電針對腦缺血再灌注大鼠齒狀回Nestin、GFAP表達(dá)的影響

張業(yè)貴 龔 鑫 李懷斌

（皖南醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002）

缺血性腦卒中是臨床上常見的急性腦血管病，具有高致殘率的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，腦缺血致殘的原因，與成年哺乳動(dòng)物腦內(nèi)神經(jīng)元缺乏再生能力、損傷后易形成膠質(zhì)瘢痕有關(guān)。因此，近年來，與神經(jīng)再生有關(guān)的神經(jīng)干細(xì)胞，與膠質(zhì)瘢痕形成有關(guān)的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞越來越受到人們的重視，成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。針灸在臨床上對腦缺血有良好的治療作用，但其具體作用機(jī)制尚不明確，本實(shí)驗(yàn)參照Longa等［1］，采用線栓法制作大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）模型，通過動(dòng)態(tài)觀察腦缺血再灌注大鼠齒狀回巢蛋白（nestin）和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrilliary acidic protein，GFAP）表達(dá)的變化，以及電針對內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖、星形膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)的影響，探討電針治療腦梗死的可能機(jī)制。

材料和方法

1.材料、試劑及儀器

成年SD大鼠72只，體重250－300g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號：SCXK（浙）2008－0033。兔抗nestin、兔抗GFAP（北京博奧森公司）及SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德公司），低頻電子脈沖治療儀（G6805－2，上海醫(yī)用電子儀器廠），Olympus顯微鏡及成像系統(tǒng)（日本），Image－J（National Institute of Health，美國）圖像分析軟件。

2.造模及分組

采用線栓法建立MCAO再灌注模型，用3%戊巴比妥鈉（1ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠，麻醉生效后，將大鼠仰臥固定，去頸部毛，碘伏消毒。沿頸部正中切開皮膚，在右側(cè)肌肉深部分離頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），結(jié)扎并剪斷ECA遠(yuǎn)端。暫時(shí)夾閉ICA、CCA，用眼科剪將ECA結(jié)扎處近端剪一小口，從此口插入釣魚線（直徑0.26mm，頭端燒成圓形），經(jīng)ICA插至大腦前動(dòng)脈（ACA），魚線平均插入深度為18.5±0.5mm至微感阻力。結(jié)扎ECA殘端以固定魚線和防止出血，將栓線末端留少許在外。缺血2h后，將栓線拉出至ECA結(jié)扎端進(jìn)行再灌注。造模后大鼠出現(xiàn)患側(cè)Horner綜合征，對側(cè)不同程度偏癱體征，視為模型成功。假手術(shù)組僅暴露CCA、ECA、ICA，縫合皮膚即可。將造模成功的大鼠隨機(jī)分模型組、電針組，每組再分為3、7、14和21d等4個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只大鼠，另設(shè)各時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組各6只。

3.電針方法

取百會和大椎穴，用30號1寸毫針電針，頻率2Hz，強(qiáng)度以大鼠頭部能輕微抖動(dòng)為度。持續(xù)30 min，每天1次，分別治療3d、7d、14d、21d。假手術(shù)組和模型組給予常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何處理。

4.行為學(xué)觀察

各組大鼠在處死前進(jìn)行神經(jīng)功能評分，評分標(biāo)準(zhǔn)參照Longa［1］評分法。0分：正常；1分：左側(cè)前肢不能完全伸直；2分：向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走向左側(cè)傾倒；4分：不能自己行走或昏迷。

5.取材和免疫組織化學(xué)染色

用30mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，剪開胸腔暴露心臟，穿刺針經(jīng)左心室至升主動(dòng)脈，先快速灌注100ml生理鹽水，再用4℃1%多聚甲醛300 ml灌注，30min內(nèi)完成。斷頭取腦，于4%多聚甲醛中固定，過夜，常規(guī)石蠟包埋。連續(xù)切片，片厚5 μm。常規(guī)脫蠟至水，微波熱抗原修復(fù)，一抗nestin、GFAP均選用兔抗人多克隆抗體（北京博奧森公司），稀釋度為1∶100，陰性對照實(shí)驗(yàn)用PBS代替一抗，余步驟相同，按照SABC（武漢博士德公司）試劑盒說明書進(jìn)行免疫組化染色，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。

6.細(xì)胞計(jì)數(shù)及灰度值測定

每亞組選取相同冠狀切面的切片各12張（其中每只大鼠選取2張），利用讀數(shù)顯微鏡在10×40倍視野下對每張切片DG區(qū)域的nestin、GFAP陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，使用Image－J圖像分析軟件檢測細(xì)胞平均灰度值。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較

假手術(shù)組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)未見神經(jīng)功能缺損，評分均為0分（未列數(shù)據(jù)）；模型組神經(jīng)功能缺損癥狀明顯，3d時(shí)最重，且功能恢復(fù)較慢 （7d、14d，P＞0.05），而電針組在7d、14d、21d時(shí)神經(jīng)功能缺損癥狀明顯改善，評分和同時(shí)間點(diǎn)模型組之間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01或P＜0.05）（表1）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分（n＝6，±s）Table1 Table1Neurologic imparment scores in each group（n＝6，±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分（n＝6，±s）Table1 Table1Neurologic imparment scores in each group（n＝6，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，與同時(shí)間點(diǎn)模型組比較（Compared with model group at the same time）；△P＜0.01，與同組3d比較（Compared with the same group of 3day）

組別（Group）3d 7d 14d 21d模型組（Model Group） 3.17±0.75 2.67±0.52 2.50±0.55 2.17±0.75△電針組（EA Group） 2.83±0.41 1.83±0.75＊△ 1.33±0.52＊＊△ 1.17±0.41＊＊△

2.各組大鼠齒狀回nestin陽性細(xì)胞數(shù)及平均灰度值比較

表2、圖1示，在正常大鼠齒狀回顆粒細(xì)胞下區(qū)，nestin陽性細(xì)胞呈棕黃色，以胞漿著色為主，表達(dá)較弱；模型組nestin的陽性細(xì)胞數(shù)在3d時(shí)開始增加，7d時(shí)數(shù)目最多（P＜0.01），灰度值明顯降低（P＜0.01），14d時(shí)表達(dá)稍有下降，但仍顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），21d時(shí)表達(dá)降低；與模型組比較，各時(shí)間點(diǎn)電針組陽性細(xì)胞數(shù)目均顯著增加，灰度值降低 （P＜0.01或P＜0.05）。

表2 各組大鼠齒狀回nestin陽性細(xì)胞數(shù)及平均灰度值（n＝6，±s）Table2 The number of nestin IR positive cells and average gray value in DG in each group（n＝6，±s）

表2 各組大鼠齒狀回nestin陽性細(xì)胞數(shù)及平均灰度值（n＝6，±s）Table2 The number of nestin IR positive cells and average gray value in DG in each group（n＝6，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，與同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組比較（Compared with sham operation group at the same time）；△P＜0.05，△△P＜0.01，與同時(shí)間點(diǎn)模型組比較（Compared with model group at the same time）

組別（Group）細(xì)胞數(shù)（個(gè)/400倍視野）（Cell number/×400）平均灰度值（average gray value）3d假手術(shù)組（Sham operation group of 3day）5.50±4.30 183.49±4.06 3d模型組（model group of 3day） 15.67±5.60＊＊ 179.03±3.50 3d電針組（EA group of 3day） 20.75±6.30＊＊△ 172.41±6.73＊＊△△7d假手術(shù)組（Sham operation group of 7day） 5.08±4.01 182.67±3.98 7d模型組（model opertion group of 7day） 21.33±6.51＊＊ 175.04±7.77＊＊7d電針組（EA group of 7day） 29.42±6.56＊＊△△ 155.54±8.68＊＊△△14d假手術(shù)組（Sham operation group of 14day） 6.42±4.76 183.62±4.08 14d模型組（model opertion group of 21day） 17.00±6.93＊＊ 177.23±5.85＊14d電針組（EA group of 14day） 22.17±7.17＊＊△ 171.42±5.81＊＊△21d假手術(shù)組（Sham operation group of 21day） 5.83±5.01 182.25±5.28 21d模型組（model opertion group of 21day） 8.83±3.35 179.64±6.91 21d電針組（EA group of 21day） 14.33±6.64＊＊△ 174.40±6.12＊＊△

3.各組大鼠齒狀回GFAP陽性細(xì)胞數(shù)及平均灰度值比較

各組大鼠齒狀回均有GFAP陽性表達(dá)，多呈棕褐色，以胞漿和突起著色為主，假手術(shù)組胞體較小，突起較短，模型組和電針組胞體較大，突起較長，染色較深。假手術(shù)組GFAP的表達(dá)較少；模型組各時(shí)間點(diǎn)陽性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組均明顯增加，灰度值降低（P＜0.05或P＜0.01），3d時(shí)表達(dá)開始增高，14 d達(dá)高峰，21d有所下降；與模型組比較，電針組在7d、14d時(shí)GFAP的表達(dá)強(qiáng)度均明顯降低，灰度值增加（P＜0.05或P＜0.01），但陽性細(xì)胞數(shù)變化不明顯（P＞0.05），電針21d時(shí)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)及表達(dá)強(qiáng)度均顯著下降（P＜0.01）（表3、圖2）。

表3 各組大鼠齒狀回GFAP陽性細(xì)胞數(shù)及平均灰度值（n＝6，±s）Table3 The number of nestin GFAP IR positive cells and average gray value in DG in each group（n＝6，±s）

表3 各組大鼠齒狀回GFAP陽性細(xì)胞數(shù)及平均灰度值（n＝6，±s）Table3 The number of nestin GFAP IR positive cells and average gray value in DG in each group（n＝6，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，與同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組比較（Compared with sham operation group at the same time）；△P＜0.05，△△P＜0.01，與同時(shí)間點(diǎn)模型組比較（Compared with model group at the same time）

組別（Group）細(xì)胞數(shù)（個(gè)/400倍視野）（Cell number/×400）平均灰度值（average gray value）3d假手術(shù)組（Sham operation group of 3day）17.25±4.11 184.27±8.92 3d模型組（model group of 3day） 24.08±5.60＊＊ 175.16±6.43＊3d電針組（EA group of 3day） 25.00±5.83＊＊ 177.55±8.49 7d假手術(shù)組（Sham operation group of 7day） 16.17±5.31 182.44±7.97 7d模型組（model opertion group of 7day） 28.75±5.82＊＊ 171.11±7.93＊＊7d電針組（EA group of 7day） 27.75±5.01＊＊ 178.99±9.57△14d假手術(shù)組（Sham operation group of 14day） 15.33±6.10 180.82±7.51 14d模型組（model opertion group of 14day） 37.25±6.98＊＊ 154.53±8.04＊＊14d電針組（EA group of 14day） 33.58±6.72＊＊ 172.49±12.03＊△△21d假手術(shù)組（Sham operation group of 21day） 15.08±5.26 181.95±6.45 21d模型組（model opertion group of 21day） 26.92±6.37＊＊ 169.56±9.97＊＊21d電針組（EA group of 21day） 19.83±6.91△△ 181.90±10.53△△

討 論

Nestin是一種胚胎性中間絲蛋白，在成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，表達(dá)于多潛能神經(jīng)前體細(xì)胞胞質(zhì)中，因此nestin已成為鑒定神經(jīng)干細(xì)胞的重要標(biāo)志蛋白之一［2］。成年鼠海馬齒狀回顆粒下層存在著神經(jīng)干細(xì)胞，為了保持齒狀回顆粒細(xì)胞定期死亡后細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定，顆粒下層的神經(jīng)干細(xì)胞會以同樣的速度進(jìn)行增殖［3］。在缺血等病理性損傷時(shí)，齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞也可以增殖、遷移及分化為神經(jīng)元，參與受損神經(jīng)元的自我修復(fù)，但腦缺血刺激產(chǎn)生的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量不足，而且調(diào)節(jié)干細(xì)胞增殖、遷移、分化以及神經(jīng)元修復(fù)和突觸形成的因子也不足［4］，因此，需要介入適當(dāng)?shù)闹委熓侄我源龠M(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，加速神經(jīng)功能的恢復(fù)［5］。

Kluska等［6］研究發(fā)現(xiàn)，成年大鼠局灶性腦梗死后，能刺激齒狀回區(qū)的神經(jīng)再生，本研究結(jié)果也顯示，腦缺血后齒狀回顆粒下區(qū)nestin在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均增加，7d時(shí)表達(dá)最多，但隨著時(shí)間的延長，nestin陽性細(xì)胞逐漸減少，表達(dá)強(qiáng)度也逐漸降低，神經(jīng)缺損癥狀恢復(fù)不明顯，結(jié)果表明腦缺血可以刺激內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，但這種自我調(diào)節(jié)的能力是有限的，尚不足以持續(xù)修復(fù)受損神經(jīng)元。在給予電針治療后，nestin陽性細(xì)胞的數(shù)量及表達(dá)強(qiáng)度均顯著提高，神經(jīng)缺損評分明顯降低，說明電針可以增強(qiáng)腦缺血后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，改善神經(jīng)功能。有研究發(fā)現(xiàn)，腦損傷后神經(jīng)干細(xì)胞可以分化為未成熟神經(jīng)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞［7］，因此電針治療后，可能通過促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖及分化，修復(fù)受損神經(jīng)元，恢復(fù)神經(jīng)功能［8］，這可能是電針對腦缺血產(chǎn)生治療作用的重要機(jī)制之一。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的一種神經(jīng)細(xì)胞，廣泛分布于腦的各個(gè)區(qū)域，能維持神經(jīng)元的正常功能，在神經(jīng)元的發(fā)育、遷移、突觸連接的形成中扮演了重要角色［9，10］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞增生活躍，星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生可以吞噬壞死組織碎片、充填神經(jīng)元損傷后產(chǎn)生的空缺，并可以降低谷氨酸等有毒分子對神經(jīng)元的毒性作用，還能夠分泌多種具有神經(jīng)營養(yǎng)和保護(hù)作用的細(xì)胞因子等［11］，因而對受損神經(jīng)元起到代償和修復(fù)作用。但過度增殖的星形膠質(zhì)細(xì)胞，也可能分泌毒性細(xì)胞因子等有害物質(zhì)，加劇神經(jīng)元的損傷，并且可形成瘢痕，導(dǎo)致軸突的再生障礙［12］。

GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性蛋白，其表達(dá)量的多少可作為腦損傷后星型膠質(zhì)細(xì)胞活化及增殖的標(biāo)志［13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦缺血后7d時(shí)齒狀回GFAP的表達(dá)即明顯增加，至14d時(shí)陽性細(xì)胞表達(dá)最強(qiáng)烈，突起變粗，21d時(shí)的表達(dá)依然較高，顯示腦缺血能明顯刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生，是機(jī)體的代償性保護(hù)反應(yīng)。電針治療7、14、21d后，GFAP的表達(dá)強(qiáng)度明顯降低，相同時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能評分顯著降低，表明電針抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化及增殖狀態(tài)，為神經(jīng)再生和功能重建提供了更有利的生存環(huán)境［14，15］。楊卓欣等［16］研究證實(shí)，腦缺血后海馬部位星形膠質(zhì)細(xì)胞增生活躍，電針治療后可明顯抑制其過度增殖，并可以促進(jìn)其分化。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，電針能明顯改善腦缺血大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀，其作用機(jī)制可能與其促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和神經(jīng)再生，下調(diào)GFAP的持續(xù)過度表達(dá)，干預(yù)星型膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)有關(guān)。但神經(jīng)干細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元發(fā)生分化、遷移的分子機(jī)制如何，尚需進(jìn)一步深入研究。

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