響應(yīng)面法優(yōu)化艾蒿黃酮的微波提取工藝的研究

王婷婷，楊雯雯，李巖，傅航

（漯河職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程系，河南漯河462000）

響應(yīng)面法優(yōu)化艾蒿黃酮的微波提取工藝的研究

王婷婷，楊雯雯，李巖，傅航

（漯河職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程系，河南漯河462000）

采用微波輔助提取法對艾蒿黃酮的提取工藝進行研究。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用BBD（Box-Behnken Design）響應(yīng)面法優(yōu)化艾蒿黃酮提取工藝條件，結(jié)果表明，艾蒿黃酮提取的最佳工藝條件為：微波功率240 W，酒精濃度為71%，料液比為1∶25.5（g∶mL），微波時間為2.5min，在此條件下提取2次，艾蒿黃酮含量為26.25mg/g。

響應(yīng)面；微波；艾蒿；黃酮；提取

艾蒿是菊科蒿屬多年生野生草本植物，作為我國傳統(tǒng)的中藥之一其主要有效成分有很多，包括揮發(fā)油、萜類、黃酮類、香豆素類、色原酮類等化合物[1]。沈銘高[2]利用氣質(zhì)聯(lián)用儀分析了艾草的化學(xué)成分，得出了艾草莖有38種、葉有43種活性物質(zhì)。黃酮是植物的一些次級代謝產(chǎn)物，是許多中草藥的有效成分，許多研究表明，黃酮類化合物具有降脂、抗血栓、抗氧化、抗衰老、抗心率失常等作用[3]，所以其具有極廣的開發(fā)應(yīng)用前景。

目前提取黃酮類的方法很多，研究對象也很多，但微波輔助提取艾蒿中黃酮的報道。本試驗以乙醇作為提取劑，采用微波法，通過單因素試驗和響應(yīng)面法對艾蒿黃酮的提取工藝進行了優(yōu)化。為艾蒿的進一步開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

艾蒿：采自漯河。選取有光澤，莖葉完整艾蒿，蒸餾水洗凈后晾干，60℃烘箱中烘干，然后磨成細粉，用石油醚70℃回流2次，3 h/次，除去脂及脂溶性色素，濾渣60℃烘干，備用。

試劑：無水乙醇、亞硝酸鈉、蘆丁、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純。

1.2 儀器

7200型紫外—可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；DHG-9101-0型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；WG700SL23-K6微波爐：美的股份有限公司；FA1004型電子天平：上海上平儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 總黃酮含量的測量[4]

以蘆丁為標(biāo)樣，與亞硝酸鈉—硝酸鋁發(fā)生顯色反應(yīng)，通過吸光度的測定繪制標(biāo)準曲線，為Y=0.420 1X+ 0.012 1，從而測定艾蒿中的黃酮含量。

1.3.2 樣品的測定

取提取液0.1 mL，置于25 mL容量瓶中，加水至12.5 mL，加5%亞硝酸鈉溶液0.7 mL搖勻，放置5 min后，精確加入10%硝酸鋁溶液0.7 mL搖勻，放置5 min加人1 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL，水稀釋至刻度。以水為空白，于510 nm波長下測定吸光度Y，由標(biāo)準曲線得對應(yīng)濃度X，可算得艾蒿樣品的總黃酮含量。

1.3.3 微波處理預(yù)試驗[5]

取相同的三角瓶，分別加乙醇30 mL，用保鮮膜封口，分別在不同的功率下進行處理，觀察發(fā)現(xiàn)樣品在80 W下240 s沸騰，240 W下180 s沸騰，480 W下40 s沸騰。為便于試驗控制，微波功率選擇為240 W。以后的實驗中微波輻射時間均應(yīng)短于相應(yīng)微波強度的沸騰時間，超出沸騰時間，提取液容易濺出，實驗結(jié)果不準確。

1.3.4 單因素試驗

以提取劑選擇、乙醇濃度、提取次數(shù)、料液比、微波時間5個因素進行單因素試驗。

1.3.5 響應(yīng)面法實驗設(shè)計[6-7]

根據(jù)單因素試驗，優(yōu)化最佳條件的范圍，采用Box-Behnken設(shè)計實驗方案，分別以影響最大的因素為自變量（A：料液比；B：微波時間；C：酒精濃度），艾蒿黃酮含量為響應(yīng)值，每個變量分別以-1，0，1表示，設(shè)計響應(yīng)面試驗（見表1），進行三因素三水平共計17個試驗點（5個中心點）的二次回歸組合設(shè)計試驗，確定提取的最佳工藝條件。

表1 響應(yīng)面三因素三水平試驗設(shè)計Table 1 Experimental design of 3 factors and 3 levels in response surface method

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的確定

黃酮的提取方法有很多種，主要有水提取法、有機溶劑回流法、超聲波提取法等。有機溶劑易滲入至原料內(nèi)部，提取效果好于水提取法；超聲波提取法效果也很好，但設(shè)備不常用，實驗時受到限制[8]。由于乙醇原料易得，食用安全性高，價格較低且回收容易，因此本實驗選用乙醇作為艾蒿黃酮的提取溶劑。

2.2 乙醇濃度對黃酮含量的影響

稱取0.5 g樣品于三角瓶中。按料液比為1∶30（g∶mL），分別加入濃度為30%、60%、70%、80%的乙醇，微波240 W加熱2 min，提取兩次間隔時間為5 min（下同），取出，冷卻，過濾，定容至30 mL。測定不同乙醇濃度下黃酮的含量，見圖1。

圖1 不同乙醇濃度對黃酮提取量的影響Fig.1 Effects of different the concentration of on the content of flavonoids

結(jié)果顯示，乙醇濃度對黃酮含量影響較大，在乙醇濃度低于70%時，艾蒿葉黃酮的含量隨乙醇濃度的增大而提高，這可能是隨著濃度的增大，細胞內(nèi)外滲透壓增大，細胞失水，從而促進黃酮溶出，但當(dāng)乙醇濃度高于70%時，艾蒿黃酮的含量卻降低，這可能與黃酮種類有關(guān)[9]，本文后續(xù)實驗選擇乙醇濃度為70%。

2.3 提取次數(shù)對黃酮含量的影響

稱取樣品0.5 g于三角瓶中，在70%的乙醇，液料比為1∶30（g/mL），微波時間2 min，240 W條件下，提取次數(shù)分別為1、2、3、4次，測定并計算提取液中黃酮的含量，結(jié)果見圖2。

圖2 不同提取次數(shù)對黃酮提取量的影響Fig.2 Effects of different the extraction ethanol times on the content of flavonoids

實驗結(jié)果顯示，4次浸提對黃酮總量的分別為18.9、21.9、22.1、22.2 mg/g，說明前2次浸提已將絕大部分黃酮類物質(zhì)提取出來，故選擇提取次數(shù)為2次。

2.4 料液比對黃酮含量的影響

稱取樣品0.5 g于三角瓶中，選擇在料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），乙醇濃度70%，提取時間為2 min，功率為240 W的條件下提取2次，測定并計算提取液中黃酮的含量，見圖3。

圖3 不同料液比對黃酮提取量的影響Fig.3 Effects of different material-liquid ratio On the content of flavonoids

實驗結(jié)果表明，含量隨液料比的增大出現(xiàn)先升高后下降的趨勢，先升高的原因可能是料液比增大促使體系傳質(zhì)推動力增大，從而有利于黃酮的溶出，到1∶30（g/mL）達到最大，以后黃酮的含量逐漸下降，這可能是因為體系總體積增大時，溶劑吸收了更多熱量，從而使黃酮的溶出時間變長。綜合考慮本實驗采用料液比1∶30（g/mL）。

2.5 微波時間對艾蒿黃酮含量的影響

稱取樣品0.5 g于三角瓶中。按料液比1∶30，70%乙醇，提取2次。微波240 W加熱1.5、2.0、2.5、3.0 min，測定不同微波時間下黃酮的含量，見圖4。

圖4 不同微波時間對黃酮提取量的影響Fig.4 Effects of different micro-wave time On the content of flavonoids

圖4表明，隨微波時間的延長，黃酮含量呈先增加而后降低的趨勢，在微波時間2.5 min時含量最高。當(dāng)微波時間超過2.5 min后，含量呈下降趨勢。這可能是隨著微波時間延長，溶液達到沸騰，導(dǎo)致乙醇揮發(fā)，從而影響了提取效果，故本實驗選擇微波時間選擇2.5 min。

3 響應(yīng)面分析法

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定對影響艾蒿中總黃酮含量的主要因素為乙醇濃度、微波時間、料液比，對這3個因素進行box-behnken實驗設(shè)計，從而得到優(yōu)化的提取工藝參數(shù)。

3.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

以乙醇濃度、提取溫度、提取時間為自變量，以艾蒿黃酮含量為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面分析試驗，試驗結(jié)果見表2。

表2 實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Test design and results of Box-behnken method

通過對表2試驗結(jié)果進行響應(yīng)面分析，經(jīng)過二次回歸擬合后，得出擬合方程如下：

黃酮含量=25.994 00-1.951 25A-0.728 75B-0.197 50C-2.157 00A2-1.792 00B2-3.899 50C2-0.955 00AB-1.517 50AC-0.347 50BC，其中方差分析見表3。

模型的方差分析結(jié)果表明，因變量和全體自變量之間相關(guān)性極顯著（R=155.14/158.29=0.980 0），說明模型能解釋98%的響應(yīng)值變化。模型的F值為38.25（P＜0.001），說明回歸模型極顯著。失擬項不顯（P=0.101 6），表明模型選擇合適，可用此模型對試驗進行分析和預(yù)測。顯著性檢驗表明，料液比對黃酮含量極顯著（P＜0.001），微波時間對黃酮含量顯著（P＜0.05），而酒精濃度對黃酮含量不顯著，料液比和酒精濃度兩因素間的交互作用影響極顯著（P＜0.05），料液比和微波時間兩因素間的交互作用影響顯著（P＜0.01）；從單因素影響來看，料液比對黃酮含量的影響較大，其次是微波時間，影響最小的是酒精濃度。

表3 方差分析表Table 3 Analysis table of varianc

3.2 響應(yīng)面分析對黃酮含量的影響

響應(yīng)面分析對黃酮含量的影響，見圖5～圖7。

圖5 料液比及微波時間對黃酮含量的響應(yīng)面分析Fig.5 Response surface plot for yield as the material-liquid ratio and micro-wave time

圖6 酒精濃度及料液比對黃酮含量的響應(yīng)面分析Fig.6 Response surface plot for yield as the material-liquid ratio and concentration of ethanol

圖5～圖7是根據(jù)回歸方程所得的各因素對黃酮含量影響的響應(yīng)面，一般選取2個交互的因素，其他因素固定在零水平，來對其進行響應(yīng)面分析，結(jié)果表明，當(dāng)?shù)雀呔€趨于圓形時，兩因素的交互作用弱，當(dāng)?shù)雀呔€呈現(xiàn)橢圓形時，兩因素作用最強。

圖5表示酒精濃度為70%時，料液比和微波時間對黃酮含量影響。黃酮含量隨著微波時間的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在2.46 min時達到最大，以后減少的趨勢減慢。隨著料液比的增大黃酮含量也出現(xiàn)先增大后減少的趨勢，在料液比為1∶25.67（g/mL）達到最大，后減少的趨勢較為顯著，這說明料液比的影響更加顯著，兩者交互作用顯著。經(jīng)分析，在酒精濃度為70%，料液比1∶25.67（g/mL），微波時間2.46 min時，黃酮含量達到最大值26.448 3 mg/g。

圖6表示，微波時間為2.5 min時，料液比與酒精濃度對黃酮含量影響。黃酮含量隨著料液比的增大而減少，減少趨勢明顯，表現(xiàn)為曲線較陡；隨著酒精濃度的增大，黃酮含量也出現(xiàn)先增大后減少的趨勢，酒精濃度為70.67%時達到最大，以后變化趨勢較緩慢，表現(xiàn)為曲線平滑，這說明料液比要比酒精濃度的影響顯著，經(jīng)分析微波時間在2.5 min時，料液比為1∶25.23（g/mL），酒精濃度為70.67%時黃酮含量值達到最大26.451 7 mg/g。

圖7表示料液比為1∶30（g/mL）時，微波時間與酒精濃度及其交互作用對黃酮含量影響。酒精濃度和微波時間的交互作用不明顯，等高線接近圓形，黃酮含量隨著酒精濃度和微波時間的增加都出現(xiàn)先增加后減少的趨勢，在微波時間為2.4 min，酒精濃度為69.83%時，黃酮含量達到最大為26.069 1 mg/g。

圖7 酒精濃度及微波時間對黃酮含量的響應(yīng)面分析Fig.7 Response surfzce plot for yield as the ratio of micro-wave time and concentration of ethanol

4 結(jié)論

通過響應(yīng)面優(yōu)化，得到實驗的最佳提取條件為，料液比為1∶25.43（g/mL），微波時間為2.48 min，酒精濃度為70.68%時，預(yù)測黃酮含量達到26.464 9 mg/g，為方便實驗，將實驗優(yōu)化為料液比為1∶25.5（g/mL），微波時間為2.5min，酒精濃度為71%，做艾蒿黃酮提取驗證試驗。艾蒿黃酮的實際一次提取率可達26.25 mg/g。本試驗中建立的數(shù)學(xué)模型能較好地預(yù)測各因素與提取率之間的關(guān)系。

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Optimization of the Microwave-assisted Extraction Technology of Flavonoids from Artemisia Argyi Using Response Surface Methodology

WANG Ting-ting，YANG Wen-wen，LI Yan，F(xiàn)U Hang
（Department of Food Engineering Luohe Vocational Technology College，Luohe 462000，Henan，China）

response surface；micro-wave；Artemisia Argyi；flavonoids；extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.19.009

2013-05-14

王婷婷（1981—），女（漢），講師，碩士，主要從事食品生物技術(shù)方面研究。

Abstract：Microwave-assisted extraction method was used to investigate the extraction of the flavonoidsfrom Artemisia argyi.The method of response surface analysis with BBD was adopted to optimize the extraction conditions of flavonoids on the basis of single-factor experiment．The results showed that optimal conditions for extraction of flavonoids could be reached that under micro-wave power of 240 W，ethanol concentration of 71%，ratio of material to solution of 1∶25.5（g∶mL），extracted 2 times and micro-wave time of 2.5 minutes．In such conditions，flavone content in Artemisia argyi was 26.25 mg/g.