食管鱗狀細(xì)胞癌中Sox2和β－catenin的表達(dá)及其臨床意義

王曉彥 吳繼鋒

（1安徽醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，合肥 233032；2蚌埠醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)二系，蚌埠 233030）

食管癌（Esophageal cancer，EC）是消化道最常見的惡性腫瘤之一［1］，其發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)基因多個(gè)過程，到目前為止其發(fā)病機(jī)制仍不清楚。在過去的20年其診斷和治療水平有了顯著提高，但5年存活率仍徘徊在5%和20%之間［2，3］。因此，尋找食管鱗狀細(xì)胞癌早期診斷及預(yù)后判斷的分子標(biāo)志尤其重要。

干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Sox2是調(diào)控胚胎發(fā)育的關(guān)鍵因子，在胚胎發(fā)育早期對(duì)維持胚胎干細(xì)胞多潛能性和自我更新具有關(guān)鍵的調(diào)控作用［4］。據(jù)報(bào)道Sox2在乳腺癌、胸腺瘤、前列腺癌和肝癌等腫瘤組織中表達(dá)升高［5－8］。LiX 等研究發(fā)現(xiàn)，Sox2通過激活 Wnt/β－catenin信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［9］。β－連環(huán)素（β－catenin，β－cat）是 WNT 信號(hào)通路關(guān)鍵的傳遞子，主要位于胞膜，在有 Wnt配體存在時(shí)細(xì)胞內(nèi)游離的β－catenin聚集并易位至細(xì)胞核內(nèi)，與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子——T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子（T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF）結(jié)合，刺激一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［10］。

研究采用免疫組化染色方法檢測(cè)ESCC及其癌旁正常食管黏膜組織（對(duì)照）中Sox2和β－catenin蛋白表達(dá)水平，并分析二者與ESCC患者臨床病理因素和預(yù)后之間的關(guān)系，本研究對(duì)深入理解ESCC和預(yù)后判斷有一定理論指導(dǎo)意義。

材料和方法

1.臨床資料

隨機(jī)選取蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床病理科2008－2009年存檔石蠟包埋標(biāo)本90例，其中男51例，女39例；年齡為36－81歲（中位年齡58.6±6.2）；解剖部位：上段9例，中段55例，下段16例；大體類型：髓質(zhì)型31例，潰瘍型43例，蕈傘型14例和縮窄型的2例；腫瘤直徑＜5.0cm的41例，≥5.0cm的49例；分化程度：高分化23例，中分化30例和低分化37例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者48例，未轉(zhuǎn)移者42例；浸潤(rùn)至外膜76例，未浸潤(rùn)外膜層14例；臨床Ⅰ－Ⅱ期35例，Ⅲ－Ⅳ期55例。所有患者術(shù)前均未接受放、化療，經(jīng)過患者及其蚌埠醫(yī)學(xué)院人體試驗(yàn)倫理道德委員會(huì)知情同意。

2.免疫組化主要試劑和染色步驟

兔源多克隆抗體 Sox2（ab97959）和β－catenin（ab16377）購自Abcam公司，DAB顯色試劑盒購自福州邁新公司。免疫組化染色［11］：所有石蠟包埋組織連續(xù)切片數(shù)張，4－5μm/張，置于二甲苯溶液及梯度乙醇中脫蠟至水洗。操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，內(nèi)源性過氧化物酶活性用含3%的H2O2甲醇封閉，室溫下置10min；95℃孵育10min進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS沖洗；山羊血清室溫下封閉20min；一抗孵育4℃過夜，PBS沖洗，羊抗兔二抗室溫孵育30min。

3.免疫組化染色結(jié)果評(píng)判

免疫組化染色結(jié)果由2名資深病理醫(yī)師閱片評(píng)定。Sox2主要表達(dá)于對(duì)照及ESCC瘤細(xì)胞的胞核；β－catenin主要表達(dá)于正常食管上皮胞膜/胞漿及ESCC瘤細(xì)胞的胞核/胞漿，如果在正常食管組織出現(xiàn)β－catenin核表達(dá)則記為陽性。采用陽性細(xì)胞的數(shù)量及細(xì)胞著色強(qiáng)度雙評(píng)分半定量法記分［11］。每張切片隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)量按照以下方法：0（無陽性）；1（＜10%）；2（10－35%）；3（＞35－75%）和4（＞75%）；細(xì)胞著色強(qiáng)度：1（不著色）；2（淺黃色）；3（棕黃色）和4（棕褐色）。兩者結(jié)果相乘分值0－1為陰性，≥2為陽性。

4.總體生存時(shí)間

總體生存時(shí)間（Overall survival time，OS）定義為自ESCC患者確診至因該病導(dǎo)致死亡或失訪之間的時(shí)間。入選病例隨訪至患者死亡或截止到2013年8月31日，隨訪時(shí)間為3－108個(gè)月，其中有6位患者失訪。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

χ2檢驗(yàn)分析比較Sox2和β－catenin在ESCC及對(duì)照組織中表達(dá)的差異和二者與ESCC患者臨床病理因素之間的關(guān)系；Spearman等級(jí)相關(guān)分析比較Sox2與β－catenin之間的關(guān)系，P＜0.05定義為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.Sox2在ESCC中的表達(dá)及其與臨床病理因素之間的關(guān)系

Sox2呈棕褐色顆粒狀，主要表達(dá)于ESCC及對(duì)照組織細(xì)胞的胞核，胞漿僅少量表達(dá)（Fig 1A，1B）。90例ESCC組織中有56例陽性表達(dá)，陽性率為62.22%，顯著高于對(duì)照組織的陽性率35%（7/20）（P＜0.05）。Sox2與ESCC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、外膜浸潤(rùn)和PTNM分期相關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Sox2陽性率為83.33%（40/48），未轉(zhuǎn)移者Sox2陽性率為38.10%（16/42）；外膜浸潤(rùn)者Sox2陽性率為82.61%（38/46），未浸潤(rùn)者Sox2陽性率為40.91%（18/44）；PTNM分期Ⅰ－Ⅱ期ESCC組織中Sox2陽性率為20%（7/35），Ⅲ－Ⅳ期為75.53%（49/55），組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Sox2與ESCC患者性別、年齡、部位、大體類型、腫瘤直徑和組織學(xué)分型之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

2.β－catenin在ESCC中的表達(dá)及其與患者臨床病理因素之間的關(guān)系

β－catenin呈棕褐色顆粒狀，在正常情況下僅表達(dá)于正常食管黏膜上皮細(xì)胞的胞膜，當(dāng)其表達(dá)缺失或異位至胞漿/胞核時(shí)，即表達(dá)異常定義為陽性。β－catenin在ESCC組織主要表達(dá)于胞核/漿（Fig1CE）。90例ESCC組織中有60例陽性表達(dá)，陽性率為66.67%，顯著高于對(duì)照組織的40%（8/20）（P＜0.05）。β－catenin與 ESCC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、外膜浸潤(rùn)和PTNM分期相關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者β－catenin陽性率為79.17%（38/48），未轉(zhuǎn)移者陽性率為52.38%（22/42）；外膜浸潤(rùn)者β－catenin陽性率為78.26（36/46），未浸潤(rùn)者陽性率為54.55%（24/44）；PTNM分期Ⅰ－Ⅱ期ESCC組織中β－catenin陽性率為25.71%（9/35），Ⅲ－Ⅳ期為92.73%（51/55），組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；β－catenin與ESCC患者性別、年齡、部位、大體類型、腫瘤直徑和組織學(xué)分型之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 Sox2和β－catenin與食管鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理因素之間的關(guān)系（n＝90）Table1 Association of Sox2andβ－catenin with clinicopathologic characteristics of patients with ESCC（n＝90）

3.ESCC組織中Sox2和β－catenin表達(dá)之間的關(guān)系

Spearman相關(guān)分析顯示ESCC組織中Sox2與β－catenin蛋白表達(dá)水平之間呈正相關(guān)，r＝0.71，（P＜0.001，表2）。

表2 食管鱗狀細(xì)胞癌中Sox2和β－catenin表達(dá)之間關(guān)系（n＝90）Table2 Correlation of Sox2andβ－catenin expression in ESCC（n＝90）

4.Kaplan－Meier生存分析

Kaplan－Meier生存分析顯示，Sox2陽性表達(dá)ESCC患者5年生存率為8.93%（5/56），顯著低于Sox2陰性患者的70.59%（24/34）（Log－rank＝67.092，P＜0.001）（圖2）。

圖1 正常食管黏膜（對(duì)照）和ESCC組織中Sox2和β－catenin的表達(dá)（Elivision，×400）。A.對(duì)照組織細(xì)胞核Sox2陽性表達(dá)。B.ESCC組織瘤細(xì)胞核Sox2陽性表達(dá)。C.正常食管鱗狀上皮基底層和棘細(xì)胞層細(xì)胞膜β－catenin的正常表達(dá)。D.正常食管鱗狀上皮基底層和棘細(xì)胞層細(xì)胞漿β－catenin的異位表達(dá)。E.ESCC組織瘤細(xì)胞核β－catenin的胞漿/核的異位表達(dá)。Fig.1 Immunohistochemical expression of Sox2andβ－catenin in normal esophageal mucosa（control）and ESCC tumor cells（Elivision，×400）.A.Normal epithelium of the esophageal mucosa.Abberant positive immunoreactivity of Sox2protein is observed in the nucleus of the control cells.B.Abberant positive immunoreactivity of Sox2protein in the nucleus of ESCC tumor cells.C.Normal expression ofβ－catenin protein in the membrane of control cells.C.Normal epithelium of the esophageal mucosa.Positive immunoreactivity is observed on the plasma membrane of the cells in the basal and parabasal layers.No counterstaining was performed.D.Abberant positive immunoreactivity ofβ－catenin protein is observed on the cytoplasm of the cells in the basal and parabasal layers（loss in the membrane of control cells）.E.Abberant positive immunoreactivity ofβ－catenin protein in nucleus and cytoplasm of ESCC tumor cells.

圖2 Sox2陰性和陽性表達(dá)食管鱗狀細(xì)胞癌患者總體生存曲線（n＝90）。Fig.2 The overall survival curve of patients with esophageal squamous cell carcinoma with Sox2protein positive or negative expression（n＝90）.

討 論

Sox2是Sox（SRY related HMG box）基因超家族成員之一，是一類SRY（sex determination region of Y chromosome）相關(guān)基因家族，參與胚胎發(fā)育和細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控［12－14］，SRY基因位于Y染色體上接近常染色質(zhì)的在35kb左右的區(qū)域內(nèi)，在進(jìn)化上高度保守，它所編碼的蛋白質(zhì)在高速泳動(dòng)區(qū)（high－mobile group，HMG）中含有一段有79個(gè)氨基酸殘基的DNA結(jié)合區(qū)域（DNA binding domain，DBD），因此被命名為HMG－box［15］。Sox基因家族對(duì)下游的靶基因發(fā)揮抑制或者激活調(diào)節(jié)作用，就是通過特定的DNA序列與HMG結(jié)構(gòu)相互結(jié)合而得以完成的［16］。Sox2基因定位于人3號(hào)染色體上，全長(zhǎng)2518bp，編碼319個(gè)氨基酸，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)特別是垂體、前腦、眼睛晶狀體和內(nèi)耳的形成有重要的調(diào)控作用［17］。

最近研究報(bào)道潛能相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Sox2在多種腫瘤中表達(dá)，和它在胚胎干細(xì)胞中的作用相似，Sox2表達(dá)升高的腫瘤細(xì)胞分化程度較低［5］。Sox2可以通過調(diào)控Wnt/β－catenin信號(hào)通路刺激上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial－mesenchymal transition，EMT）促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［9］。Wnt/β－catenin信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和分化的關(guān)鍵通路之一，該通路主要由信號(hào)分子啟動(dòng)、分子傳遞、靶基因轉(zhuǎn)錄活化等幾個(gè)重要環(huán)節(jié)組成［18］。β－catenin是一種多功能細(xì)胞骨架蛋白，主要位于細(xì)胞膜。既能與E－cadherin結(jié)合，介導(dǎo)同型細(xì)胞間的黏附，維持組織結(jié)構(gòu)的完整性和極性，又是 Wnt/β－catenin信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，它以信號(hào)分子及“促癌因子”的角色參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展［19］。

經(jīng)典的Wnt/β－catenin信號(hào)通路在沒有Wnt配體時(shí)，β－catenin、大腸腺瘤樣蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）、糖原合成酶激酶－3β（GSK－3β）及軸蛋白（Axin）形成四元降解復(fù)合體 GSK－3β/APC/Axin/β－catenin啟 動(dòng) β－catenin 降 解［10］。 當(dāng) 體 內(nèi) 的穩(wěn)態(tài)失衡時(shí)，比如Sox2表達(dá)升高、癌基因激活或抑癌基因失活時(shí)，細(xì)胞內(nèi)游離的β－catenin聚集并易位至細(xì)胞核內(nèi)與TCF/LEF結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體βcatenin－TCF/LEF，激活該信號(hào)通路，刺激一系列靶基因如c－myc、c－jun和 CyclinDl等的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展［10，19］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Sox2和β－catenin在ESCC組織中表達(dá)升高（P＜0.05），二者之間呈正相關(guān)，r＝0.71（P＜0.05），且Sox2和β－catenin陽性表達(dá)的ESCC患者更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和外膜浸潤(rùn)，具有更遲的PTNM分期（P＜0.05）。我們結(jié)果和Long等報(bào)道在Sox2在胃腸道鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)水平顯著升高一致［20］。Kaplan－Meier生存分析顯示Sox2陽性ESCC患者的5年生存率（8.93%）顯著低于陰性患者（70.59%）（P＜0.05）。我們推測(cè)Sox2在ESCC的異常表達(dá)，引起 Wnt/β－catenin信號(hào)通路異常激活，一方面通過EMT使上皮細(xì)胞喪失上皮表型和極性，減少與周圍細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的接觸，運(yùn)動(dòng)、遷移能力增強(qiáng)；另一方面刺激該通路靶基因的表達(dá)，從而使ESCC更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和外膜浸潤(rùn)，患者預(yù)后較差。

綜上所述，Sox2通過調(diào)控β－catenin轉(zhuǎn)錄從而激活 Wnt/β－catenin信號(hào)通路是ESCC發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和外膜浸潤(rùn)的分子基礎(chǔ)。聯(lián)合檢測(cè)Sox2和βcatenin可以作為ESCC預(yù)后判斷的指標(biāo)，也可以為研究通過Sox2或β－catenin途徑治療ESCC提供新的思路。

［1］Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics.CA－Cancer J Clin，2011，61（2）：69－90

［2］Tong L，Yuan S，F(xiàn)eng F，et al.Role of podoplanin expression in esophageal squamous cell carcinoma：a retrospective study.Dis Esophagus，2012，25（1）：72－80

［3］Ferlay J，Shin HR，Bray F，et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008：Globocan 2008.Int J Cancer，2010，127（12）：2893－2917

［4］Jboyer LA，Lee TI，Cole MF，et al.Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells.Cell，2005，122（6）：947－956

［5］Lengerke C，F(xiàn)ehm T，Kurth R，et al.Expression of the embryonic stem cell marker SOX2in early－stage breast carcinoma.BMC Cancer，2011，11：42

［6］Cimpean AM，Encica S，Raica M，et al.Sox2gene expression in normal human thymus and thymoma.Cln exp med，2011，11（4）：251－254

［7］Bae KM，Su Z，F(xiàn)rye C，et al.Expression of pluripotent stem cell reprogramming factors by prostate tumor initiating cells.Int J Urol，2010，183（5）：2045－2053

［8］Xu XL，Xing BC，Han HB，et al.The properties of tumor－initiating cells from a hepatocellular carcinoma patients＇primary and recurrent tumor.Carcinogenesis，2010，31（2）：167－174

［9］Li X，Xu Y，Chen S，et al.SOX2promotes tumor metastasis by stimulating epithelial－to－mesenchymal transition via regulation of WNT/β－catenin signal network.Cancer Lett，2013，19；336（2）：379－389

［10］Anastas JN，Moon RT.WNT signalling pathways as therapeutic targets in cancer.Nat Rev Cancer，2013，13（1）：11－26

［11］Chai DM，Bao ZQ，Hu JG，et al.Vasculogenic Mimicry and Aberrant Expression of HIF－lα/E－cad Associated with Worse Prognosis of Esophageal Squamous Cell Carcinoma.Journal of Huazhong University Science and Technology［Medical Science］，2013，33（3）：385－391

［12］Kaur G，Delluc－Clavieres A，Poon I K，et al.Calmodulin－dependent nuclear import of HMG－box family nuclear factors：importance of the role of SRY in sex reversal.Biochem J，2010，43（1）：39－48

［13］Zhang L，Zhu T，Lin D，et al.A second form of SOX11homologue identified in the organ－spotted grouper Epinephelus coioides：analysis of sequence and mRNA expression patterns.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2010，157（4）：415－422

［14］Kim HY，Yoon CH，Kim GH，et al.A case of campomelic dysplasia without sex reversal.J Korean Med Sci，2011，26（1）：143－145

［15］Berta P，Hawkins JR，Sinclair AH，et al.Genetic evidence equating SRY and the testis－determining factor.Nature，1990，348（6300）：448－450

［16］Sekido R.SRY：A transcriptional activator of mammalian testis determination.Int J Biochem Cell Biol，2010，42（3）：417－420

［17］Kelberman D，De Castro SC，Huang S，et al.SOX2 plays a critical role in the pituitary，forebrain，and eye during human embryonic development.J Clin Endocrinol Metab，2008，95（3）：1865－1873

［18］Heasly LE，Han SY.JNK regulation of oncogaiesis.Mol Cells，2006，21（2）：167－173

［19］Lustig B，Behrens J.The Wnt signaling pathway and its role in tumor development.J Cancer Res Clin Oncol，2003，129（4）：199－221

［20］Long KB，Hornick JL.SOX2is highly expressed in squamous cell carcinomas of the gastrointestinal tract.Hum Pathol，2009，40（12）：

1768 －1773