddH2O 2.75 μl。RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋簲U(kuò)增條件95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。

4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定：rs2306283 SNP位點(diǎn)的兩個等位基因A和G的探針分別采用VIC和FAM熒光素進(jìn)行標(biāo)記。樣本為等位基因A的純合子時，PCR擴(kuò)增過程中僅能檢測到VIC熒光；樣本為等位基因G的純合子時，PCR擴(kuò)增過程中僅能檢測到FAM熒光；樣本為雜合子時，PCR擴(kuò)增過程中可同時檢測到FAM和VIC兩種熒光。

(二)血藥濃度檢測

1. 色譜條件：采用液相色譜柱(熱電公司Thermo集團(tuán)；4.6 mm×200 mm，5 μm)；流動相：0.5 mmol磷酸二氫銨溶液-甲醇(磷酸二氫銨溶液∶甲醇=25∶75)，pH=6.1；柱溫：25 ℃；流率: 1.3 ml/min；檢測波長: 340 nm。

2. 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：精密稱取利福平對照品20 mg置于10 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，質(zhì)量濃度為2 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，冷藏保存。

3. 血漿樣品處理：取血漿樣本0.2 ml，置1.5 ml離心管中，加入0.4 ml甲醇沉淀蛋白，渦旋振蕩30 s；2000×g離心10 min，吸取上清液20 μl進(jìn)樣。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析由GraphPad Prism 5軟件統(tǒng)計完成，采用χ2檢驗(yàn)比較正常組與異常組的等位基因頻率差異，進(jìn)一步計算各等位基因與肝毒性發(fā)生的比值比(OR值)和95%可信區(qū)間(95%CI)。采用t檢驗(yàn)比較正常組與異常組利福平血藥濃度差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、OATP1B1A388G等位基因(rs2306283)位點(diǎn)TaqMan分型結(jié)果

TaqMan技術(shù)可以對OATP1B1A388G基因rs2306283位點(diǎn)進(jìn)行有效等位基因分型，該位點(diǎn)具有A和G兩種等位基因，包括AA型、AG型和GG型共3種基因型。

二、兩組OATP1B1A388G基因rs2306283位點(diǎn)等位基因頻率的比較：正常組A、G等位基因頻率分別為 36.7%(22/60)、66.3%(38/60)，異常組A、G等位基因頻率分別為23.3%(14/60)、76.7%(46/60)，在兩組人群中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.54，P>0.05)(表1)。

三、 正常組和異常組RFP血藥濃度比較

結(jié)果顯示，正常組患者利福平血藥濃度檢測為(69.36±28.85) mg/L，異常組(33.20±19.88) mg/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.16，P<0.05)。

討 論

OATP1B1是最重要的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體之一。它主要表達(dá)于人肝細(xì)胞膜基底外側(cè)，負(fù)責(zé)膽紅素的吸收[10]。最近研究表明，利福平的肝毒性機(jī)制是干擾膽紅素和葡萄糖醛酸結(jié)合及排泄從而升高血清膽紅素所致[11]，尤其是膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因多態(tài)性與利福平的肝毒性密切相關(guān)[12]。

一、OATP1B1A388G位點(diǎn)等位基因表達(dá)與利福平肝毒性相關(guān)性

已證實(shí)OATP1B1A388G存在基因多態(tài)性，本研究的檢測數(shù)據(jù)顯示，在同漢族人種家族中，利福平肝毒性與OATP1B1A388G基因位點(diǎn)等位基因多態(tài)性無明顯相關(guān)性，這和Li 等[13]的報道相似。有文獻(xiàn)報道，在亞組分析中，單體型與膽汁淤積型或混合型肝損傷密切相關(guān)(P=0.03，OR=2.31，95%CI=1.06～5.02)。結(jié)果表明：單體型是利福平誘導(dǎo)肝損傷的一個很重要的因素[11]。李靈敏等[14]報道，OATP1B1A388G基因位點(diǎn)與抗結(jié)核藥物肝損傷無相關(guān)性，OATP1B1T521C基因位點(diǎn)與抗結(jié)核藥物肝損傷存在相關(guān)性，其可能成為抗結(jié)核藥肝損傷風(fēng)險預(yù)測的候選基因。但是否還存在其他OATP1B1位點(diǎn)等位基因表達(dá)，需要進(jìn)一步研究。

表1 兩組患者rs2306283位點(diǎn)等位基因頻率、基因型分布的結(jié)果分析

二、利福平血藥濃度與肝毒性相關(guān)性

利福平作為OATP1B1的特異性底物，主要通過肝細(xì)胞膜表面OATP1B1轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)。有報道，若無肝臟基礎(chǔ)疾病時，利福平血藥濃度低，肝毒性大，血藥濃度高，肝毒性小[15]。而本研究檢測結(jié)果也證實(shí)了這一結(jié)論。提示利福平肝毒性與OATP1B1介導(dǎo)的肝臟中利福平藥物濃度有密切關(guān)系，對評估患者利福平潛在肝毒性可能有一定的臨床預(yù)警作用。推測產(chǎn)生這種現(xiàn)象原因可能為OATP1B1A388G基因突變導(dǎo)致OATP1B1對利福平的攝取轉(zhuǎn)運(yùn)能力減弱，利福平經(jīng)OATP1B1攝取進(jìn)入肝臟的量相對較少，致使利福平的血藥濃度相對增加，肝毒性發(fā)生率相對降低。相反，未發(fā)生突變患者OATP1B1對利福平的攝取轉(zhuǎn)運(yùn)能力較強(qiáng)，利福平經(jīng)OATP1B1攝取進(jìn)入肝臟的量相對較多，致使利福平的血藥濃度相對減少，肝毒性發(fā)生率相對增高。今后應(yīng)進(jìn)行這方面的研究和關(guān)注，以進(jìn)一步解釋此結(jié)論。

三、利福平血藥濃度檢測的意義

利福平血藥濃度檢測為臨床利福平的有效合理應(yīng)用和藥物不良反應(yīng)時的監(jiān)測提供了參考依據(jù)，對臨床治療具有指導(dǎo)意義。筆者認(rèn)為，若無肝臟基礎(chǔ)疾病且肝功能在正常范圍內(nèi)，依據(jù)利福平血藥濃度水平可指導(dǎo)臨床對患者給藥劑量個體化，以達(dá)到最佳治療效果。有因抗結(jié)核藥物濃度不足導(dǎo)致治療失敗甚至產(chǎn)生耐藥的文獻(xiàn)報道。因此，進(jìn)行利福平治療藥物監(jiān)測是優(yōu)化患者實(shí)施個體化治療的重要策略[16]。當(dāng)服藥后患者肝功能出現(xiàn)異常，若檢測出利福平血藥濃度低，提示利福平所致肝毒性可能性大，建議減少利福平使用劑量或停用，以免肝損傷繼續(xù)加重；若檢測出利福平血藥濃度高，提示非利福平藥物所致肝毒性可能性大，建議減少非利福平藥物使用劑量或停用，以免肝損傷繼續(xù)加重。當(dāng)服藥后患者肝功能正常，若檢測出利福平血藥濃度低，則提示利福平使用劑量不足，應(yīng)加大治療劑量；若檢測出利福平血藥濃度高，則提示利福平使用劑量充足。

顯然，按常規(guī)劑量給藥時，由于年齡、肝臟疾病、不同廠家不同批號的藥物生物利用度不同等多種因素都能影響血藥濃度，故對服用利福平的患者進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測，則可根據(jù)監(jiān)測結(jié)果調(diào)整給藥劑量，既減少肝毒性，又保證血藥濃度，從而提高結(jié)核病的治愈率，減少復(fù)發(fā)率，降低抗結(jié)核藥物的不良反應(yīng)[17]。然而，目前國內(nèi)并沒有要求對利福平常規(guī)進(jìn)行TDM，主要原因是很多醫(yī)院及防治機(jī)構(gòu)缺乏檢測TDM相關(guān)設(shè)備和專業(yè)人員、檢測流程繁瑣而且沒有標(biāo)準(zhǔn)化、專業(yè)跨學(xué)科等，制約了TDM技術(shù)的廣泛開展和應(yīng)用。

由于本研究樣本數(shù)量偏少，實(shí)驗(yàn)方法及設(shè)計存在不足之處。OATP1B1A388G基因多態(tài)性、利福平血藥濃度與患者肝毒性、臨床療效的相關(guān)性仍需深入地進(jìn)行臨床大樣本對照研究，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)OATP1B1A388G基因突變和521T1C位點(diǎn)的研究及檢測，為指導(dǎo)臨床應(yīng)用利福平個體化提供依據(jù)。

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(本文編輯：王然 薛愛華)

中國防癆協(xié)會第十一屆理事會名單(2015年)

理 事 長 劉劍君

副理事長 許紹發(fā) 洪 峰 王黎霞 王栩冬 張宗德 鐘 球 袁政安

秘 書 長 成詩明

常務(wù)理事 (按姓氏筆劃為序)萬利亞 馬永成 王 毳 王衛(wèi)華 王國治 王栩冬 王曉萌 王新倫 王黎霞 尹秋蓮 白麗瓊 成詩明 邢 進(jìn) 劉飛鷹 劉劍君 許紹發(fā) 李發(fā)斌 楊應(yīng)周 肖和平 吳紅輝 吳建林 邱林西 何 健 張 娟 張 雷 張山鷹 張廣宇 張?zhí)烊A 張宗德 陳日華 易 星 金 奇 趙雁林 查 舜 鐘 球 胡代玉 洪 峰 姚 嵩 賀曉新 袁政安 袁燕莉 顧 清 徐 飚 高大川 高方方 蔣仁生 曹國希 曹繼平 傅衍勇

理事名單 (按姓氏筆劃為序)刁琳琪 于景來 萬利亞 馬永成 王 琳 王 毳 王衛(wèi)華 王仲元 王國治 王春花 王春雷 王桂林 王栩冬 王曉林 王曉萌 王甦民 王新倫 王黎霞 尹秋蓮 鄧 平 鄧海巨 葉建君 付春生 白麗瓊 蘭克濤 邢 進(jìn) 達(dá) 瓦 成詩明 畢利軍 朱磷揚(yáng) 任育麟 劉 勇 劉 暉 劉 新 劉飛鷹 劉風(fēng)林 劉存旭 劉劍君 劉曉清 劉錦程 劉新文 閆興錄 許紹發(fā) 紀(jì)濱英 嚴(yán)曉峰 杜昌廷 李 琦 李 鋒 李 震 李長裕 李月華 李發(fā)斌 李尚倫 李樹民 李登瑞 楊應(yīng)周 楊 文 楊樞敏 楊國儒 肖和平 肖寶榮 肖艷文 吳紅輝 吳建林 吳琍敏 吳雪瓊 邱林西 何 健 鄒 錚 沈 鑫 初乃惠 張 青 張 娟 張 雷 張 慧 張山鷹 張廣宇 張?zhí)烊A 張文龍 張國龍 張佩如 張宗德 張鐵娟 張聯(lián)英 陸 偉 陸敬儒 陳日華 陳明亭 陳根旺 邵世峰 范月玲 范為民 范永德 林 玫 林淑芳 卓 瑪 易 星 金 奇 周 杰 周 琳 周繼如 鄭蓉蓉 趙雁林 胡 林 胡代玉 查 舜 鐘 球 侯雙翼 饒 英 施軍衛(wèi) 姜洪波 洪 峰 姚 嵩 姚榮衛(wèi) 賀曉新 袁政安 袁燕莉 顧 清 顧曉明 徐 飚 高大川 高方方 高孟秋 高鐵杰 唐細(xì)良 唐曉勇 蒲 江 梅 建 曹文利 曹國希 曹繼平 崔穎杰 彭東東 董紅軍 蔣仁生 蔣健敏 傅衍勇 雷世光 鮑務(wù)新 藺 剛 鮮小萍 譚守勇 熊昌富 薛愛華 戴憲法

Effects of organic anion transporting polypeptide 1B1 polymorphism and plasma concentration of rifampicin on liver injury

DENGGuo-fang,SUNLi-zhen,ZHANSen-lin,LIWei,WUYu-qing,DENGQun,LEIJian-ping,YUShao-liang.
PulmonaryDepartmentTwo,ShenzhenThirdPeople’sHospital,Shenzhen518112,China.

SUNLi-zhen,Email：slz0311@yeah.net

Objective To observe the effects of organic anion transporting polypeptide 1B1 (OATP1B1, encoded by SLCO1B1)A388Gpolymorphism and the plasma concentration of rifampicin on drug (rifampicin)-induced liver injury. Methods Thirty pulmonary tuberculosis patients with drug (rifampicin)-induced liver injury (abnormal group), and 30 pulmonary tuberculosis patients without drug (rifampicin)-induced liver injury (normal group) treated with antituberculous regimen containing rifampicin were recruited from the third people’s Hospital of Shenzhen inpatients or outpatients of Han nationality from September 2013 to March 2014. In the normal group, there were 19 males and 11 females, with average age (37.70±11.78) years. In the abnormal group, 21 males and 9 females, with average age (38.60±11.56) years. TaqMan probe was designed and real-time PCR was used to detect OATP1B1A388Ggenotype polymorphism. The plasma concentration of rifampicin was detected by high perfor-mance liquid chromatography (HPLC)．Using GraphPad Prism 5 software for statistical analysis. Usingχ2test compared allelic gene frequency difference and usingt-test compared rifampicin blood drug concentration difference between the normal group and abnormal group.P<0.05 was considered statistically significant. Results OATP1B1A388Ggenotypes existed allele frequency A：36.7% (22/60)，G：63.3% (38/60) in normal group and A：23.3% (14/60)，G：76.7% (46/60) in abnormal group. The difference was not statistically significant between abnormal group and normal group(χ2=2.54，P>0.05). The plasma concentration of rifampicin was (69.36±28.85) mg/L in normal group,(33.20±19.88) mg/L in abnormal group, the difference was statistically significant (t=13.16，P<0.05). Conclusion OATP1B1A388Ggene polymorphism is not associated with drug (rifampicin)-induced liver injury, and the plasma concentration of rifampicin is significantly associated with drug (rifampicin)-induced liver injury. In order to reduce drug (rifampicin)-induced liver injury, the plasma concentration of rifampicin should be monitored.

Organic anion transporters； Polymorphism,single nucleotide； Rifampin； Plasma concentration； Drug-induced liver injury

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.09.004

江西省自然科學(xué)基金(20132BAB205013)

518112 廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳市第三人民醫(yī)院肺二科(鄧國防、孫麗珍、詹森林)，藥劑科(李巍)；江西省胸科醫(yī)院結(jié)核科(吳于青、鄧群、雷建平)，心內(nèi)科(余少良)

注：鄧國防與孫麗珍對本研究具有同等貢獻(xiàn)為并列第一作者

孫麗珍，Email：slz0311@yeah.net

2015-06-23)