重復使用氯胺酮對成年貓視皮層神經(jīng)元凋亡和BDNF表達的影響

朱 慧 陳翠云 李 鵬 孫慶艷 華田苗

（安徽師范大學生命科學學院，蕪湖 241000）

最近的醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，常用麻醉劑氯胺酮急性注射能快速緩解抑郁癥病人的抑郁癥狀，并維持較長的抗抑郁效應［1，2］，因此有可能成為臨床抑郁癥治療的候選藥物。然而，長期使用氯胺酮是否會導致成年腦產(chǎn)生神經(jīng)毒性尚不清楚。

以前的研究結(jié)果顯示，單次或短期重復使用氯胺酮和其他麻醉劑會導致發(fā)育階段腦內(nèi)神經(jīng)元大量凋亡和神經(jīng)功能衰退，但對成年個體和成熟神經(jīng)元的作用不明顯［3，4］，其原因尚不清楚。據(jù)相關研究報道，氯胺酮對成熟神經(jīng)元的NMDA受體通道的抑制作用比發(fā)育中神經(jīng)元的減弱，且作用的時程較短［5，6］，這可能是短期使用氯胺酮對成年個體神經(jīng)元不易產(chǎn)生毒害作用的一個重要原因，是否長期重復使用亦會對成年腦產(chǎn)生神經(jīng)毒性尚無直接的實驗證據(jù)。另一個可能的原因是，成年腦或發(fā)育成熟的神經(jīng)組織在氯胺酮等麻醉劑的作用下，可能會啟動神經(jīng)保護機制，如增加神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌與相應的受體活動［7］，以對抗神經(jīng)毒性作用。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）是普遍公認的影響腦內(nèi)神經(jīng)元存活、神經(jīng)可塑性及認知功能的一種重要神經(jīng)營養(yǎng)因子［8，9］，因此在麻醉劑引起的神經(jīng)毒害作用中可能會對神經(jīng)元產(chǎn)生保護作用。目前的研究證據(jù)顯示，麻醉劑對發(fā)育中大鼠腦內(nèi)BDNF表達的影響存在爭議，有研究發(fā)現(xiàn)，使用阻斷NMDA受體的麻醉劑會引起B(yǎng)DNF表達下調(diào)，并損害發(fā)育早期小鼠的學習記憶能力［10］，但也有人報道重復使用氯胺酮會增加幼鼠腦中BDNF的表達［11］，其結(jié)果的差異性可能與不同發(fā)育階段的神經(jīng)網(wǎng)絡中興奮性與抑制性遞質(zhì)的相互作用及神經(jīng)活動有關［12，13］。長期重復使用麻醉劑氯胺酮是否會引起正常成年腦中BDNF表達發(fā)生改變尚不清楚，從最近對抑郁癥病人的研究報道推測［1］，使用氯胺酮可能亦會增加正常成年腦內(nèi)BDNF的表達。

為證實以上推測，本研究使用氯胺酮對成年貓實施兩個月的重復麻醉注射實驗，以視覺皮層為研究對象，用Nissl染色法觀察和統(tǒng)計視覺皮層內(nèi)神經(jīng)元密度，用TUNEL－原位雜交試劑盒檢測凋亡細胞，用免疫組織化學方法標記BDNF免疫陽性細胞，通過與對照組比較來評價長期使用氯胺酮對大腦皮層神經(jīng)元存活和BDNF表達的影響。

材料和方法

1.取材和組織準備

本研究采用的實驗對象為6只健康的雄性成年貓，實驗貓隨機分為兩組，鹽酸氯胺酮處理組、正常對照組各三只。鹽酸氯胺酮處理組的貓每3d肌肉注射鹽酸氯胺酮1次，鹽酸氯胺酮的基礎劑量為40 mg/kg體重，實驗時間持續(xù)2m，共注射20次。對照組貓每次肌肉注射等量的生理鹽水。最后1次麻醉劑注射后等待4h，將貓深麻醉，立即開胸，經(jīng)左心室插管至主動脈，灌注生理鹽水，至肝臟發(fā)白后灌注4%多聚甲醛進行預固定。開顱取出視皮層，并移入含4%多聚甲醛、2.5%戊二醛和30%蔗糖的固定液中固定至組織沉底。冰凍切片機連續(xù)冠狀切片，切片厚30μm，每隔20張切片取5張為一組，分別用于TUNEL凋亡細胞標記、BDNF免疫組織化學標記、陰性對照和尼氏染色，每只貓取10組切片進行細胞計數(shù)和數(shù)據(jù)分析。

2.神經(jīng)元Nissl染色

Nissl染色采用0.1%焦油紫室溫染色8min，蒸餾水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片。

3.原位凋亡檢測（TUNEL）法

細胞凋亡檢測試劑盒（POD）購于武漢博士德公司。冰凍切片用3%H2O2室溫處理10min，TBS清洗后加標記緩沖液（LabelingBuffer），37℃標記2h。TBS清洗，封閉液室溫封閉30min后，滴加抗體稀釋液37℃反應30min，TBS沖洗，再滴加SABC室溫孵育20min，DAB顯色，脫水，透明，封片。

4.BDNF免疫組織化學染色

BDNF蛋白免疫標記按常規(guī)方法分別用3%H2O2、0.3%TritonX－100及5%胎牛血清處理，然后滴加BDNF一抗（兔抗鼠多克隆抗體，濃度為1∶100，博士德產(chǎn)品），4℃孵育24h，PBS沖洗后滴加生物素標記二抗（羊抗兔IgG工作液，博士德產(chǎn)品），室溫孵育20min，PBS沖洗，再滴加三抗（SABC），室溫孵育20min，DAB顯色，脫水，透明，封片。陰性對照以PBS液代替一抗進行孵育，其余步驟相同。

5.數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

染色及免疫標記的切片在Olympus BX－51顯微鏡下觀察，用Image－Pro Express 6.0圖像分析軟件進行圖像采集，定量統(tǒng)計并分析。每張尼氏染色切片先在低倍鏡下（×40）獲取圖像，再在高倍鏡（×400）下分別于皮質(zhì)各層選取10個視野（樣方大小50μm×50μm）計數(shù)尼氏染色神經(jīng)元和BDNF免疫陽性細胞數(shù)，取平均值并換算成細胞密度（cells/mm2）。從每張細胞凋亡標記切片中隨機選取80個凋亡陽性細胞，用圖像分析軟件測定光密度值，取平均值代表凋亡神經(jīng)元陽性反應強弱。從每張免疫標記切片中隨機選取80個BDNF陽性細胞，用圖像分析軟件測定光密度值，取平均值代表免疫陽性細胞的免疫反應強弱。

所有數(shù)據(jù)用平均值±標準差（）表示，用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行組間數(shù)據(jù)差異性的ANOVA檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.神經(jīng)元密度統(tǒng)計與分析

尼氏染色切片中，視皮層層次分明，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰，細胞形態(tài)、大小各異，胞體和突起被染成藍紫色或淺藍色。根據(jù)尼氏染色結(jié)果，可將貓視皮層分為6層，從外向內(nèi)依次為分子層（I）、外顆粒層（Ⅱ）、外錐體層（III）、內(nèi)顆粒層（IV）、內(nèi)錐體層（V）和多形層（VI）（圖1：A－B）。

光鏡下觀察并統(tǒng)計氯胺酮處理組和對照組切片中視皮層灰質(zhì)第I、II－III、IV、V、VI層的神經(jīng)元密度。單因素方差分析結(jié)果顯示，各組內(nèi)視皮層尼氏染色神經(jīng)元密度存在顯著的層次差異性（P＜0.05），表現(xiàn)為第I層尼氏染色神經(jīng)元密度相對較低，II－III、IV、V、VI層神經(jīng)元密度相對較高，第IV層神經(jīng)元密度相對小于第II－III、V 和 VI層，但II－III、V、VI層之間的神經(jīng)元密度無明顯差異（表1）。神經(jīng)元密度在組內(nèi)個體間無顯著差異（P＞0.05）。視皮層各層的神經(jīng)元密度在組間未發(fā)現(xiàn)顯著差異（P＞0.05），這表明實驗組貓視皮層各層的神經(jīng)元密度與對照組相比沒有顯著差異。

表1 示各組實驗貓初級視皮層第I、II－III、IV、V、VI層尼氏染色神經(jīng)元密度Table1 Show the density of Nissl－stained neurons in the layer I，II－III，IV，V and VI of the primary visual cortex in each group of cats

2.凋亡細胞陽性反應強度測量與分析

TUNEL法染色后，鹽酸氯胺酮處理組和對照組切片中可見標記的凋亡細胞，形態(tài)學上表現(xiàn)為不同程度的核固縮，染色質(zhì)凝聚，TUNEL染色呈棕黃色或黃褐色顆粒（圖2：A－B）。

因凋亡神經(jīng)元細胞核陽性反應程度有較大差異，有的反應強，而有的則很弱（圖2：A－B），用陽性細胞密度不能合理地評價細胞凋亡狀況，因此我們通過測定凋亡神經(jīng)元TUNEL陽性反應的光密度值（IOD）來衡量細胞凋亡的程度。

對隨機取樣的凋亡細胞光密度值分析結(jié)果顯示，氯胺酮處理組平均光密度值與對照組相比顯著增加（P＜0.01）（圖3），表明長期重復使用氯胺酮麻醉會導致視皮層內(nèi)神經(jīng)元出現(xiàn)程序性凋亡。

圖1 示對照組（A、C）及鹽酸氯胺酮處理組（B、D）貓的視皮層灰質(zhì)各層中尼氏染色神經(jīng)元。A、B示視皮層第I、II－III、IV、V、VI層，C、D示第III層錐體細胞。標尺為50μm。Fig.1 Show Nissl－stained neurons in each layer of the visual cortex in control（A，C）and ketamine－treated（B，D）cats.A and B display layer I，II－III，IV，V and VI in the visual cortex.C and D display pyramidal cells in the layer III.The scale bar equals to 50μm.

圖2 示對照組貓（A）和鹽酸氯胺酮處理組貓（B）的視皮層中細胞凋亡陽性神經(jīng)元（圓圈指示）。Fig.2 Show apoptotic neurons（as circles indicated）in the visual cortex of control（A）and ketamine－treated（B）cats.

圖3 示鹽酸氯胺酮處理組和對照組貓的視皮層中TUNEL標記陽性神經(jīng)元的平均光密度（IOD）值。鹽酸氯胺酮處理組的IOD值比對照組顯著增加（＊＊P＜0.01）。Fig.3 Show the average IOD （Integrated optical density）value of TUNEL－labeled neurons in the visual cortex of ketamine－treated and control cats.The mean IOD value in ketamine－treated cats was significantly increased when compared with that in control cats（＊＊P＜0.01）.

3.BDNF免疫陽性細胞密度統(tǒng)計與分析

鹽酸氯胺酮處理組和對照組視皮層中均有BDNF免疫陽性細胞分布，免疫陽性物質(zhì)主要集中在胞體細胞質(zhì)中，使胞體呈褐色或棕褐色，軸突和樹突處染色較淺，呈棕色或淺棕色（圖4：A－F）。

組內(nèi)方差分析結(jié)果顯示，各組實驗貓視皮層BDNF免疫陽性神經(jīng)元密度存在顯著的層次差異性（P＜0.05），表現(xiàn)為第I層BDNF免疫陽性細胞密度相對較低，第II－III、IV、V、VI層BDNF免疫陽性細胞密度相對較高；第IV層BDNF免疫陽性細胞密度相對小于II－III、V、VI層，而II－III、V、VI層之間的免疫陽性細胞密度無明顯差異（表2）。BDNF免疫陽性細胞密度在組內(nèi)個體間無顯著差異（P＞0.05）。

組間方差分析結(jié)果顯示，氯胺酮處理組中視皮層各層BDNF免疫陽性細胞密度較對照組顯著增加 （P＜0.05）（圖4：A－F；表2）。二組數(shù)據(jù)比較分析結(jié)果顯示，麻醉劑氯胺酮會顯著增加BDNF蛋白在視皮層各層的表達，與對照組相比，氯胺酮處理組中視皮層第I、II－III、IV、V、VI層 BDNF免疫陽性細胞密度顯著增加（P＜0.01）（表2）。

圖4 示對照組（A、C、E）和鹽酸氯胺酮處理組（B、D、F）貓的視皮層中BDNF免疫陽性神經(jīng)元（圓圈指示）。A、B示視皮層灰質(zhì)冠狀切面整體觀；C、D示第V/VI層BDNF免疫陽性神經(jīng)元；E、F示第V層BDNF免疫陽性錐體細胞，標尺＝50μm。Fig.4 Show BDNF immunoreactive neurons（as circles indicated）in the visual cortex of control（A，C，E）and ketaminetreated（B，D，F(xiàn)）cats.A and B are coronal sections showing aglobal view of the gray matter in the visual cortex.The scale bar equals to 50μm.C and D show BDNF positive neurons in the layer V/VI.The scale bar equals to 50μm.E and F show BDNF positive pyramidal neurons in the layer V.The scale bar equals to 50μm.

表2 示各組實驗貓初級視皮層第I、II－III、IV、V、VI層BDNF免疫陽性神經(jīng)元密度Table2 Show the density of BDNF－immunoreactive neurons in the layer I，II－III，IV，V and VI of the primary visual cortex in each group of cats

4.BDNF免疫反應強度測量與分析

光鏡下觀察，鹽酸氯胺酮處理組中BDNF蛋白免疫陽性神經(jīng)元著色較深，而對照組BDNF陽性神經(jīng)元著色較淺。

對各層內(nèi)隨機抽取的BDNF免疫陽性神經(jīng)元進行平均光密度分析結(jié)果顯示，鹽酸氯胺酮處理組平均光密度值與對照組相比顯著增加（P＜0.01）（圖5）。以上分析表明，重復鹽酸氯胺酮麻醉能顯著增加成年貓視皮層BDNF蛋白表達。

圖5 示鹽酸氯胺酮處理組和對照組貓的視皮層中BDNF免疫陽性神經(jīng)元的平均光密度（IOD）值。鹽酸氯胺酮處理組的IOD值比對照組顯著增加（＊＊P＜0.01）。Fig.5 Show the average IOD （Integrated optical density）value of BDNF immunoreactive neurons in the visual cortex of ketamine－treated and control cats.The mean IOD value in the ketamine－treated cats was significantly increased when compared with control cats（＊＊P＜0.01）.

討 論

隨著現(xiàn)代臨床醫(yī)學和動物實驗中麻醉劑使用日益增多，人們對麻醉劑可能引起的腦功能損傷問題越來越關注［14］。

氯胺酮是一種非競爭性NMDA受體通道的拮抗劑，它通過抑制興奮性突觸活動發(fā)揮鎮(zhèn)靜作用［15，16］。因為其對心臟和呼吸功能的影響很小，氯胺酮已成為臨床和生理學試驗中廣泛使用的麻醉劑。以前的實驗結(jié)果顯示，單次或短期（3－4d）重復使用（＜6次）麻醉劑量的氯胺酮可以引起發(fā)育中的靈長類和嚙齒類動物腦內(nèi)出現(xiàn)大量的神經(jīng)元凋亡，并導致認知功能損傷［17，18］，但對成年動物腦或成熟神經(jīng)元的影響不明顯［19］。膜片鉗研究顯示，氯胺酮對發(fā)育中神經(jīng)元NMDA受體通道的抑制作用強，作用時程長，而對成熟神經(jīng)元的抑制作用較弱且作用時程很短［6］，因此單次或短期使用氯胺酮可能不會引起成年腦內(nèi)出現(xiàn)類似未成熟腦中因NMDA受體的補償性增生而導致的神經(jīng)毒性和細胞死亡［5］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長期（60d）重復使用（20次）氯胺酮雖未引起成年貓視皮層神經(jīng)元丟失，但神經(jīng)元TUNEL陽性反應顯著增強。綜合研究文獻和我們的研究結(jié)果推測，單次或短暫使用氯胺酮對成年腦的神經(jīng)毒害作用很弱，但長期重復使用可能會產(chǎn)生累計效應，并啟動程序性細胞凋亡進程。事實上，對發(fā)育中的腦可能也存在類似的累計效應，因為有研究發(fā)現(xiàn)，單次使用氯胺酮并不能引起幼鼠腦內(nèi)出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元凋亡，但重復使用氯胺酮即使是低劑量的也會顯著增加凋亡的神經(jīng)元數(shù)量［20］。

使用氯胺酮和其他麻醉劑易導致發(fā)育中腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡，但對成年腦的影響作用較弱，其原因可能與腦內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌量有關，因為神經(jīng)元的發(fā)育、存活、功能維持及神經(jīng)可塑性均與神經(jīng)營養(yǎng)因子特別是腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）介導的信號通路的活動有直接關系［7，8］。有研究結(jié)果顯示，使用NMDA受體的抑制劑（MK801）會導致幼年大鼠很多腦區(qū)出現(xiàn)大量的神經(jīng)元凋亡，在注射后4h取樣的腦組織中還伴隨著神經(jīng)營養(yǎng)因子特別是BDNF表達的下降以及ERK1/2－CREB信號活動減弱，而補充BDNF可完全阻止MK801誘導的神經(jīng)元凋亡［21］。另有相似的研究結(jié)果顯示，重復使用（7次）氯胺酮麻醉會導致幼鼠腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡，但在麻醉注射15h后取樣的腦組織中卻出現(xiàn)BDNF表達的顯著增加。由此推測，氯胺酮麻醉對幼鼠腦內(nèi)未成熟神經(jīng)元的抑制作用時程較長［6］，導致BDNF的表達在麻醉后被長時間地抑制，以致發(fā)育中神經(jīng)元的生長、分化和生存受到嚴重影響而出現(xiàn)凋亡。本研究用氯胺酮重復麻醉（20次）成年貓2m，發(fā)現(xiàn)視皮層內(nèi)BDNF蛋白的表達比對照貓的顯著增強，這與最近在抑郁癥病人中使用氯胺酮引起的BDNF表達快速上調(diào)的報道相一致［1］。我們認為，氯胺酮麻醉引起成年腦中BDNF表達水平的增加可能是因為氯胺酮介導的NMDA受體抑制對成年腦中成熟神經(jīng)元的作用較弱，且作用時程較短（1－6h）［10］，因此BDNF的表達會長時間地維持在較高水平，它通過TrkB等受體信號通路使NMDA受體表達上調(diào)［22］和 GABAA受體活動抑制［23］，以對抗氯胺酮對興奮性突觸活動的抑制，從而對神經(jīng)元起保護作用。

總之，長期重復使用氯胺酮麻醉對成年貓視皮層神經(jīng)元的數(shù)量影響不明顯，但會引起部分神經(jīng)元加快程序性凋亡的進程，同時視皮層內(nèi)BDNF蛋白的表達出現(xiàn)顯著上調(diào)，提示成年腦在氯胺酮的毒性影響作用下會啟動神經(jīng)保護機制，以抑制或減緩神經(jīng)元的凋亡進程。該研究結(jié)果對臨床醫(yī)學以及動物慢性生理學實驗中氯胺酮及其他麻醉劑的重復使用問題有重要的參考價值。

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