細(xì)胞及瘤塊種植人前列腺癌裸鼠皮下移植瘤模型的比較

南淑良，申 鍔，林艷端，白文坤，王 玉，胡 兵

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科上海超聲醫(yī)學(xué)研究所，上海 200233)

·論 著·

細(xì)胞及瘤塊種植人前列腺癌裸鼠皮下移植瘤模型的比較

南淑良，申 鍔，林艷端，白文坤，王 玉，胡 兵

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科上海超聲醫(yī)學(xué)研究所，上海 200233)

目的 比較細(xì)胞懸液法及瘤塊法種植裸鼠前列腺癌皮下移植瘤，以期獲得使瘤體生長最快，質(zhì)量最佳的種植方式。方法 采用細(xì)胞懸液及瘤塊兩種方式種植PC-3細(xì)胞人前列腺癌皮下移植瘤，比較兩種種植方法所種植的移植瘤的成瘤率、成瘤潛伏期、瘤體形態(tài)以及移植瘤的中心壞死灶，同時對兩種方法種植的皮下移植瘤進(jìn)行常規(guī)病理學(xué)檢查。本研究同時觀察了PC-3細(xì)胞懸液濃度對于種植皮下移植瘤成瘤的影響。結(jié)果 兩種方式種植的移植瘤的成瘤率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，采用瘤塊種植的移植瘤生長較細(xì)胞種植稍快，瘤體形態(tài)各異，較容易發(fā)生中心性壞死；細(xì)胞懸液組成瘤稍慢，瘤體較規(guī)則，多呈圓形或橢圓形，發(fā)生中心性壞死較晚，而且隨著細(xì)胞濃度增高，其成瘤潛伏期明顯縮短。結(jié)論 通過比較發(fā)現(xiàn)細(xì)胞懸液種植皮下移植瘤較瘤塊種植更有優(yōu)勢，而且采用較高濃度細(xì)胞懸液種植可以有效縮短成瘤潛伏期，是一種較為理想的種植方式。

裸鼠；皮下移植瘤；前列腺癌PC-3細(xì)胞；瘤塊

目前，前列腺癌發(fā)病率較高，其中發(fā)達(dá)國家的發(fā)病率占全球總發(fā)病率的2/3[1]，在美國，前列腺癌的死亡率高居第二位[2]，近年來我國前列腺癌發(fā)病率也呈上升趨勢，前列腺癌嚴(yán)重影響老年男性的生命健康及生活質(zhì)量。因此研究前列腺癌的發(fā)病機制，尋求有效的治療措施等勢在必行。建立前列腺癌理想的動物模型是闡明其發(fā)病機制、腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程、腫瘤與宿主激素水平的關(guān)系以及藥物基因等治療措施有效性的實驗基礎(chǔ)。目前異種移植模型應(yīng)用較多，皮下移植已廣泛應(yīng)用于前列腺癌發(fā)病機制及藥物基因治療領(lǐng)域。本研究采用人雄激素非依賴性前列腺癌PC-3細(xì)胞建立裸鼠前列腺癌皮下移植瘤，通過比較不同濃度的細(xì)胞懸液及瘤塊種植的皮下移植瘤成瘤率、移植瘤生長速度及瘤體質(zhì)量，旨在篩選出最佳種植方式。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 BABL/c裸鼠25只，雄性，4周齡，體重約20～25 g，SPF條件下飼養(yǎng)，由上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院實驗中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK2008-0016，使用許可證號：SYXK011-0128。

1.1.2 實驗細(xì)胞株及培養(yǎng)基 人前列腺癌PC-3細(xì)胞(購自上海中科院生物研究所)，該細(xì)胞為雄激素非依賴性，用RPMI-1640內(nèi)含10%的胎牛血清(FBS，Invitrogen)的培養(yǎng)基在5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈梭形貼壁生長。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞懸液種植方法 取呈對數(shù)生長期的前列腺癌PC-3細(xì)胞，采用0.25%的胰酶消化，以1000r/min速度離心5 min后將其濃度分別調(diào)整為所需濃度，接種前用酒精棉球消毒裸鼠右側(cè)背部皮膚，取0.1 ml的細(xì)胞懸液，沿皮下進(jìn)針約10 mm(防止細(xì)胞懸液外漏)后將細(xì)胞懸液注入裸鼠背部皮下，在皮下形成圓形或橢圓形皮丘，迅速退針觀察無細(xì)胞懸液外漏為接種成功，接種過程中裸鼠無需麻醉。

1.2.2 瘤塊種植方法 先用細(xì)胞懸液接種法建立皮下移植瘤模型，選擇移植瘤直徑約5～7 mm，腫瘤生長旺盛且皮膚無潰破的裸鼠，頸椎脫臼法處死裸鼠，取其瘤體用生理鹽水清洗3次后，取瘤體邊緣活力較旺盛的組織，將其剪成約1 mm3大小的瘤塊備用。然后用1%的戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉裸鼠，在裸鼠右側(cè)背部皮下做一小切口，將瘤塊沿切口逐漸送入至距切口約10 mm處，每只裸鼠接種一個組織塊，接種完成后縫合切口，整個接種過程在30 min之內(nèi)完成。

1.3 實驗分組

1.3.1 細(xì)胞懸液與瘤塊種植移植瘤 細(xì)胞懸液組采用濃度為1×107/ml的PC-3細(xì)胞按照上述細(xì)胞懸液種植方法種植，瘤塊組采用的瘤塊為人前列腺癌PC-3細(xì)胞接種成功的皮下移植瘤，按照上述瘤塊種植方法種植，5只/組，均接種成功。

1.3.2 不同濃度細(xì)胞懸液種植皮下移植瘤 將細(xì)胞懸液濃度分別調(diào)整為5×107/ml（A組）、1×108/ml（B組）、2×108/ml（C組），按照上述細(xì)胞懸液種植方法種植，5只/組，A組、B組、C組三組裸鼠最終接種的細(xì)胞數(shù)分別為5×106個/只、1×107個/只、2×107個/只，該組15只裸鼠均接種成功。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 細(xì)胞懸液和瘤塊種植的皮下移植瘤生長情況的比較 接種后每天觀察移植瘤的生長情況，在移植瘤長徑約10 mm時頸椎脫臼法處死裸鼠，皮下剝離腫瘤組織，觀察瘤體大體形態(tài)，切開腫瘤觀察其壞死程度。

1.4.2 病理學(xué)檢查 將移植瘤組織固定于10%福爾馬林溶液中，石蠟包埋后切取4 μm的切片，行常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色后于普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4.3 觀察不同濃度細(xì)胞懸液對裸鼠移植瘤成瘤的影響 接種后每天觀察裸鼠的生活情況及接種部位腫瘤的生長情況，每5 d用游標(biāo)卡尺測量各組瘤體的長徑(a)及短徑(b)，按照公式V=1/2(ab2)計算腫瘤體積[3]，同時觀察并記錄移植瘤的成瘤時間、大體形態(tài)、皮膚有無破潰及其與周圍組織的關(guān)系，并共觀察至種瘤后第60天，繪制移植瘤生長曲線。

2 結(jié) 果

2.1 兩種方式種植的移植瘤大體觀 各組裸鼠接種移植瘤后生長情況良好，成瘤率均達(dá)100%，瘤塊種植的移植瘤生長速度較細(xì)胞懸液種植快，細(xì)胞懸液組在種瘤后12 d左右成瘤(圖1)。從外觀來看，移植瘤突出于裸鼠背部皮膚，皮下血管走行清晰可見，牽拉皮膚時可見瘤體隨皮膚移動，細(xì)胞懸液種植組的移植瘤形態(tài)一般呈圓形或橢圓形(圖2A)，而瘤塊種植的移植瘤形態(tài)各異(圖2B)。頸椎脫臼法處死裸鼠后，分離移植瘤發(fā)現(xiàn)瘤體均有完整的包膜，剖面觀移植瘤組織呈魚肉狀，在瘤體長徑約10 mm時，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞懸液組移植瘤中央可見微小白點狀的壞死灶，瘤塊組移植瘤中央可見大范圍黏液狀壞死灶，壞死灶長徑范圍約3～5 mm。

圖1 不同濃度細(xì)胞懸液種植的前列腺癌皮下移植瘤生長曲線

圖2 兩種不同的種植方法種植的皮下移植瘤大體觀

2.2 病理學(xué)觀察 細(xì)胞懸液組和瘤塊組所種植的移植瘤經(jīng)HE染色后在光鏡下觀察并無明顯差異，低倍鏡下可見腫瘤組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞排列紊亂，呈彌漫分布狀，間質(zhì)成分較少，而且腫瘤組織與間質(zhì)組織之間沒有明顯的分界(圖3A)；高倍鏡下可見腫瘤細(xì)胞形態(tài)大小相一致，呈圓形或者橢圓形，排列為單層，細(xì)胞核體積增大，形態(tài)不規(guī)則，染色深淺不一，核質(zhì)比較大，其內(nèi)可見巨核細(xì)胞，核大深染(圖3B)。

圖3 前列腺癌皮下移植瘤常規(guī)病理學(xué)檢查(HE染色)

2.3 不同濃度細(xì)胞懸液種植的移植瘤成瘤時間及生長情況 各組裸鼠均可成瘤，其中C組在種植后3 d即可觀察到皮下移植瘤的生長，直徑約0.5～1 mm，B組在一周左右可見，A組在12 d左右可見。不同濃度細(xì)胞成瘤的區(qū)別主要在于成瘤潛伏期，一旦成瘤后，其生長速度差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而且移植瘤的生長呈慢-快-慢的生長模式，其生長曲線見圖1。

3 討論

研究表明[4]，多數(shù)人類腫瘤可在免疫缺陷小鼠體內(nèi)生長，其為活體內(nèi)研究人類腫瘤生長特性及觀察藥物或基因等治療效果提供了一個理想的動物模型。前列腺癌動物模型主要分4類[5]：⑴自發(fā)和誘發(fā)前列腺癌模型；⑵異種移植模型；⑶轉(zhuǎn)基因小鼠模型；⑷基因敲除動物模型。每種模型各具優(yōu)缺點，其中異種移植模型在目前的研究中應(yīng)用較多，異種移植模型又分為原位移植和皮下移植兩種模型，由于原位移植對技術(shù)要求較高，目前多用于前列腺癌轉(zhuǎn)移的研究[6]，而皮下移植瘤已廣泛應(yīng)用于前列腺癌的藥物、基因以及物理方法等多種治療措施的研究[7-8]。

有文獻(xiàn)報道[9-10]，不同的種植方法其瘤體生長速度不同，本研究中對細(xì)胞種植和瘤塊種植裸鼠皮下移植瘤進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)瘤塊種植的皮下移植瘤其生長速度較細(xì)胞快，考慮原因有以下兩點：⑴瘤塊具有腫瘤生長所必需的間質(zhì)細(xì)胞及三維空間結(jié)構(gòu)，間質(zhì)細(xì)胞可通過旁分泌方式釋放出VEGF及其他肽類細(xì)胞因子等促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移[11]；⑵細(xì)胞成瘤存在一個成瘤潛伏期，而瘤塊成瘤則跳過了這個階段。但是瘤塊種植的移植瘤形態(tài)各異(圖2B)，大小不等，可能與種植時所采用的瘤塊形態(tài)大小有關(guān)，因此瘤塊成瘤不適合于對瘤體一致性要求較高的實驗，而細(xì)胞成瘤較為均勻，多呈圓形或橢圓形(圖2A)，有利于觀察藥物、基因及物理方法等多種治療措施的治療效果。同時本實驗中還發(fā)現(xiàn)在瘤體體積相似時，瘤塊組較細(xì)胞懸液組發(fā)生中心性壞死范圍大，壞死發(fā)生早，究其原因可能是瘤塊與裸鼠所建立的血管連接不足以維持整個細(xì)胞團(tuán)塊生長至移植瘤的形成所致[10]，因瘤塊周邊較容易與裸鼠建立血管網(wǎng)絡(luò)，及時提供移植瘤生長所需要的生長因子等成分，而中心不易與裸鼠建立類似的血管網(wǎng)絡(luò)，較早發(fā)生中心性壞死；瘤塊內(nèi)部一旦發(fā)生壞死后，壞死組織周圍新生血管容易形成血管盲端，由于長期瘀血導(dǎo)致周圍組織發(fā)生淤血性壞死，形成惡性循環(huán)，所以瘤塊成瘤所形成的壞死灶的面積較大。與之相比，細(xì)胞種植的移植瘤是逐漸形成新的血管系統(tǒng)，直至瘤體較大時血供不足以維持整個瘤體生長時才逐漸壞死。因此本實驗研究結(jié)果提示采用細(xì)胞懸液種植的裸鼠前列腺癌皮下移植瘤實驗的最佳瘤體直徑約10 mm左右為宜，而瘤塊種植的移植瘤則需更小即開始實驗。

以往的研究多采用濃度為5×107/ml的細(xì)胞懸液種植前列腺癌皮下移植瘤，成瘤時間約為兩周左右[12]，成瘤較慢，我們設(shè)想增加細(xì)胞濃度是否能加速其成瘤速度，因此本實驗中分別采用5×107/ml、1×108/ml、2×108/ml的三種細(xì)胞濃度將前列腺癌PC-3細(xì)胞接種于裸鼠背部皮下，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著細(xì)胞濃度增高其成瘤潛伏期明顯縮短，一旦成瘤后，其生長速度無明顯差異。因裸鼠本身壽命較短，而且隨著腫瘤的生長，裸鼠逐漸出現(xiàn)萎靡、消瘦等惡病質(zhì)表現(xiàn)，從而影響移植瘤的生長及實驗結(jié)果，因此采用較高濃度(2×108/ml)的細(xì)胞懸液種植皮下移植瘤，可以明顯縮短瘤體生長時間，保證裸鼠的生存質(zhì)量，從而可以為實驗研究提供一個更為理想的動物模型。腫瘤的生長分為血管前期和血管期[13]，在移植瘤尚未形成血管時，其生長主要是依靠裸鼠皮下血管的彌散作用從組織間液獲得營養(yǎng)，生長較慢，而移植瘤建立血供后，新生的血管網(wǎng)為移植瘤提供大量的營養(yǎng)從而使移植瘤體積迅速增大，當(dāng)移植瘤體積較大時，其內(nèi)部由于血供不足而發(fā)生壞死，從而使移植瘤的生長速度逐漸減慢，因此移植瘤的生長呈慢-快-慢的生長模式。

雖然瘤塊種植組皮下移植瘤成瘤較細(xì)胞懸液組稍快，但是瘤塊成瘤形態(tài)不規(guī)則，較早發(fā)生中心性壞死，而且增加細(xì)胞濃度可以有效的提高成瘤速度，因此采用細(xì)胞懸液種植前列腺癌皮下移植瘤是一種較好的選擇。加之細(xì)胞懸液種植皮下移植瘤具有多種優(yōu)點，其操作過程中無需對裸鼠進(jìn)行特殊處理、無需他人協(xié)助、無需麻醉及操作過程中無出血等優(yōu)點，可以大大降低移植瘤種植的難度，同時避免了手術(shù)移植易致動物感染死亡等缺點，提高了皮下移植瘤的成功率。

綜上所述，高濃度細(xì)胞懸液種植裸鼠前列腺癌皮下移植瘤能夠有效的縮短其成瘤潛伏期、瘤體大小形態(tài)較為均勻一致，而且具有操作簡便、成瘤率高及對裸鼠損傷小等優(yōu)勢。因此采用高濃度PC-3細(xì)胞懸液種植裸鼠人前列腺癌皮下移植瘤可為前列腺癌基礎(chǔ)研究提供一種較為理想的動物模型。

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讀者·作者·編者

標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)學(xué)名詞表(待續(xù))

(本表以全國自然科學(xué)名詞審定委員會公布的《醫(yī)學(xué)名詞》為據(jù))

Comparison of subcutaneously xenografts model of human prostate cancer in nude mice established by cell suspension and tumor tissue.

NAN Shu-liang,SHEN E,LIN Yan-duan,BAI Wen-kun，WANG Yu,HU Bing.
Department of Ultrasound in Medicine,the Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University,Shanghai Institute of Ultrasound in Medicine,Shanghai 200233,CHINA

Objective To compare the different method of transplanting subcutaneously transplanted tumor in nude mice.MethodsXenograft models of human PC-3 prostate cancer in nude mice with cell suspension of different concentrations and tumor tissue were established,respectively.Then the time of tumor formation,take rates, morphological features and central tumor necrosis werecompared between the two groups.Meanwhile the histopathological features of transplanted tumor were examined,the tumor volume were measured,and the growth curve was drawn.ResultsNo significant differences were observed in take rates in tumors established from the two types of implants.The xenograft of tumor tissue group formed in an earlier time,but the shape was irregular and central necrosis occured more easily.Though the xenograft of cell suspension group formed later than tumor tissue group,the shape was regular and central necrosis occurred late.There were no significant differences in the pathological features between the two groups.With the increase of concentrations of cells,the time of tumor formation was significantly shortened.ConclusionHigh concentration cell suspension is an ideal method to implant subcutaneously transplanted tumor of prostate cancer in nude mice.

Nude mice;Subcutaneously xenograft;PC-3 human prostate cancer cells;Tumor tissue

R-332

A

1003—6350（2014）02—0157—04

2013-08-18)

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.02.0061

國家自然科學(xué)基金（編號：81271597，81270208）

胡 兵。E-mail：binghuzz@263.com