促紅細(xì)胞生成素對(duì)大鼠肢體缺血再灌注后腎血流的影響

劉彩樹 李為朋 閆合燕 張亞萍 蔡森 門秀麗 孔小燕 李宏杰

促紅細(xì)胞生成素對(duì)大鼠肢體缺血再灌注后腎血流的影響

劉彩樹 李為朋 閆合燕 張亞萍 蔡森 門秀麗 孔小燕 李宏杰△

目的探討促紅細(xì)胞生成素（EPO）對(duì)大鼠肢體缺血再灌注（LIR）后腎血流的影響及可能作用機(jī)制。方法30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為Control組、LIR組和EPO+LIR組，每組10只；檢測(cè)各組動(dòng)物腎血流量、血漿肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）含量、腎組織濕干比（W/D）、NO、一氧化氮能合成酶（NOS）及內(nèi)皮素-1（ET-1）含量，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腎組織細(xì)胞間黏附分子（ICAM-1）和血管細(xì)胞黏附分子（VCAM-1）的表達(dá)，光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果LIR組較Control組腎血流量減少，血漿Cr、BUN、腎組織W/D、NO、ET-1、NOS活性、ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)增高(P＜0.05)，鏡下可見腎組織間隙增寬和炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變。EPO+LIR組較LIR組腎血流量增加，血漿Cr、BUN、腎組織W/D、NO、ET-1和NOS活性、ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)均降低(P＜0.05)，腎組織病理學(xué)變化有所減輕。結(jié)論EPO可改善LIR后大鼠的腎功能，增加腎血流量，其機(jī)制可能與減輕腎水腫、調(diào)節(jié)腎血管舒縮功能、減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。

再灌注損傷;四肢;腎血漿流量,有效;紅細(xì)胞生成素；大鼠,Sprague-Dawley；疾病模型,動(dòng)物

肢體缺血再灌注損傷（limb ischemia reperfusion,LIR）可對(duì)缺血肢體及遠(yuǎn)隔器官造成損傷，腎臟是最易受累的器官之一[1]。研究表明，促紅細(xì)胞生成素（EPO）可減輕腎移植后的缺血再灌注損傷[2]。本研究旨在觀察LIR后大鼠腎血流的變化，探討EPO預(yù)處理對(duì)大鼠LIR后腎血流的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量（250±20）g，購(gòu)自北京華普康生物科技股份有限公司（SCXK京2009-0004）。人重組促紅細(xì)胞生成素（rhEPO）由沈陽(yáng)三生制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，NO、一氧化氮合成酶（NOS）及內(nèi)皮素-1 （ET-1）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。細(xì)胞間黏附分子（ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子（VCAM-1）單克隆抗體、PV6001/6002二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒及濃縮二氨基聯(lián)苯胺（DAB）試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物分組及給藥30只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組10只。（1）LIR組。參考文獻(xiàn)[3]方法制作大鼠LIR模型，乙醚麻醉下將大鼠的雙后肢根部用橡皮帶環(huán)繞結(jié)扎，阻斷血流4 h，恢復(fù)血流灌注4 h后處死，從腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心20 min，取血漿，Eppendorf管分裝，-70℃保存。取一部分左側(cè)腎臟，冷生理鹽水（NS）沖洗干凈，濾紙吸干后放入4％中性甲醛固定，其余放入液氮速凍后，-70℃保存。（2）Control組。動(dòng)物松弛結(jié)扎雙后肢但不阻斷血流，其余操作同LIR組。（3）EPO+LIR組。于再灌注前30 min腹腔注射用NS配制的EPO 3 000 U/kg，其余操作同LIR組。LIR組和Control組亦在再灌注前30 min腹腔注射等量NS。

1.3 觀察指標(biāo)（1）于再灌注4 h用激光多普勒灌注監(jiān)測(cè)儀及Perisoft for Windows軟件實(shí)時(shí)記錄各組腎血流灌注量的變化。（2）全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血漿肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）含量。（3）取-70℃凍存的腎組織依試劑盒說明書測(cè)定NO、NOS、ET-1含量。（4）稱取0.1 g腎組織于60℃烘干72 h，計(jì)算濕干重比值(W/D)。（5）經(jīng)4％中性甲醛固定的腎組織，石蠟包埋、切片后，用免疫組織化學(xué)法及北航自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定VCAM-1和ICAM-1蛋白平均光密度（OD）值。HE染色后觀察組織的病理學(xué)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血漿Cr、BUN、W/D及腎血流量的比較見表1。LIR組較Control組腎血流量降低（P＜0.05），BUN、Cr和W/D升高（P＜0.05）；EPO+LIR組腎血流量低于Control組而高于LIR組，BUN、Cr和W/D高于Control組而低于LIR組（P＜0.05）。

Tab.1 Comparison of renal blood flow,BUN,Cr and W/D ratios of renal tissue between three groups表1 各組腎血流量、BUN、Cr和W/D比較（n=30，±s）

Tab.1 Comparison of renal blood flow,BUN,Cr and W/D ratios of renal tissue between three groups表1 各組腎血流量、BUN、Cr和W/D比較（n=30，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，a與Control組比較，b與LIR組比較，P＜0.05；表2、3同；Pu指單位時(shí)間內(nèi)檢測(cè)到的血細(xì)胞數(shù)與血流速的乘積

組別Control組LIR組EPO+LIR組F腎血流量(pu) 274.55±26.55 162.67±13.37a215.99±19.75ab450.348＊＊BUN(mmol/L) 5.47±0.59 12.32±2.78a8.17±1.06ab174.703＊＊Cr(μmol/L) 32.89±5.28 70.12±8.47a56.54±6.21ab258.657＊＊W/D 2.43±0.11 3.57±0.18a2.99±0.14ab148.771＊＊

2.2 各組腎組織NO、NOS、ET-1比較LIR組NO、iNOS、tNOS和ET-1較Control組升高（P＜0.05）；EPO+LIR組NO、iNOS和tNOS、ET-1高于Control組而低于LIR組（P＜0.01），見表2。

Tab.2 Values of NO,iNOS,tNOS and ET-1 of renal tissue in three groups表2 各組NO、iNOS、tNOS和ET-1含量（n=30，±s）

Tab.2 Values of NO,iNOS,tNOS and ET-1 of renal tissue in three groups表2 各組NO、iNOS、tNOS和ET-1含量（n=30，±s）

組別Control組LIR組EPO+LIR組F NO （μmol/g）1.76±0.47 2.59±0.28a2.08±0.35ab58.148＊＊iNOS （U/mg）1.48±0.29 4.59±0.57a2.73±0.33ab628.473＊＊tNOS （U/mg）3.57±0.44 7.15±0.86a5.24±0.35ab357.941＊＊ET-1 （ng/L) 109.41±14.11 184.77±20.81a136.68±13.44ab203.247＊＊

2.3 腎組織ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)情況Control組可見腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)有ICAM-1和VCAM-1的弱陽(yáng)性表達(dá)；LIR組與Control組相比，ICAM-1和VCAM-1表達(dá)增強(qiáng)；EPO+LIR組ICAM-1 和VCAM-1的表達(dá)比LIR組減弱，但仍比Control組強(qiáng)。各組ICAM-1和VCAM-1表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表3。

Tab.3 Values of average absorbance of ICAM-1 and VCAM-1 in three groups表3 腎臟ICAM-1和VCAM-1的平均OD值（n=10，±s）

Tab.3 Values of average absorbance of ICAM-1 and VCAM-1 in three groups表3 腎臟ICAM-1和VCAM-1的平均OD值（n=10，±s）

組別Control組LIR組EPO+LIR組F ICAM-1 0.135±0.016 0.406±0.025a0.267±0.021ab3 566.327＊＊VCAM-1 0.198±0.031 0.513±0.048a0.324±0.029ab968.896＊＊

2.4 腎組織形態(tài)觀察結(jié)果Control組腎小球無水腫，形態(tài)完整，腎小管管腔開放良好，無狹窄變形和炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腎組織結(jié)構(gòu)基本正常。LIR組腎小球淤血水腫，腎間質(zhì)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，管腔擴(kuò)張。EPO+LIR組較LIR組腎小管上皮細(xì)胞腫脹和炎細(xì)胞浸潤(rùn)所有減輕，見圖1。

3 討論

LIR常見于斷肢再植、肢體擠壓傷、四肢手術(shù)及游離肌瓣轉(zhuǎn)移等術(shù)后的缺血肢體。LIR還會(huì)累及遠(yuǎn)隔器官，甚至造成多器官功能障礙綜合征（MODS），其中腎血流量減少出現(xiàn)最早，進(jìn)而引起腎臟損傷[1]。EPO是一種由腎臟分泌的酸性糖蛋白激素，通過與靶細(xì)胞上的促紅細(xì)胞生成素受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[4]。有研究認(rèn)為，EPO預(yù)處理能顯著改善血流動(dòng)力學(xué)和心肌酶譜，保護(hù)心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)[5]。Genc等[6]在大腦及神經(jīng)元缺血再灌注損傷研究中發(fā)現(xiàn)，EPO能抑制神經(jīng)元凋亡，減少梗死面積，保護(hù)腦組織及神經(jīng)。Moeini等[7]研究顯示，在大鼠的腎臟缺血再灌注前2 h應(yīng)用EPO可減輕大鼠腎臟損傷，但是其對(duì)遠(yuǎn)隔器官肺臟并無保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，LIR組較Control組和EPO+ LIR組腎血流減少，血漿中Cr和BUN含量升高，光鏡下可見基底膜增厚、間隙增寬及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，表明大鼠LIR引發(fā)了遠(yuǎn)隔器官—腎臟的結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙，提示此可能與腎血流量減少有關(guān)。腎血流量減少的可能機(jī)制有：（1）腎組織水腫。LIR組腎組織W/ D較另2組增大，表明腎組織水腫，而水腫液可壓迫腎血管，使腎血流量減少。（2）血管舒縮功能改變。LIR組縮血管物質(zhì)ET-1較另2組增加顯著，雖然具有擴(kuò)血管作用的NO含量及促進(jìn)NO合成的NOS的活性也有所增加，但LIR組NO/ET-1較Control組明顯降低，因此腎血管收縮,腎血流量減少。（3）腎組織ICAM-1和VCAM-1表達(dá)增強(qiáng)。LIR組ICAM-1和VCAM-1均高于另2組，而ICAM-1和VCAM-1可介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附及白細(xì)胞浸潤(rùn)、貼壁，促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生，并增大毛細(xì)血管后阻力，引起腎臟微循環(huán)障礙，降低血液流速，促進(jìn)水腫發(fā)生。

EPO+LIR組與LIR組相比，腎血流量增加，腎臟的結(jié)構(gòu)與功能均明顯改善，表明EPO增加了腎血流量，對(duì)腎臟起到保護(hù)作用。考慮可能機(jī)制有：（1）減輕腎水腫。EPO+LIR組W/D減小，表明腎水腫減輕，提示EPO降低了水腫液對(duì)血管的壓迫，使腎血流量增加。（2）促進(jìn)血管活性物質(zhì)平衡。EPO+LIR組NO、NOS、ET-1較LIR組均降低，但其NO/ET-1比LIR組大，表明EPO可促進(jìn)腎血管舒張，有利于增加腎血流量。（3）減輕炎癥反應(yīng)。EPO+LIR組腎組織ICAM-1和VCAM-1表達(dá)較LIR組減弱，表明EPO可減輕白細(xì)胞貼壁及炎癥反應(yīng)，降低毛細(xì)血管后阻力，改善腎臟微循環(huán)，使腎血流增多，腎功能得以改善。

綜上所述，EPO預(yù)處理可在LIR后對(duì)腎臟起到保護(hù)作用，可為臨床預(yù)防和治療LIR繼發(fā)的腎功能衰竭提供新途徑。

Fig.1 The pathological changes of renal tissue under light microscope（HE×200）圖1 光鏡下腎組織的病理學(xué)改變（HE×200）

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（2013-11-04收稿2014-02-20修回）

（本文編輯陸榮展）

The Influence of Erythropoietin in Renal Blood Flow after Limb Ischemia Reperfusion in Rats

LIU Caishu,LI Weipeng,YAN Heyan,ZHANG Yaping,CAI Sen,MEN Xiuli,KONG Xiaoyan,LI Hongjie Department of Pathophysiology,Basic Medical College of Hebei United University,Tangshan 063000,China LI Hongjie,E-mail:hongrixuan@sina.com

ObjectiveTo investigate the influence and mechanism of erythropoietin(EPO)in renal blood flow after limb ischemia reperfusion(LIR).MethodsThirty male SD rats were randomly divided into control group,LIR group and EPO+LIR group with ten in each group.The values of renal blood flow,plasma creatinine(Cr),urea nitrogen(BUN)content in plasma,kidney tissue wet to dry ratio(W/D),nitric oxide(NO),nitric oxide synthase(NOS)and endothelin-1(ET-1)in renal tissue were detected in three groups.The immunohistochemistry assay was used to detect the expression of intercellular adhesion molecule(ICAM-1)and vascular cell adhesion molecule(VCAM-1)in renal tissue.The morphological changes of renal tissue were observed with light microscope.ResultsThe renal blood flow was significantly decreased,while the values of Cr,BUN,W/D,NO,ET-1,NOS,expressions of ICAM-1 and VCAM-1 was significantly increased in LIR group than those of control group(P＜0.05).Broaden interstitial and infiltration of inflammatory cells were observed in the renal tissue under light microscope.In the EPO+LIR group,the renal blood flow increased,the values of Cr,BUN,W/D,NO,ET-1 and NOS,expressions of ICAM-1 and VCAM-1 decreased significantly compared with those of LIR group(P＜0.05).The pathological changes were alleviated in EPO+LIR group.ConclusionEPO can improve renal function,increase renal blood flow in rats after LIR.The mechanism may be related to the decreased edema,changed renal vasomotor function and decreased inflammation.

reperfusion injury;extremities;renal plasma flow,effective;erythropoietin;rats,Sprague-Dawley;disease models,animal

R363.2；R977.1

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.07.010

河北聯(lián)合大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃資助項(xiàng)目（X2013037）；河北聯(lián)合大學(xué)培育基金項(xiàng)目（LDPYS05，GP201301）

唐山，河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（郵編063000）

△通訊作者E-mail:hongrixuan@sina.com