光合細菌固定化及其對銅綠微囊藻的抑制

吳 珊任麗艷厲智成

(1.北京工業(yè)大學建筑工程學院,北京 100124;2.北京市水質(zhì)科學與水環(huán)境恢復工程重點實驗室,北京 100124)

光合細菌固定化及其對銅綠微囊藻的抑制

吳 珊1,2,任麗艷1,2,厲智成1,2

(1.北京工業(yè)大學建筑工程學院,北京 100124;2.北京市水質(zhì)科學與水環(huán)境恢復工程重點實驗室,北京 100124)

為探討光合細菌固定化后對銅綠微囊藻的抑制作用,比較了光合細菌的5種不同固定化方法及其特性,確定了最佳的固定化方法;在實驗室條件下進行菌藻共同培養(yǎng),通過試驗研究了固定化后的光合細菌與游離光合細菌對銅綠微囊藻生長的影響差異并確定了固定化光合細菌的最佳投加量。結(jié)果表明:采用沸石、碳酸鈣和海藻酸鈉混合包埋光合細菌的固定化方法最佳;固定化光合細菌對銅綠微囊藻抑制作用顯著,為83.55%,而相同量的游離光合細菌的抑制作用只有26.81%;最佳固定化光合細菌投加量為36 g/L。

細菌固定化技術(shù);光合細菌;銅綠微囊藻;抑制效應

隨著含氮(N)、磷(P)等營養(yǎng)物質(zhì)的污水大量排入水體,水中藻類暴發(fā)性增長,造成水體嚴重富營養(yǎng)化,給水體質(zhì)量、用水安全、景觀環(huán)境甚至人類健康各方面都帶來不利影響,為此有效控制藻類過度生長成為環(huán)境保護領(lǐng)域的研究熱點,其中向水中投加微生物、借助菌藻相互作用來控制藻類繁殖的綠色技術(shù)開始受到關(guān)注[1]。研究顯示,假單胞菌、黃桿菌、中性檸檬酸菌、光合細菌等通過釋放有毒物質(zhì)或通過與藻類競爭營養(yǎng)物質(zhì)可抑制藻類的生長[2-6],其中,光合細菌(Photosynthetic bacteria)適應性強,在厭氧和好氧條件下都能生長,其紫色非硫細菌屬在水產(chǎn)養(yǎng)殖、有機廢水處理等凈化污染水體方面具有其他微生物無法替代的優(yōu)勢[7-10]。

利用光合細菌以游離細胞的形式處理富營養(yǎng)化水體時,光合細菌在流水條件下易被沖走,靜水條件下易被其他生物所食用,且在缺乏吸附和繁殖載體時難以穩(wěn)定地長期發(fā)揮功能。近年來光合細菌固定化技術(shù)開始受到重視,但如何獲取高活性的固定化光合細菌及其對藻類抑制作用的效果還未見系統(tǒng)報道。本文通過試驗分析比較了幾種用于光合細菌固定化的載體,通過測定固定后光合細菌顆粒的各項理化指標,確定最佳的固定方法;并對比研究了游離光合細菌和固定化光合細菌對銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

沼澤紅假單胞菌(Rhodopeudomonas palustris)購自中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心;銅綠微囊藻購自中國科學院武漢水生生物研究所淡水藻種庫。

在透光密閉瓶中裝入光合細菌培養(yǎng)基[8],接種20%～30%的光合細菌菌液,在30℃、光照為5000lux條件下培養(yǎng)。試驗前將培養(yǎng)5d的光合細菌懸液在無菌條件下10000 r/min離心10 min,沉淀后用生理鹽水洗凈再離心,重復3次。用BG11培養(yǎng)基配成OD680(OD為光密度,680指測定波長為680 nm)為2.6菌懸液用于試驗。

1.2 方法

1.2.1 包埋固定化方法

固定化光合細菌的載體最常用的是海藻酸鈉(SA)、聚乙烯醇(PVA)、沸石等。根據(jù)光合細菌的特點,試驗選擇了5種方法,分別為海藻酸鈉基本固定化方法、4種凝膠劑(沸石、活性炭、碳酸鈣、沸石和碳酸鈣)分別與2%的海藻酸鈉混合制成包埋劑溶液的改進方法。具體操作為:將采用包埋比為20%的濃縮光合細菌菌液加入包埋劑溶液中,用12號針頭的無菌注射器從10 cm高處滴入質(zhì)量分數(shù)為2%的CaCl2飽和硼酸溶液中,放入冰箱中固定1 h形成均勻的小球,然后將pH調(diào)到8再繼續(xù)固定化24 h。

1.2.2 固定化光合細菌顆粒的抑藻試驗

無菌條件下將擴大培養(yǎng)10 d的銅綠微囊藻混勻后分裝入500 mL的三角瓶中,每瓶裝250 mL的等濃度藻液(初始藻細胞濃度為8.0×105個/mL)。按濃度梯度分別加入0g、9g、18g、27g、36g的固定化光合細菌顆粒、5 mL游離濃縮光合細菌菌液(相當于18 g固定化光合細菌顆粒的量)和等量的未包埋固定化光合細菌的顆粒作為空白對照組。每組設(shè)3個平行樣,搖勻后置于光照培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)條件為(25±1)℃,光暗比(光照時間與無光照時間之比)為12∶12,光照強度為2000 lux。每天定時搖動2～3次,隨機改變?nèi)瞧康奈恢?。自試驗開始,每天定時測定藻液濃度。

1.2.3 固定化光合細菌顆粒的理化性質(zhì)

a.細胞活性的測定:用總有機碳(TOC)去除率表示。取一定數(shù)量的固定化光合細菌顆粒放入裝有光合細菌培養(yǎng)基稀釋液的250 mL三角瓶中,在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),5 d后測定三角瓶內(nèi)的總有機碳濃度?？傆袡C碳去除率=(初始TOC濃度-剩余TOC濃度)/初始TOC濃度×100%。

b.機械強度測定:取固定后的光合細菌顆粒,通過施加砝碼觀察其被破壞情況,以所加砝碼的質(zhì)量來判斷固定化光合細菌的相對強度。

c.含水率測定:取一定數(shù)量固定化光合細菌顆粒,分別測定其含水狀態(tài)下的濕重和經(jīng)烘干后的干重(烘干至恒重)。含水率=(濕重-干重)/干重×100%。

d.傳質(zhì)性的測定:通過固定化光合細菌顆粒的亞甲基藍吸附百分比表示。取一定數(shù)量大小均勻的固定化光合細菌顆粒,放入滴有0.2%亞甲基藍溶液的蒸餾水三角瓶中,分別測定初始和24 h后瓶內(nèi)溶液在波長665 nm下的OD值。亞甲基藍吸附百分比=(初始OD665值-24 h后OD665值)/初始OD665值×100%。

e.固定化光合細菌顆粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察。采用掃描電鏡觀察,其步驟為:(a)用2.5%戊二醛固定液將固定化光合細菌顆粒固定lh,用磷酸緩沖液處理;(b)依次用不同比例乙醇脫水各15 min;(c)用100%乙醇脫水60 min;(d)用醋酸異戊醋置換30 min;(e)用CO2臨界點干燥器干燥顆粒;(f)在真空下噴金;(g)在電鏡下觀察、拍照。

1.2.4 其他測定方法

總有機碳濃度采用耶拿multi N/C 3100型快速測定儀,用直接法測定。

藻細胞濃度采用XB-K-25型血顆粒計數(shù)板,在Olympus顯微鏡下以視野法計數(shù)。試驗期間定時取樣,每個樣品計數(shù)2次,取平均值。

藻類的相對抑制率根據(jù)藻細胞密度計算。計算公式為[11]

式中:I——相對抑制率;N——加入光合細菌試驗組的藻細胞密度,個/mL;N0——對照組藻細胞密度,個/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化顆粒的理化性質(zhì)比較

2.1.1 不同包埋固定化方法光合細菌顆?；钚员容^

圖1 不同凝膠劑對固定化光合細菌顆?；钚缘挠绊慒ig.1 Impacts of different gels on activity of immobilized photosynthetic bacteria

陳光等[12]研究表明,水中總有機碳含量與COD存在一定的相關(guān)關(guān)系,故以總有機碳去除率表征細胞的活性。圖1是試驗5 d后,5種固定化方法總有機碳去除率的結(jié)果。由圖1可見,添加劑的加入對固定化光合細菌顆?？傆袡C碳去除率有不同的提升效果。加入活性炭的總有機碳去除率最高,緣于活性炭本身多孔結(jié)構(gòu)對有機物的吸附作用較強。加入沸石和碳酸鈣對總有機碳去除率的影響次于活性炭,原因是沸石顆粒表面凹凸不平,有很多孔穴,且內(nèi)部有堿金屬和堿土金屬的含水鋁硅酸鹽類[13],有利于進入顆粒內(nèi)的細菌生長;碳酸鈣的加入使顆粒內(nèi)部微環(huán)境變?yōu)槲A性,適宜光合細菌生長[14]。

2.1.2 不同包埋固定化方法光合細菌顆粒機械強度比較

施加20g砝碼時,以海藻酸鈉為包埋劑的光合細菌顆粒被壓扁,以活性炭為包埋劑的光合細菌顆粒少許變形,仍保持橢圓形,未破碎,其他包埋劑顆粒保持良好球狀;施加30 g砝碼,以活性炭為包埋劑的光合細菌顆粒破碎,其他包埋劑顆粒保持良好球狀;施加50g砝碼,以沸石或碳酸鈣為包埋劑的光合細菌顆粒破碎,以沸石和碳酸鈣為包埋劑的光合細菌顆粒略變形;增至70g砝碼,以沸石和碳酸鈣為包埋劑的光合細菌顆粒破碎?？梢?以沸石和碳酸鈣固定的光合細菌顆粒機械強度最好,具有很高的堅韌性。

2.1.3 不同包埋固定化方法光合細菌顆粒含水率和傳質(zhì)性的比較

含水率和傳質(zhì)性指標可以用來表征固定化光合細菌顆粒內(nèi)部成孔情況及營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞效果,且兩者有一定的相關(guān)性。在成孔均勻的條件下,含水率越高,其傳質(zhì)性越好[15]。圖2是5種固定化方法對固定化光合細菌顆粒含水率和傳質(zhì)性的影響。添加劑的加入對固定化光合細菌顆粒含水率和傳質(zhì)性有不同的提升作用,說明加入添加劑形成的孔隙結(jié)構(gòu)使水分子更易進入光合細菌顆粒內(nèi)部。添加沸石和碳酸鈣的光合細菌顆粒吸水性最強,5 d后達到1 875%,但如圖3所示,較其他包埋固定化方法,其內(nèi)部存在致密層,成孔不均勻,傳質(zhì)效果不及活性炭。而添加活性炭的光合細菌顆粒吸水性較弱,只有1 290%,緣于活性炭的位阻現(xiàn)象[16];但其疏松的孔隙結(jié)構(gòu)使其傳質(zhì)性效果良好,高達50.75%。

圖2 凝膠劑對固定化光合細菌顆粒含水率和傳質(zhì)性的影響Fig.2 Impacts of gels on moisture content and mass transfer of immobilized photosynthetic bacteria

2.1.4 固定化光合細菌顆粒的包埋載體選擇

加入活性炭雖能在一定程度上改善傳質(zhì)性,但制出的顆粒呈黑色,嚴重影響透光性,不利于光合細菌的長期生長;而加入沸石和碳酸鈣,一方面沸石孔隙結(jié)構(gòu)相對發(fā)達,另外碳酸鈣的加入使顆粒內(nèi)部構(gòu)成微堿環(huán)境,會減少鈣離子的流失,相對增加了交聯(lián)劑的濃度。因此,最終選擇沸石和碳酸鈣為凝膠劑。

2.2 固定化光合細菌顆粒與游離光合細菌對銅綠微囊藻生長的影響比較

由圖4可見,空白組和游離光合細菌組在試驗后的第3天進入對數(shù)生長期,但由圖5可知第6天銅綠微囊藻的相對抑制率為80.62%,第12天的相對抑制率仍能達到83.55%,而此時游離光合細菌組的相對抑制率為-2.38%。經(jīng)海藻酸鈉、沸石和碳酸鈣固定化后的光合細菌,一方面由于載體的特性,即沸石具有發(fā)達的孔隙結(jié)構(gòu),孔隙中陽離子的存在使其具有靜電吸引力,將營養(yǎng)物質(zhì)吸附到孔隙中,同時碳酸鈣形成的微堿環(huán)境有利于光合細菌的生長繁殖,提高了光合細菌的抑藻效果;另一方面包埋作用有效阻隔了氧氣與菌體的接觸,形成厭氧環(huán)境,使細菌能夠保持活力,并能夠自動更替菌膜,提高了菌體的作用時效,使其能穩(wěn)定發(fā)揮抑藻作用。

圖3 固定化光合細菌顆粒掃描電鏡圖Fig.3 Immobilized photosynthetic bacteria particles observed under SEM

圖4 固定化光合細菌顆粒和游離光合細菌對銅綠微囊藻生長的影響Fig.4 Impacts of immobilized photosynthetic bacteria particles and mobile photosynthetic bacteria particles on growth of Microcystis aeruginosa

2.3 固定化光合細菌顆粒投加量對銅綠微囊藻生長的影響

由圖6可見,試驗前3天固定化光合細菌顆粒組與空白組藻細胞密度差異小,因為銅綠微囊藻遇到逆境脅迫時具有自我修復機能而表現(xiàn)出一定的耐受性。另外銅綠微囊藻具有利用有機底物進行異養(yǎng)生長的能力[17],因此,固定化光合細菌顆粒對銅綠微囊藻的抑制作用表現(xiàn)出一定的滯后效應。從圖5可以看出,試驗6 d后,不同投加量的固定化光合細菌顆粒對銅綠微囊藻的抑制作用均能達到80%左右;試驗12 d后,9 g組的抑制率仍能達到55.38%,抑藻效果具有一定的持續(xù)性。為保持水體的水生生態(tài)平衡,實際并不需要將水體的藻類控制到零水平,且固定化光合細菌顆粒投加量也直接影響處理技術(shù)成本。建議選擇9 g固定化光合細菌顆粒的投加量,即36 g/L。

圖5 光合細菌投加方式對銅綠微囊藻的抑制率Fig.5 Rate of inhibition of dosing methods of photosynthetic bacteria on Microcystis aeruginosa

圖6 固定化光合細菌顆粒投加量對銅綠微囊藻生長的影響Fig.6 Impact of immobilized photosynthetic bacteria dosage on growth of Microcystis aeruginosa

3 結(jié) 論

a.通過5種不同載體的固定化光合細菌顆粒的理化指標比較,采用沸石和碳酸鈣加質(zhì)量分數(shù)為2%的以海藻酸鈉為包埋劑的光合細菌顆粒機械強度好、含水率高、孔隙結(jié)構(gòu)均勻疏松,但細胞活性和傳質(zhì)性不及以活性炭為包埋劑的光合細菌顆粒,而活性炭的加入使所制出的顆粒呈黑色,影響透光性,不利于光合細菌的持續(xù)生長。最佳的固定化方法為質(zhì)量分數(shù)分別為1%的沸石和碳酸鈣加上2%的海藻酸鈉。

b.在菌藻共同培養(yǎng)下,相比游離細菌,固定化光合細菌能顯著提高其對銅綠微囊藻的抑制作用,相對抑制率可高達85%。

c.隨著固定化光合細菌投加量的增加,抑制作用并沒有顯著增強。綜合考慮技術(shù)經(jīng)濟性,建議采用36 g/L的投加量。

綜上所述,采用固定化技術(shù),使光合細菌實現(xiàn)固著生長,可以有效提高光合細菌對藻類的抑制效率,為利用光合細菌控制相對開放的水域中水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象提供了理論依據(jù)。

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Inhibiting effect of immobilized photosynthetic bacteria on Microcystis aeruginosa

WU Shan1,2,REN Liyan1,2,LI Zhicheng1,2
(1.College of Architecture and Civil Engineering,Beijing University of Technology,Beijing 100124,China; 2.Key Laboratory of Beijing for Water Quality Science and Water Environment Restoration Engineering, Beijing 100124,China)

The inhibiting effects of immobilized photosynthetic bacteria onMicrocystis aeruginosawere investigated in this study.First,through comparison of five immobilization methods and their features,the optimal immobilization method was determined.Then,photosynthetic bacteria andMicrocystis aeruginosawere co-cultured through laboratory experiments.After the experiments,the impacts of immobilized photosynthetic bacteria and mobile photosynthetic bacteria on the growth ofMicrocystis aeruginosawere studied,and the optimal dosage of immobilized photosynthetic bacteria was determined.The study results show that the optimal method for immobilization of photosynthetic bacteria was to mix zeolites,calcium carbonate,and sodium alginate.The immobilized photosynthetic bacteria had a significant inhibiting effect onMicrocystis aeruginosa,with an inhibition rate of 83.55%,while the mobile photosynthetic bacteria,at the same amount,had an inhibition rate of only 26.81%.The optimal dosage of immobilized photosynthetic bacteria was 36 g/L.

bacteria immobilization technology;photosynthetic bacteria;Microcystis aeruginosa;inhibiting effect

TU992.3

:A

:1000-1980(2014)06-0481-05

10.3876/j.issn.1000-1980.2014.06.003

2013-11 12

吳珊(1963—),女,北京人,副教授,博士,主要從事水質(zhì)控制技術(shù)與系統(tǒng)優(yōu)化研究。E-mail:wushan@bjut.edu.cn