納豆菌發(fā)酵玉米蛋白粉制備玉米肽工藝優(yōu)化

徐艷陽，朱志紅，李晴，唐洋洋，張凌

（吉林大學生物與農(nóng)業(yè)工程學院，吉林長春130022）

納豆菌發(fā)酵玉米蛋白粉制備玉米肽工藝優(yōu)化

徐艷陽，朱志紅，李晴，唐洋洋，張凌

（吉林大學生物與農(nóng)業(yè)工程學院，吉林長春130022）

為了探索玉米肽的制備技術，以玉米蛋白粉為基質(zhì)，應用納豆菌發(fā)酵法制備玉米肽工藝進行了試驗研究。分別對接種量體積分數(shù)、玉米蛋白粉質(zhì)量分數(shù)、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間進行了單因素試驗研究，采用四因素三水平正交試驗設計對玉米肽發(fā)酵工藝條件進行了優(yōu)化，得到最優(yōu)條件為：發(fā)酵溫度40℃、發(fā)酵時間72 h、接種量體積分數(shù)4%、玉米蛋白粉質(zhì)量分數(shù)5%。在此最優(yōu)條件下發(fā)酵，玉米蛋白粉的水解度為11.17%，與理論預測值基本相符。

玉米蛋白粉；玉米肽；納豆菌；水解度；正交試驗

玉米蛋白粉是工業(yè)上濕法生產(chǎn)玉米淀粉或釀酒等的主要副產(chǎn)物，其蛋白質(zhì)含量高達60%～70%，具有極大開發(fā)價值[1-2]。但通常被直接用作飼料或隨廢液自然排放掉，這樣不僅浪費了玉米蛋白資源，而且造成環(huán)境污染。將玉米蛋白經(jīng)酶或微生物發(fā)酵水解得到的小分子高活性玉米肽，不但易于消化吸收，還具有抗氧化、延緩衰老、增強免疫功能和醒酒、抗疲勞、保肝等多種保健功能[3-5]。因此，為開發(fā)利用玉米蛋白粉資源，提高其附加值，制備功能性玉米肽是一種有效途徑之一。

微生物發(fā)酵法制備活性肽可以減少苦味的產(chǎn)生，降低營養(yǎng)素的損失，適合工業(yè)化生產(chǎn)，是一種很有發(fā)展?jié)摿Φ姆椒?。納豆菌是日本傳統(tǒng)發(fā)酵食品納豆的生產(chǎn)菌種，在日本已被使用了兩千多年。目前國內(nèi)學者張智[6]等應用枯草芽孢桿菌ls-45發(fā)酵法水解玉米蛋白粉制取了玉米肽。李軍軍[7]等用米曲霉固態(tài)發(fā)酵玉米胚芽粕制備玉米肽的研究。劉波[8]等用納豆菌蛋白酶水解玉米醇溶蛋白抗氧化活性研究。吳澤柱[9-10]從永川豆豉中篩選并馴化出枯草芽孢桿菌，用其水解玉米蛋白粉得到玉米肽。鑒于采用具有較優(yōu)酶系的納豆菌發(fā)酵制備玉米肽研究較少，因此本文應用納豆菌對玉米蛋白粉發(fā)酵制備玉米肽工藝進行優(yōu)化研究，為玉米蛋白粉的深加工和工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)玉米肽提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

納豆菌（Bacillus natto）：吉林大學生物與農(nóng)業(yè)工程學院食品微生物實驗室提供。

1.1.2 主要原料和試劑

玉米蛋白粉（蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為61.26%）：長春市大成淀粉廠；蛋白胨、葡萄糖、瓊脂：北京奧博星生物技術有限責任公司；氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、酚酞、溴麝香草酚藍、乙醇、甲醛：北京化工廠。

1.1.3 主要儀器

F80型高速粉碎機：金城市金城國勝實驗儀器廠；DHP060型恒溫培養(yǎng)箱：上海實驗儀器廠；LD4-2A型低速離心機：北京市雷勃爾離心機有限公司；DSX-280A型高壓蒸汽滅菌鍋：上海宜川儀器廠；BS-IE振蕩培養(yǎng)箱：國華電器有限公司；JJ200電子天平：常熟市雙杰測試儀器廠；PHS-3D精密pH計：上海精科有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基配方[11]：2.0 g瓊脂、2.0 g葡萄糖、1.0 g蛋白胨、0.1 g磷酸氫二鉀、0.05 g硫酸鎂、100 mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至7.0。

種子培養(yǎng)基配方[11]：2.0 g葡萄糖、1.0 g蛋白胨、0.1 g磷酸氫二鉀、0.05 g硫酸鎂、100 mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至7.0。

1.2 方法

1.2.1 納豆菌懸液的制備

1.2.1.1 納豆菌的活化

用接種環(huán)挑取納豆菌一環(huán)，置于裝有10 mL無菌水的試管中充分混勻，制成懸濁液。取少量懸濁液，在斜面培養(yǎng)基平板上涂劃線后，置培養(yǎng)箱中在35℃恒溫條件下培養(yǎng)24 h～48 h，備用。

1.2.1.2 種子菌懸液的制備

從斜面培養(yǎng)基平板上挑取菌種接入裝有100 mL種子培養(yǎng)基的三角瓶中，在37℃、180 r/min的條件下，搖床振蕩培養(yǎng)18 h，制成107CFU/mL～108CFU/mL菌液，作為用于發(fā)酵玉米蛋白粉的納豆菌種子液，備用。

1.2.2 玉米蛋白粉的預處理

準確稱取1.00 g玉米蛋白粉，加20 mL水浸泡24 h后，120℃蒸煮10 min，取出冷卻至一定溫度，即得玉米蛋白粉質(zhì)量分數(shù)為5%的發(fā)酵原料，備用[12]。

1.2.3 玉米蛋白粉的水解

準確稱取質(zhì)量分數(shù)5%發(fā)酵原料，接入一定體積分數(shù)納豆菌液，置于培養(yǎng)箱中，在一定溫度條件下發(fā)酵水解。達到預定水解時間后，取出置100℃水浴中加熱10 min滅酶，然后迅速冷卻至室溫，4 000 r/min離心10 min得上清液，為蛋白水解液。

1.3 玉米蛋白粉水解度（DH）的測定

以水解度為指標，利用甲醛滴定法測定蛋白水解液的水解度[13]。其計算公式如下：

式（1）中：DH為玉米蛋白粉的水解度值；V1為滴定樣品消耗氫氧化鈉的體積，mL；V2為滴定空白消耗氫氧化鈉的體積，mL；V3為發(fā)酵液（納豆菌液和蒸餾水）體積，mL；Mg為玉米蛋白粉中蛋白質(zhì)的質(zhì)量，mg；1.400 8為1 mL 0.1 mol/L氫氧化溶液相當?shù)牡浚琺g。1.4 單因素及正交試驗優(yōu)化設計

1.4.1 玉米蛋白粉質(zhì)量分數(shù)對玉米蛋白粉水解度的影響

準確稱取玉米蛋白粉1.00 g，分別浸入10、20、30、40、50 mL水中浸泡24 h后，120℃蒸煮10 min，取出冷卻至一定溫度，即得質(zhì)量分數(shù)為10%、5%、3.3%、2.5%、2%發(fā)酵原料。接入體積分數(shù)3%納豆菌液，在40℃恒溫條件下發(fā)酵72 h后，在100℃水浴中加熱10 min滅酶，然后迅速冷卻至室溫，4 000 r/min離心10 min得蛋白水解液，測定水解度。

1.4.2 發(fā)酵時間對玉米蛋白粉水解度的影響

按1.2.2操作預處理得到質(zhì)量分數(shù)5%發(fā)酵原料后，接入體積分數(shù)3%納豆菌液，在40℃恒溫條件下分別發(fā)酵24、42、72、96、120 h，達到預定水解時間后，按1.2.3操作，得蛋白水解液，測定水解度。

1.4.3 接種量體積分數(shù)對玉米蛋白粉水解度的影響

按1.2.2操作預處理得到質(zhì)量分數(shù)5%發(fā)酵原料后，分別接入體積分數(shù)1%、2%、3%、4%、5%納豆菌液，在40℃恒溫條件下發(fā)酵72 h后，按1.2.3操作，得蛋白水解液，測定水解度。

1.4.4 發(fā)酵溫度對玉米蛋白粉水解度的影響

按1.2.2操作預處理得到質(zhì)量分數(shù)5%發(fā)酵原料后，接入體積分數(shù)3%納豆菌液，分別在32、36、40、44、48℃恒溫條件下發(fā)酵72 h后，按1.2.3操作，得蛋白水解液，測定水解度。

1.4.5 正交試驗設計

在單因素試驗結(jié)果基礎上，以水解度為指標，設計L9（34）正交試驗，對玉米蛋白粉水解條件進行優(yōu)化，采用SPSS軟件對正交試驗數(shù)據(jù)進行極差和方差分析，因素水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米蛋白粉質(zhì)量分數(shù)對玉米蛋白粉的水解度影響在接種量體積分數(shù)、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間相同的條件下，考查不同玉米蛋白粉質(zhì)量分數(shù)對玉米蛋白粉水解度的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 玉米蛋白粉質(zhì)量分數(shù)對玉米蛋白粉水解度的影響Fig.1 Influence of mass fraction of corn protein powder on DH

由圖1可知，玉米蛋白粉質(zhì)量分數(shù)5%時，發(fā)酵后玉米蛋白粉水解度最大。玉米蛋白粉質(zhì)量分數(shù)低于5%時，隨著蒸餾水體積增多，水解度變小。原因可能是蒸餾水體積的增多，導致玉米蛋白粉濃度降低，納豆菌產(chǎn)生的酶濃度降低，未能充分水解玉米蛋白粉。玉米蛋白粉質(zhì)量分數(shù)高于5%時，水解度呈下降趨勢，原因可能是玉米蛋白粉未能充分浸泡蒸煮，而影響其發(fā)酵水解度。故玉米蛋白粉質(zhì)量分數(shù)5%時，對玉米蛋白粉做預處理為較佳條件。

2.2 發(fā)酵時間對玉米蛋白粉的水解度影響

在玉米蛋白粉質(zhì)量分數(shù)、發(fā)酵溫度、接種量體積分數(shù)相同條件下，考查不同發(fā)酵時間對玉米蛋白粉水解度的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 發(fā)酵時間對玉米蛋白粉水解度的影響Fig.2 Influence of fermentation time on DH of corn protein powder

由圖2可知，發(fā)酵時間在72 h時，玉米蛋白粉的水解度達到最高，在72 h之前，呈上升趨勢，其原因可能是隨著發(fā)酵時間的增加，菌體產(chǎn)生水解玉米蛋白粉的蛋白酶增多。超過72 h之后，玉米蛋白粉水解度略有下降趨勢，其原因可能是發(fā)酵液中的營養(yǎng)成分缺乏，使菌種的生長和產(chǎn)酶能力受到了限制。因此，發(fā)酵時間選取72 h較佳。

2.3 接種量體積分數(shù)對玉米蛋白粉的水解度影響

在玉米蛋白粉質(zhì)量分數(shù)、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間相同條件下，考查不同的接種量體積分數(shù)對玉米蛋白水解度的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 接種量體積分數(shù)對玉米蛋白粉水解度的影響Fig.3 Influence of volume fraction of inoculums size on DH of corn protein powder

由圖3可知，發(fā)酵原料中接入體積分數(shù)3%納豆菌對其發(fā)酵時，其水解度最大。當接種量體積分數(shù)少于3%時，其水解度呈上升趨勢，其原因是納豆菌少時產(chǎn)生的酶較少，發(fā)酵原料不能充分作用，隨著接種量體積分數(shù)增加，產(chǎn)生的蛋白酶隨之增加，水解度變大。當接種量體積分數(shù)多于3%時，其水解度呈下降趨勢。隨著納豆菌增加，所需的營養(yǎng)成分缺乏，使菌種的生長和產(chǎn)酶能力受到了限制。因此，選取接種量體積分數(shù)為3%較佳。

2.4 發(fā)酵溫度對玉米蛋白粉的水解影響

在玉米蛋白粉質(zhì)量分數(shù)、發(fā)酵時間、接種量體積分數(shù)相同條件下，考查不同發(fā)酵溫度對玉米蛋白粉水解度的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)酵溫度對玉米蛋白粉水解度的影響Fig.4 Influence of fermentation temperature on DH of corn protein powder

由圖4可知，32℃～40℃時，隨著發(fā)酵溫度的升高，玉米蛋白粉的水解度變大，40℃時，其水解度最大，超過40℃后，其水解度變小，其原因是溫度較低時，未達到納豆菌生長繁殖和酶的最適溫度。溫度過高使納豆菌產(chǎn)生的蛋白酶部分失活。故發(fā)酵溫度選取40℃較佳。

2.5 玉米蛋白粉的發(fā)酵工藝正交試驗結(jié)果

對玉米蛋白粉水解條件進行極差和方差分析，結(jié)果見表2和表3。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiments

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of ANOVA

2.6 優(yōu)勢組合試驗指標的點估計及其置信區(qū)間1）優(yōu)勢組合水解度的估計：

2）區(qū)間估計為

y優(yōu)±εα（本試驗顯著因素的最大顯著性水平α= 0.01）

式（3）中：fe′為不顯著因素與不顯著交互作用的自由度之和；Se′為不顯著因素與不顯著交互作用的偏差平方和之和；N為試驗總次數(shù)；f*為顯著因素與顯著交互作用的自由度之和。

由于fe=18；fe′=0；fe*=8；Se=0.970；Se′=0；N= 9；F0.01（2，18）=6.01；

綜上所述，對玉米蛋白粉水解條件優(yōu)化組合分析：由R可知影響其水解條件的最優(yōu)條件因素主次是D>B>C>A，對表直觀分析可確定優(yōu)化組合是A2B3C2D2。即接種量體積分數(shù)4%、玉米蛋白粉質(zhì)量分數(shù)5%、發(fā)酵溫度40℃、發(fā)酵時間72 h。正交試驗中優(yōu)勢組合的水解度理論預測值為11.25%，水解度的置信區(qū)間在（11.25-0.57）%和（11.25+0.57）%之間，即在10.68%～11.82%之間，此時的置信度為99%。

2.7 驗證試驗

在最優(yōu)發(fā)酵條件下對玉米蛋白粉水解，做三次重復實驗。測得玉米蛋白粉水解度均值為11.17%，在置信區(qū)間10.68%～11.82%內(nèi)，與理論預測值基本相符。

3 結(jié)論

通過對納豆菌發(fā)酵玉米蛋白粉制備玉米肽的單因素試驗和四因素三水平正交試驗，分析了對接種量體積分數(shù)、玉米蛋白粉質(zhì)量分數(shù)、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間四因素對玉米蛋白粉制備玉米肽水解度的影響。得出最優(yōu)水解條件：發(fā)酵溫度為40℃，發(fā)酵時間為72 h，接種量體積分數(shù)為4%，玉米蛋白粉質(zhì)量分數(shù)為5%。此水解條件在顯著性水平α=0.01上做驗證試驗，得到玉米蛋白粉水解度為11.17%。與理論預測值基本相符。

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Optimization of Fermentation Process for Polypeptide from Corn Protein Powder via Bacillus Natto

XU Yan-yang，ZHU Zhi-hong，LI Qing，TANG Yang-yang，ZHANG Ling
（College of Biological and Agricultural Engineering，Jilin University，Changchun 130022，Jilin，China）

In order to explore preparation technique of corn peptides，fermentation process of corn peptides from corn protein powder via bacillus natto was studied.Based on single factor experiments of volume fraction of inoculums size，mass fraction of corn protein powder，fermentation temperature and fermentation time，fermentation conditions of corn peptides were optimized by orthogonal experiments design of four-factor and three-level.Optimal fermentation conditions were fermentation temperature of 40℃，fermentation time of 72 h，volume fraction of inoculums size of 4%and mass fraction of corn protein powder of 5%.Under this fermentation conditions，degree of hydrolysis of corn protein powder was at 11.17%，which was consistent with theoretical prediction value.

corn protein powder；corn peptides；Bacillus natto；degree of hydrolysis；orthogonal experiment

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.19.021

2013-04-23

吉林大學大學生創(chuàng)新訓練計劃項目（2012C45167）；吉林省科技發(fā)展計劃項目（20120717）；吉林大學基本科研業(yè)務費項目（2013138；200903263）

徐艷陽（1972—），女（漢），副教授，博士，主要從事食品營養(yǎng)與安全研究。