臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清和含胎牛血清培養(yǎng)體系比較

陳林，張坤，董偉，楊珂，艾輝，陳祿華

(重慶市干細(xì)胞企業(yè)工程研究中心，重慶 401320)

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清和含胎牛血清培養(yǎng)體系比較

陳林，張坤，董偉，楊珂，艾輝，陳祿華

(重慶市干細(xì)胞企業(yè)工程研究中心，重慶 401320)

為了比較在無血清與含胎牛血清培養(yǎng)基中人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力、生物學(xué)特性、分化潛能，將臍帶華通氏膠剝出剪碎，分別在無血清與含胎牛血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)增臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。用MTT法檢測細(xì)胞增殖活性，并繪制生長曲線;在倒置顯微鏡下對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察;利用流式細(xì)胞儀檢測鑒定其表面標(biāo)記CD73，CD90，CD105，CD14，CD34，CD45，CD79a及HLA－DR的表達(dá);將成骨及成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)1～2周后觀察其細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，用堿性磷酸酶染色鑒定其成骨情況，油紅O染色鑒定其成脂情況。結(jié)果表明:無血清與含胎牛血清培養(yǎng)基所培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、增殖活性、表面標(biāo)記和分化潛能相似;但在無血清培養(yǎng)基成分中無動物源蛋白引入，是更理想的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基種類。

間充質(zhì)干細(xì)胞;細(xì)胞培養(yǎng);無血清培養(yǎng)基;胎牛血清

臍帶中間充質(zhì)干細(xì)胞含量遠(yuǎn)高于骨髓和臍血，且具更強(qiáng)更穩(wěn)定的增殖分化能力［1］，且臍帶取材方便，來源充足，對供者無傷害，病原微生物感染率小，是一種最好的間充質(zhì)干細(xì)胞來源。臍帶中間充質(zhì)干細(xì)胞來源于中胚層，具有自我復(fù)制、多向分化和免疫調(diào)控能力，且能定向分化為成骨細(xì)胞脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞等［2］，是各種多功能干細(xì)胞中治療血液疾病和再生醫(yī)學(xué)惟一安全的異體干細(xì)胞［3］。目前，常規(guī)的MSCs培養(yǎng)體系中均加入了一定比例的動物血清成分。血清是由不同分子組成的復(fù)雜混合物，給細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)化、細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)品的分離純化帶來了很大的困難，同時(shí)動物血清內(nèi)的特異蛋白是已被確定的過敏原，可能對將來臨床應(yīng)用構(gòu)成威脅［4］。無血清培養(yǎng)在很大程度上避免了含血清培養(yǎng)的缺陷。本研究通過比較無血清培養(yǎng)體系和含血清培養(yǎng)體系培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，探尋了一種無血清培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，以達(dá)到臨床治療的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)。

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

主要試劑:DMEM/F12培養(yǎng)基、TrypLE 1X、脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基均購自Gibco公司;胎牛血清FBS購自Stemcell公司;無血清培養(yǎng)基購自Lonza公司;CD14－FITC，CD34－PE，CD45－FITC，CD79a－PE，HLA－DR FITC購自Beckman Coulter公司;CD73－FITC，CD90－FITC，CD105－PE購自eBioscience公司;MTT、DMSO和油紅O購自Sigma公司;堿性磷酸酶試劑盒購自碧云天公司。

主要設(shè)備:二氧化碳培養(yǎng)箱采購自Thermo Fisher公司;Bio－Rad 680酶標(biāo)儀購自Bio－Rad公司;EpicsXL ADC流式細(xì)胞儀購自Bcekman Coulter公司;IX51顯微鏡采購自奧林巴斯公司。

所有的臍帶標(biāo)本均來自足月自然分娩或剖宮產(chǎn)的健康產(chǎn)婦，并征得家屬及產(chǎn)婦同意。臍帶采集之前已對產(chǎn)婦進(jìn)行了艾滋病病毒抗體檢查、乙型肝炎病毒表面抗原、乙型肝炎病毒核心抗體、梅毒螺旋體抗體、丙型肝炎病毒抗體，全部檢查結(jié)果為陰性，合格。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增

在生物安全柜中取出采回的胎兒臍帶，置于培養(yǎng)皿中。將其剪成小段，用無菌PBS充分洗滌除去殘留血液，用鑷子小心除去血管和外膜，分離得到純凈的華通氏膠組織，將其剪碎成1～2 mm3的小塊，將0.5 g組織分別置于無血清培養(yǎng)基及含10%胎牛血清培養(yǎng)基中，并移至T75培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2體積濃度的飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

每日定期觀察，第5天和第10天全量換液，以后每3天全量換液1次。待培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞已生長至80%融合，用TrypLE于室溫下消化并輕輕拍打，鏡下觀察培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞已完全成為懸液，終止消化過程，以1×104/cm2細(xì)胞濃度傳代擴(kuò)增。

1.2.2 細(xì)胞生長活性測定

稱取250 mg MTT，加50 mL滅菌PBS溶液使MTT充分溶解，再用0.22μm的醋酸纖維濾器除菌，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

取以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)和含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的狀態(tài)良好的P0代細(xì)胞，分別加入無血清培養(yǎng)基和含血清培養(yǎng)基吹打混勻制成濃度為5×104/mL的細(xì)胞懸液。

取7塊96孔板，在外周孔加入滅菌PBS填充，第二豎排孔加入無血清培養(yǎng)基作為空白對照，其余每孔接種100μL無血清培養(yǎng)基制成的細(xì)胞懸液，并加入200μL無血清培養(yǎng)基填充，每3天對96孔板內(nèi)培養(yǎng)基進(jìn)行換液。再取7塊96孔板進(jìn)行以上操作，但將培養(yǎng)基換為含血清培養(yǎng)基，細(xì)胞懸液換為用含血清培養(yǎng)基制備的細(xì)胞懸液。

將96孔板置于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)開始后每24 h分別取出2塊96孔板，在酶標(biāo)儀OD492nm處測量各孔的吸光值。

計(jì)算各孔波長吸光度值和空白96孔板吸光度值的差值即A值，以時(shí)間為橫軸，A值為縱軸繪制生長曲線。

1.2.3 細(xì)胞表面標(biāo)志的鑒定

分別取用含血清和不含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的P2代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，用TrypLE消化后制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為2×106/mL。取100μL細(xì)胞懸液，分別加入抗體10μL于20℃避光孵育20 min?？贵w分別為小鼠抗人CD14－FITC，CD34－PE，CD45－FITC，CD79a－PE，HLA－DR－FITC，CD73－FITC，CD90－FITC，CD105－PE。孵育結(jié)束后，洗滌細(xì)胞2遍，加入300μL流式鞘液中，待流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 MSCs誘導(dǎo)分化

1)脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化

收集P2代對數(shù)生長期的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，以1×104/cm2密度接種于24孔板中，待細(xì)胞達(dá)到60%融合時(shí)，去掉原培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，更換為脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3～4天換液1次，培養(yǎng)7～14天。觀察到脂滴形成時(shí)，吸去誘導(dǎo)培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定15 min，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%油紅O染色20 min，水洗數(shù)次，在顯微鏡下觀察、拍照。

2)成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化

收集P2代對數(shù)生長期的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，以1×104/cm2密度接種于24孔板中，待細(xì)胞達(dá)到60%融合時(shí)，去掉原培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，更換為成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3～4天換液1次。培養(yǎng)14天后，吸去誘導(dǎo)培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，無水乙醇固定10 min，水洗數(shù)次，加入堿性磷酸酶染色劑，孵育8～12 h，水洗數(shù)次，在顯微鏡下觀察、拍照。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

無血清組在培養(yǎng)第10天可見少量細(xì)胞遷出，細(xì)胞呈紡錘形、長梭形、多角形、逗號等形態(tài)。原代培養(yǎng)第12天細(xì)胞融合達(dá)到約70%(見圖1)，大部分細(xì)胞呈紡錘形和長梭型，少量細(xì)胞呈多角形。傳代后細(xì)胞生長速度加快、純度提高，以平行排列生長為主或呈漩渦狀生長(見圖2)。約2～3天后可再傳代。

圖1 無血清培養(yǎng)原代第12天(40×)

圖2 含血清培養(yǎng)原代第12天(40×)

血清組在培養(yǎng)第10天可見部分細(xì)胞遷出，細(xì)胞形態(tài)與無血清組無異，細(xì)胞生長度速度較無血清組稍快。原代培養(yǎng)第12天細(xì)胞融合達(dá)到約80%(見圖2)，細(xì)胞形態(tài)與無血清組無異。傳代后細(xì)胞生長速度和細(xì)胞純度均有明顯提高，亦呈平行排列生長或漩渦狀生長(見圖3)。約2～3天后可再傳代。

圖3 無血清培養(yǎng)P2代第2天(40×)

圖4 含血清培養(yǎng)P2代第2天(40×)

2.2 細(xì)胞生長活性測定

橫軸為培養(yǎng)時(shí)間(以每天計(jì))，縱軸為OD值繪制生長曲線。細(xì)胞接種1～2天為緩慢生長的潛伏期，從第3天即進(jìn)入對數(shù)生長期，兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞都從第5天進(jìn)入平臺期，細(xì)胞倍增時(shí)間為30 h，P＞0.05，兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞增殖曲線無顯著差異(見圖5)。

圖5 兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞增殖曲線

2.3 細(xì)胞表面標(biāo)志分析

流式細(xì)胞術(shù)分析表明，無血清培養(yǎng)基和含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的臍帶MSCs均高表達(dá)粘附分子和基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記CD73，CD90，CD105，不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記CD14，CD34，CD45，CD79a(圖6)，不表達(dá)主要組織相容性復(fù)合物類分子HLA－DR。

圖6 兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞表面標(biāo)志比較

2.4 體外誘導(dǎo)分化

2.4.1 脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化

經(jīng)成脂誘導(dǎo)2周后，P2代人臍帶MSCs可以分化為脂肪細(xì)胞。進(jìn)行油紅O染色，可見胞漿中有大量被染成紅色的脂滴(見圖7)。

2.4.2 成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化

經(jīng)成骨誘導(dǎo)2周后，P2代人臍帶MSCs可以分化為成骨細(xì)胞。進(jìn)行堿性磷酸酶染色，可以看見大量紫色沉淀(見圖8)。

圖7 人臍帶MSC油紅O染色結(jié)果(400×)

圖8 人臍帶MSC堿性磷酸酶染色結(jié)果(40×)

3 討論與結(jié)論

間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我更新能力和多向分化能力［5］，同時(shí)還具有雙向免疫調(diào)節(jié)的功能［6］。目前分離人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，主要來源于自臍帶的wharton’s jelly及臍靜脈皮下層［7－8］，其主要分離方法是酶消化法和組織塊法。本實(shí)驗(yàn)采用組織塊法由貼壁的組織直接獲得MSC，相對酶消化法的化學(xué)反應(yīng)過程而言對細(xì)胞傷害較?。?］。

獲得安全可靠、質(zhì)量穩(wěn)定的間充質(zhì)干細(xì)胞是臨床應(yīng)用的前提，常規(guī)的血清培養(yǎng)體系由于血清的特性，異種血清的使用存在著很多不確定因素［10］，比如，血清批次之間的差別、異種蛋白的免疫原性、潛在的病原體等。異種血清的種種潛在危害，使其生物安全性受到普遍質(zhì)疑［11］。由于動物血清應(yīng)用的缺陷，有些研究人員采用人血清來代替胎牛血清，促進(jìn)細(xì)胞增殖并且保持間充質(zhì)干細(xì)胞的分化潛能，隨著細(xì)胞擴(kuò)增以及干細(xì)胞臨床應(yīng)用量的增大，人血清來源成為難以解決的問題［12］。無血清培養(yǎng)避免了含血清培養(yǎng)帶來的難題，成為當(dāng)今細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的一大趨勢。

無血清培養(yǎng)和含血清培養(yǎng)都成功獲得了大量臍帶MSC，兩種培養(yǎng)基所培養(yǎng)細(xì)胞在形態(tài)方面類似，含血清培養(yǎng)的細(xì)胞體積略小，增殖速度略快于無血清培養(yǎng)。細(xì)胞免疫表型的分析表明，兩種培養(yǎng)基所培養(yǎng)細(xì)胞的免疫分子表達(dá)類似，CD73，CD90，CD105≥95%;CD14，CD34，CD45，CD79a，HLA－DR≤2%，符合ISCT組織對間充質(zhì)干細(xì)胞的定義要求［13］。在誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，兩種培養(yǎng)基所培養(yǎng)細(xì)胞均有相似的成骨和脂肪分化能力，具有較強(qiáng)的可塑性與多向分化潛能。

總之，本研究利用無血清培養(yǎng)基成功分離培養(yǎng)出臍帶MSC，和含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)出的細(xì)胞具有相似的生物學(xué)特性，完全可以替代含血清培養(yǎng)基。隨著國家《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》等文件出臺，對于培養(yǎng)基成分提出了嚴(yán)格要求，可以預(yù)見未來無血清培養(yǎng)將在臨床干細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域占據(jù)主導(dǎo)地位，具有廣闊的應(yīng)用前景。

［1］Karahuseyinogl US，Cinar O，Kilic E，et al.Biology of stem cells in human umbilical cord stroma:in situ and in vitro surveys［J］.Stem Cells，2007，25(2):319－331.

［2］Dennis JE，Merriam A，Awadallah A，et al.A quadripotential Mesenchymal Progenitor cell isolated from the marrow of an adultmouse［J］.JBone Miner Res.1999，14(5):700－709.

［3］Pelosi E，Castelli G，Testa U.Human umbilical cord is a unique and safe source of various types of stem cells suitable for treatment of hematological diseases and for regenerativemedicine［J］.Blood Cells Mol Dis.2012，49 (1):20－28.

［4］Le Blanc K，F(xiàn)rassoni F，Ball L，et al.Mesenchymal stem cells for treatment of steroid－resistant，severe，acute graftversus－h(huán)ost disease:a phase II study［J］.Lancet，2008，371:1579－1586.

［5］Friedenstein A J，Petrakova K V，Kurolesova A I，et al. Heterotopic of bone marrow.Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues［J］.Transplantation.1968，6(2):230－247.

［6］LiW，Ren G，Huang Y，et al.Mesenchymal stem cells:a double－edged sword in regulating immune responses［J］. Cell Death Differ.2012，19(9):1505－1513.

［7］Troyer D L，Weiss M.Wharton’s jelly－derived cells are a primitive stromal cell population［J］.Stem Cells，2008，26:591－599.

［8］Kestendjieva S，Kyurkchiev D，Tsvetkova G etal.Characterization ofmesenchymal stem celIs isolated from the human umbilical cord［J］.Cell Biol Int，2008，32(7):724－732.

［9］Hung C T，Mauck R L.Biological assays:cellular level. In:Moore JE，Zouridakis G(eds)［M］.Biomedical technology and devices handbook.CRC Press，London，2004.

［10］Selvaggi T A，Walker R E，F(xiàn)leisher T A.Development of antibodies to fetal calf serum with arthus－like reactions in human immunodeficiency virus－infected patients given syngeneic lymphocyte infusions［J］.Blood，1997，89:776－779.

［11］Tonti G A，Mannello F.From bonemarrow to therapeutic applications:different behaviour and genetic/epigenetic stability during mesenchymal stem cell expansion in autologous and foetal bovine sera［J］.Int JDev Biol，2008; 52(8):1023－1032.

［12］Mizuno N，Shiba H，Ozeki Y，et al.Human autologous serum obtained using a completely closed bag system as a substitute for foetal calf serum in human mesenchymal stem cell cultures［J］.Cell Biol Int，2006，30(6):521－524.

［13］DominiciM，Le Blanc K，Mueller I，etal.Minimal criteria for defining multipotentmesenchymal stromal cells［J］. The International Society for Cellular Therapy position statement，Cytotherapy，2006，8(4):315－317.

(責(zé)任編輯 何杰玲)

Com parison of the Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Cultured by Serum-free Medium and Fetal Bovine Serum-contained Medium

CHEN Lin，ZHANG Kun，DONGWei，YANG Ke，AIHui，CHEN Lu－h(huán)ua
(Chongqing Enterprise Engineering Research Center of Stem Cell，Chongqing 401320，China)

To compare the differences of proliferation，biological characteristics，differentiation potential of serum－free and fetal bovine serum－contained medium cultured human umbilical cord－derived mesenchymal stem cells.Separated Wharton’s jelly from human umbilical cord，cultured umbilical cord mesenchymal stem cells in serum－freemedium and serum－supplied medium.Detected the cells’proliferation rate by MTTmethod and get the cell growth curve;observe the cellmorphology by microscope;Use flow cytometer to identify surface markers CD73，CD90，CD105，CD14，CD34，CD45，CD79a，and HLA－DR.We observe cells change of shape after cells cultured by Osteogenesis Differentiation and Adiposeness Differentiation medium.Use alkaline phosphatase and oil red O stai－ningmethods to ensure cells’differentiation.The cell morphology，proliferation activity，surface markers and differentiation potential of human umbilical cord mesenchymal stem cells cultured in serum－freemedium are similarwith which cultured in FBS－suppliedmedium.The composition of the serum－freemedium are animal origin free and the composition are known，so it’s a better human umbilical cord mesenchymal stem cell culturemediamedium

mesenchymal stem cells;cell culture;serum－freemedium;Fetal bovine serum

Q2－33

A

1674－8425(2014)09－0057－05

10.3969/j.issn.1674－8425(z).2014.09.013

2014－03－16

陳林，男，四川德陽人，主要從事生物技術(shù)方面的研究。

陳林，張坤，董偉，等.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清和含胎牛血清培養(yǎng)體系比較［J］.重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2014(9):57－61.

format:CHEN Lin，ZHANG Kun，DONGWei，et al.Comparison of the Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Cultured by Serum－free Medium and Fetal Bovine Serum－contained Medium［J］.Journal of Chongqing University of Technology:Natural Science，2014(9):57－61.