自噬抑制劑對(duì)乙醇誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化作用的影響

何月賈寶輝劉曼羅文張吉翔△

自噬抑制劑對(duì)乙醇誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化作用的影響

何月1賈寶輝1劉曼2羅文2張吉翔2△

目的觀察自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）對(duì)乙醇誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞（HSC）活化作用，并探討其作用機(jī)制。方法體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6，設(shè)立空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組（乙醇刺激組）、低劑量組（5 mmol/L 3-MA+100 mmol/L乙醇）、高劑量組（10 mmol/L 3-MA+100 mmol/L乙醇）。RT-PCR分析各組HSC活化標(biāo)志蛋白α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)及Ⅰ型膠原基因表達(dá)，Western blot法檢測(cè)各組HSC中自噬水平標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ、α-SMA、Ⅰ型膠原表達(dá)；MTT法檢測(cè)3-MA對(duì)乙醇誘導(dǎo)的HSC增殖的影響。結(jié)果與空白對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組中α-SMA、Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)及LC3Ⅱ表達(dá)量明顯增加（P＜0.05），高劑量組卻顯著減少（P＜0.01）；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，低劑量組和高劑量組中α-SMA、Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)及LC3Ⅱ表達(dá)量逐漸減少（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組中α-SMA、Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)及LC3Ⅱ表達(dá)減少（P＜0.05）。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，加入3-MA處理后的HSC增殖顯著減少（P＜0.05）。結(jié)論3-MA可抑制乙醇誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞中LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)、α-SMA、Ⅰ型膠原mRNA及蛋白的表達(dá)，抑制HSC增殖，且高劑量的作用更明顯。

自噬；乙醇；肝硬化，酒精性；3-甲基腺嘌呤；肌動(dòng)蛋白類；膠原Ⅰ型；肝星狀細(xì)胞

酒精性肝纖維化（alcoholic liver fibrosis，ALF）是長(zhǎng)期過(guò)量飲酒導(dǎo)致的一種慢性肝臟疾病，最初表現(xiàn)為酒精性脂肪肝，進(jìn)而發(fā)展為酒精性肝炎、肝纖維化乃至肝硬化[1]。ALF是肝癌死亡的主要原因之一，是多基因、多階段、多途徑的復(fù)雜過(guò)程，然而至今仍缺乏早期、有效的治療措施，故探討ALF的發(fā)病機(jī)制及治療靶點(diǎn)尤為重要。自噬（autophagy）是指從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無(wú)核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體（autophagosome），并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新，在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、蛋白質(zhì)代謝平衡及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持等過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[2]。在肝纖維化發(fā)生過(guò)程中，各種致病因素刺激下HSC活化，細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的脂滴消失后，表型向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，表達(dá)其活化標(biāo)志蛋白α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)并大量分泌以I型膠原蛋白為主要成分的細(xì)胞外基質(zhì)并最終導(dǎo)致肝內(nèi)基質(zhì)沉積。目前關(guān)于自噬的研究多集中于炎癥、腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等領(lǐng)域[3]，而自噬在乙醇誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化進(jìn)而發(fā)生肝纖維化中的作用研究甚少。本實(shí)驗(yàn)使用不同劑量的自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）作用于乙醇刺激后的肝星狀細(xì)胞（HSC），觀察其HSC活化水平，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6購(gòu)自湘雅細(xì)胞庫(kù)，3-MA購(gòu)自Sigma公司，培養(yǎng)基DMEM購(gòu)自HyClone公司。胰蛋白酶、胎牛血清、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自Solarbio公司。TRIzol、DMSO購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。引物由上海生工生物工程公司合成。2×PCR MasterMix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司。總蛋白提取試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。兔抗LC3多克隆抗體、兔抗SMA多克隆抗體、兔抗COL1A2多克隆抗體、小鼠抗β-肌動(dòng)蛋白（actin）單克隆抗體(mAb)購(gòu)自Proteintech公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗及山羊抗小鼠二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 3-MA儲(chǔ)存液的配制3-MA粉末按100 mmol/L溶解在1×無(wú)菌PBS溶液中，-20℃避光保存。使用時(shí)用含有100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

1.2.2HSC-T6培養(yǎng)HSC-T6復(fù)蘇后置于含10％胎牛血清、雙抗（100 U/mL的青霉素和100 mg/L的鏈霉素）的高糖DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，37℃、飽和空氣濕度和5％的CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。設(shè)定4個(gè)不同處理組，分別為空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組（乙醇刺激組）、低劑量組（5 mmol/L 3-MA+100 mmol/L乙醇）、高劑量組（10 mmol/L 3-MA+100 mmol/L乙醇）。

1.2.3RT-PCR檢測(cè)3-MA對(duì)乙醇誘導(dǎo)后的HSC中α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)的影響采用Trizol提取RNA，合成cDNA后PCR擴(kuò)增目的基因，同一樣本以β-actin為內(nèi)參。根據(jù)GenBank上公布的大鼠的α-SMA、Ⅰ型膠原mRNA序列，應(yīng)用Primer Primier 5軟件設(shè)計(jì)引物。引物序列：α-SMA引物上游5′-GAAGCTGCTCCAGCTATGTGT-3′，下游5′-CAACCATCACTCCCTGG-3′，126 bp；Ⅰ型膠原引物上游5′-GATGGACTCAACGGTCTCCC-3′，下游5′-CGGCCACCATCTTGAGACTT-3′，185 bp；β-actin引物上游5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′，下游5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′，221 bp。α-SMA和β-actin的反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性35 s，退火35 s（α-SMA、β-actin為60℃，Ⅰ型膠原蛋白為62℃），72℃延伸35 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃7 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，用暗箱式紫外透射儀觀察電泳結(jié)果并拍照。結(jié)果用BANDLEAD 3.00軟件，以目的條帶/β-actin的光密度（OD）值進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.4Western blot法檢測(cè)3-MA對(duì)乙醇誘導(dǎo)后的HSC中α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白、LC-3Ⅱ蛋白表達(dá)的影響采用蛋白抽提液分別提取各組細(xì)胞的總蛋白，全自動(dòng)生化分析儀（Beckman，USA）測(cè)定蛋白濃度。取20～40 μg細(xì)胞總蛋白經(jīng)5×上樣緩沖液和30 g/L SDS配平蛋白至同體積后進(jìn)行100 g/L SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。以50 g/L脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜，分別與兔抗LC3多克隆抗體(1∶800)、兔抗SMA多克隆抗體(1∶800)、兔抗COL1A2多克隆抗體(1∶800)、小鼠抗β-actin單克隆抗體(1∶1 000)孵育過(guò)夜，洗滌后分別加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗或山羊抗小鼠二抗，加入底物化學(xué)發(fā)光試劑后X線片曝光，曝光顯影的目的條帶用Quatity one 4.62軟件進(jìn)行半定量分析，以內(nèi)參為參考標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算出目的條帶標(biāo)準(zhǔn)化后的OD值，以此判斷蛋白相對(duì)表達(dá)量。每次檢查均采用不同樣本重復(fù)3次。

1.2.5MTT法檢測(cè)HSC增殖水平收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入200 U，鋪板使細(xì)胞密度為1×104/孔濃度接種于96孔板中，空白調(diào)零孔只加不含細(xì)胞的培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)處理后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，加入150 μL DMSO，避光振蕩15 min，酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm處各孔OD值，計(jì)算各組的平均值。每組6復(fù)孔，計(jì)算各組的平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3-MA抑制乙醇誘導(dǎo)的HSC中α-SMA和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)與空白對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組中α-SMA、Ⅰ型膠原的mRNA表達(dá)明顯增加，高劑量組表達(dá)明顯減少；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，低劑量組、高劑量組表達(dá)減少；與低劑量組比較，高劑量組表達(dá)明顯減少，見(jiàn)表1。

2.2 3-MA抑制乙醇誘導(dǎo)的HSC中α-SMA、Ⅰ型膠原和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)與空白對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組中α-SMA、Ⅰ型膠原、LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)明顯增加，高劑量組表達(dá)明顯減少；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，低劑量組、高劑量組表達(dá)減少；與低劑量組比較，高劑量組表達(dá)明顯減少，見(jiàn)表2、圖1。

2.3 細(xì)胞增殖活力的變化與空白對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組中細(xì)胞增殖活力明顯增加，高劑量組明顯減少；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，低劑量組、高劑量組減少；與低劑量組組比較，高劑量組明顯減少，見(jiàn)表2。

Tab.1 Comparison of differential expressions of α-SMA mRNA and typeⅠcollagen mRNA in HSC between four groups表1 各組HSC中α-SMA,Ⅰ型膠原的mRNA表達(dá)量的比較（n=3，±s）

Tab.1 Comparison of differential expressions of α-SMA mRNA and typeⅠcollagen mRNA in HSC between four groups表1 各組HSC中α-SMA,Ⅰ型膠原的mRNA表達(dá)量的比較（n=3，±s）

＊P＜0.05；a與（1）組比較，b與（2）組比較，c與（3）組比較，P＜0.05；表2同

?

Tab.2 Comparison of differential expressions of α-SMA,typeⅠcollagen and LC3 proteins,and OD value in HSC between four groups表2 各組HSC中α-SMA、Ⅰ型膠原和LC3的蛋白表達(dá)量及OD值的比較（n=3，±s）

Tab.2 Comparison of differential expressions of α-SMA,typeⅠcollagen and LC3 proteins,and OD value in HSC between four groups表2 各組HSC中α-SMA、Ⅰ型膠原和LC3的蛋白表達(dá)量及OD值的比較（n=3，±s）

組別空白對(duì)照組（1）陽(yáng)性對(duì)照組（2）低劑量組（3）高劑量組（4）F α-SMA 1.507 1±0.298 2 2.339 7±0.177 2a1.612 3±0.200 3b0.687 2±0.218 8abc89.71＊Ⅰ型膠原0.184 1±0.144 5 0.675 5±0.243 5a0.153 5±0.298 1b0.090 5±0.251 9abc93.93＊組別空白對(duì)照組（1）陽(yáng)性對(duì)照組（2）低劑量組（3）高劑量組（4）F LC3Ⅱ1.107 6±0.173 3 1.702 7±0.234 1a0.896 1±0.107 6b0.521 6±0.274 8abc79.07＊細(xì)胞增殖活力（OD）0.62±0.08 2.24±0.12a1.42±0.36b0.25±0.09abc103.76＊

Fig.1 The expression of α-SMA,typeⅠcollagen and LC3Ⅱat the protein level圖1 α-SMA、Ⅰ型膠原和LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)

3 討論

肝纖維化是酒精性肝病發(fā)病過(guò)程中的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，如能及時(shí)去除導(dǎo)致肝纖維化的不利因素則有可能中止肝纖維化的進(jìn)程，甚至使病變向良性方面轉(zhuǎn)歸。一旦發(fā)展成肝硬化，病變則不可逆轉(zhuǎn)[4]。酒精性肝纖維化是多因素疾病，在肝纖維化發(fā)展過(guò)程中，乙醇代謝相關(guān)的氧化應(yīng)激，谷胱甘肽耗竭，蛋氨酸代謝異常，營(yíng)養(yǎng)不良，Kupffer細(xì)胞激活所致的大量炎性細(xì)胞因子釋放，肝星狀細(xì)胞激活，免疫反應(yīng)及遺傳多態(tài)性等諸多因素均起到重要作用[5]。研究認(rèn)為，HSC的增殖和激活是各類慢性肝病包括酒精性肝病發(fā)生肝纖維化的中心環(huán)節(jié)[6]。

當(dāng)細(xì)胞處于缺氧、能量代謝異常時(shí)，常常通過(guò)自噬提高其自噬水平來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)能量代謝供給[7]。Thoen等[8]研究發(fā)現(xiàn)，HSCs活化過(guò)程中伴有其自噬水平的升高，若抑制HSCs自噬將顯著抑制其活化。Hernández-Gea等[9]發(fā)現(xiàn)自噬作為細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)及細(xì)胞器，參與自我更新及能量代謝的重要生物學(xué)過(guò)程，在促進(jìn)HSC中能量代謝并維持HSC活化狀態(tài)中發(fā)揮了重要作用。劉曼等[10]研究證實(shí)3-MA能影響HSC增殖活化，然而，乙醇刺激HSC后，HSC的活化水平如何，自噬水平是否會(huì)發(fā)生改變?nèi)匀晃粗Ｒ虼巳裟苡行Э刂埔掖颊T導(dǎo)的肝纖維化的發(fā)生，將為治療酒精性肝硬化發(fā)生帶來(lái)的新希望。

本研究所用的HSC-T6，系SV40轉(zhuǎn)染SD大鼠HSC而成，具有活化HSC的表型，能表達(dá)高水平的Ⅰ型膠原蛋白mRNA等，能檢測(cè)出自噬標(biāo)志性蛋白LC3Ⅱ的表達(dá)，表明HSC-T6本身有一定的自噬水平。加入乙醇刺激后，自噬標(biāo)志性蛋白LC3Ⅱ的表達(dá)增加，表明乙醇刺激HSC-T6后能增加其自噬水平。3-MA是自噬調(diào)控信號(hào)通路Ⅲ型PI3K（hVps34）抑制劑，能抑制胞質(zhì)型LC3Ⅰ向自噬體膜蛋白LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化，從而抑制自噬水平[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3-MA作用HSC-T6后，自噬水平隨著劑量的增加而下降，而α-SMA、Ⅰ型膠原的mRNA及蛋白的表達(dá)量亦隨自噬水平的降低而相應(yīng)的減少。這表明HSC自噬水平在維持其活化狀態(tài)中起到重要作用。為了明確自噬抑制劑對(duì)乙醇誘導(dǎo)的HSC的增殖情況，本實(shí)驗(yàn)采用了MTT法檢測(cè)不同劑量的自噬抑制劑對(duì)乙醇誘導(dǎo)的HSC增殖水平，結(jié)果表明，3-MA能顯著抑制HSC的增殖，并隨著濃度的升高，其抑制效應(yīng)越強(qiáng)。

然而，自噬抑制劑對(duì)乙醇誘導(dǎo)的HSC活化的抑制作用是通過(guò)何種途徑實(shí)現(xiàn)仍不明確。有研究表明，乙醇所致氧化應(yīng)激是激活HSC的重要因素，過(guò)度攝入的乙醇及其代謝產(chǎn)物是引起肝臟內(nèi)氧化應(yīng)激的主要介質(zhì)[12]，這些代謝產(chǎn)物可以直接攻擊HSC促其活化，也能通過(guò)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β、p38、NF-κB、JNK等信號(hào)通路和AP-1、MAPK等炎癥信號(hào)通路激活HSC細(xì)胞[13-14]。

Komatsu等[15]發(fā)現(xiàn)，自噬基因atg7敲除后小鼠自噬水平顯著下降，并伴有P62大量積聚，P62可進(jìn)一步同Nrf2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Keap1，促使Nrf2與Keap1解偶聯(lián)并發(fā)生核轉(zhuǎn)位，激活Nrf2下游抗氧化反應(yīng)元件ARE調(diào)控的抗氧化基因轉(zhuǎn)錄，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。即抑制自噬可通過(guò)上調(diào)P62水平發(fā)揮對(duì)Nrf2-keap1-ARE信號(hào)通路的活化作用來(lái)降低乙醇誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激水平。

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（2013-11-05收稿2014-03-07修回）

（本文編輯魏杰）

The Effects of Autophagy Inhibitor on Activation of Alcohol induced Hepatic Stellate Cells

HE Yue1,JIA Baohui1,LIU Man2,LUO Wen2,ZHANG Jixiang2
1Department of Intensive Care Unit,The Fourth Affiliated Hospital,Nanchang University,Nanchang 330003,China;2Department of Gastroenterology,The Second Affiliated Hospital,Jiangxi Province Key Laboratory of Molecular Medicine, Nachang University
ZHANG Jixiang，E-mail：jixiangz@tom.com

ObjectiveTo observe the effect of autophagy inhibitor on the activation of alcohol induced hepatic stellate cells,and the mechanisms thereof.MethodsHSC-T6 cells were cultured in vitro and divided into four groups,including blank control group,alcohol group,5 mmol/L 3-MA+alcohol group(low alcohol group)and 10 mmol/L 3-MA+alcohol group(high alcohol group).RT-PCR was used to detect the expression levels of α-smooth muscle actin(α-SMA)and typeⅠcollagen.The levels of LC3Ⅱ,α-SMA and typeⅠcollagen were detected by Western blot assay.The cell viability of HSCT6 was detected by MTT assay.ResultsThe mRNA expressions of α-SMA,typeⅠcollagen and the protein of expressions α-SMA,typeⅠcollagen and LC3Ⅱwere significantly up-regulated in alcohol group compared with those of control group (P＜0.05),while the expressions of those parameters were significantly down-regulated in 10 mmol/L 3-MA+alcohol group (P＜0.01).The mRNA and protein levels of α-SMA and typeⅠcollagen were significantly decreased in two 3-MA-treated groups compared with those in alcohol group(P＜0.05).Meanwhile,compared with the 5 mmol/L 3-MA+alcohol group，the protein expressions of α-SMA,typeⅠcollagen and LC3Ⅱwere significantly decreased in10 mmol/L 3-MA+alcohol group (P＜0.05).Compared with the alcohol group，there was significantly lower proliferation activity in all two 3-MA-treated groups(P＜0.05).Conclusion3-MA can inhibit the protein expression of LC3Ⅱ,α-SMA and typeⅠcollagen induced by alcohol in HSC-T6 cells,and inhibit the proliferation of HSC cells.

autophagy;ethanol;liver cirrhosis,alcoholic;3-methyladenine;actins;collagen typeⅠ;hepatic stellate cells

R575，R34

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.07.002

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30360037）

1南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（郵編330003）；2南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化科、江西省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

△通訊作者E-mail：jixiangz@tom.com