含自體富集骨髓干細(xì)胞松質(zhì)骨移植修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨大面積缺損的實(shí)驗(yàn)研究

胡德新 朱 博 應(yīng)小樟 石仕元 浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科 杭州 310003

含自體富集骨髓干細(xì)胞松質(zhì)骨移植修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨大面積缺損的實(shí)驗(yàn)研究

胡德新 朱 博 應(yīng)小樟 石仕元 浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科 杭州 310003

目的探討含自體富集骨髓干細(xì)胞松質(zhì)骨移植修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨大面積缺損的生物學(xué)特性和效果。方法30只新西蘭大白兔用利刀切除股骨髁全層關(guān)節(jié)軟骨達(dá)關(guān)節(jié)軟骨表面積的20%以上，制成關(guān)節(jié)軟骨大面積缺損模型。實(shí)驗(yàn)組30條膝關(guān)節(jié)取含自體富集骨髓干細(xì)胞松質(zhì)骨移植修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損；對(duì)照組30條膝關(guān)節(jié)軟骨缺損不作任何處理。于術(shù)后4、8、12周分批處死動(dòng)物取材，分別進(jìn)行膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度測(cè)定、大體觀察、光鏡觀察，并對(duì)觀察指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果各觀察節(jié)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組兔膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度均優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.01），于術(shù)后12周膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度已基本接近正常。實(shí)驗(yàn)組兔膝關(guān)節(jié)再生軟骨的表面積已基本完全填充造模缺損區(qū)，而對(duì)照組造模區(qū)缺損依然嚴(yán)重，僅修復(fù)20%左右，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)組再生軟骨與周邊軟骨愈合良好，再生軟骨的厚度為周邊正常軟骨的三分之二左右，表面較光滑平整，無(wú)凹陷。電鏡下，造模缺損區(qū)被再生軟骨組織覆蓋，表面光滑平整，周?chē)驼＼浌墙M織接合較好，基質(zhì)染色變深，軟骨細(xì)胞數(shù)量增多，且大多為透明軟骨細(xì)胞，可見(jiàn)潮線(xiàn)。結(jié)論含自體富集骨髓干細(xì)胞松質(zhì)骨移植能以類(lèi)透明軟骨形式修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨的大面積缺損。

兔；軟骨；松質(zhì)骨；移植；骨髓干細(xì)胞

關(guān)節(jié)軟骨是一種乏血管組織，一旦損傷后其自我修復(fù)能力有限。近年來(lái)，自體骨軟骨鑲嵌移植在國(guó)內(nèi)外相繼開(kāi)展，并取得一定的臨床療效[1-2]。然而，該方法的供體資源相當(dāng)缺乏，使得該技術(shù)在臨床應(yīng)用上存在瓶頸。解決供體資源的來(lái)源，成為關(guān)節(jié)外科醫(yī)生的重大挑戰(zhàn)。本實(shí)驗(yàn)使用含自體富集骨髓干細(xì)胞松質(zhì)骨鑲嵌移植修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨大面積缺損，并通過(guò)大體、電鏡等觀察，以期為臨床修復(fù)大面積關(guān)節(jié)軟骨缺損提供有效的供體來(lái)源。

1 材料與方法

1.1動(dòng) 物 健康成年純種新西蘭大白兔30只，雌雄不限，體質(zhì)量3.0～4.5kg，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用合格證號(hào)：SYXK（浙）2008-0116。飼養(yǎng)環(huán)境溫度18～22℃。

1.2方 法

1.2.1分 組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共60條膝，以計(jì)算器產(chǎn)生的隨機(jī)數(shù)字制作成隨機(jī)數(shù)字表，從隨機(jī)數(shù)字表任意點(diǎn)開(kāi)始選取連續(xù)的數(shù)字隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組30條膝關(guān)節(jié)。手術(shù)前觀察所有動(dòng)物活動(dòng)正常，無(wú)跛行等情況。

1.2.2自體富集骨髓干細(xì)胞提取 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用2.5%戊巴比妥鈉溶液以40mg/kg的劑量行耳靜脈麻醉，麻醉成功后于雙側(cè)髂后上棘備皮、消毒鋪巾，用15號(hào)20mL注射器刺入髂骨的松質(zhì)骨內(nèi)，共采集30～40mL左右骨髓血，置入含肝素（含25 000U）的儲(chǔ)血袋中。運(yùn)用全封閉血細(xì)胞分選系統(tǒng)（COBE 2991 Cell Processor，美國(guó)GAMBRO BCT.Inc），對(duì)采集的骨髓血進(jìn)行快速細(xì)胞分選。速度3000r/min，離心5～7min。分選過(guò)程中逐步富集的骨髓有核細(xì)胞層，通過(guò)分流管路，收集回收備用。

1.2.3移植物準(zhǔn)備 自制一套直徑4.0mm左右的圓形環(huán)鉆。采用此環(huán)鉆切取髂骨松質(zhì)骨圓柱3條，每條直徑4.0mm、高5.0mm，用生理鹽水浸泡去除殘留的血液，再用紗布吸干，而后將已收集的自體骨髓干細(xì)胞用注射器注入，體外凝固備用。

1.2.4手術(shù)方法 麻醉成功后將實(shí)驗(yàn)兔仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒，采用膝關(guān)節(jié)前內(nèi)側(cè)切口，暴露關(guān)節(jié)面，用利刀切除股骨髁全層關(guān)節(jié)軟骨達(dá)關(guān)節(jié)軟骨表面積的20%以上,制成關(guān)節(jié)軟骨大面積缺損模型，實(shí)驗(yàn)組將已準(zhǔn)備好的含自體富集骨髓干細(xì)胞松質(zhì)骨條植入缺損區(qū)，并使表面平整，對(duì)照組僅作局部止血處理，全部實(shí)驗(yàn)手術(shù)于2天內(nèi)完成。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后均肌肉注射青霉素16萬(wàn)單位，1天1次，共3天。并使其在開(kāi)闊環(huán)境中自由活動(dòng)。

1.2.5觀察指標(biāo)及方法 各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于術(shù)后4、8、12周分批行空氣栓塞處死，取股骨髁移植區(qū)及造模區(qū)為標(biāo)本。①活體觀察:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的關(guān)節(jié)活動(dòng)度采用改良的Clake weeknesser檢查標(biāo)準(zhǔn)（固定髖關(guān)節(jié)，距膝關(guān)節(jié)遠(yuǎn)側(cè)相等距離懸掛同等重量砝碼，測(cè)量膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度）。②再生軟骨面積百分比的觀察：運(yùn)用電腦測(cè)量軟件以多點(diǎn)面積平均法測(cè)量標(biāo)本再生軟骨的表面積并計(jì)算再生軟骨的表面積與造模缺損面積的百分比。③電鏡觀察：將所得標(biāo)本分別做蘇木精-伊紅染色和Masson染色切片，在電鏡下觀察，以了解再生組織的種類(lèi)和形態(tài)。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS10.0軟件，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1活體觀察 術(shù)后1周內(nèi)，兩組動(dòng)物活動(dòng)均減少并伴有跛行及雙膝略腫脹等情況；1周后逐漸減輕，直至正常行走。術(shù)后4、8、12周時(shí)各觀察時(shí)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)活動(dòng)度均優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.01），實(shí)驗(yàn)組在術(shù)后12周的膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度已基本接近正常。見(jiàn)表1。

表1 兩組動(dòng)物膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度比較（） 度

表1 兩組動(dòng)物膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度比較（） 度

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01

?

2.2再生軟骨面積百分比觀察 術(shù)后12周，實(shí)驗(yàn)組大白兔膝關(guān)節(jié)再生軟骨的表面積已基本完全填充造模缺損區(qū)，而對(duì)照組造模區(qū)缺損依然嚴(yán)重，僅修復(fù)20%左右，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 兩組動(dòng)物再生軟骨表面積百分比比較（） %

表2 兩組動(dòng)物再生軟骨表面積百分比比較（） %

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01

?

2.3大體標(biāo)本觀察 實(shí)驗(yàn)組再生軟骨與周邊軟骨愈合良好，再生軟骨的厚度為周邊正常軟骨的三分之二左右，表面較光滑平整，無(wú)凹陷。實(shí)驗(yàn)組再生軟骨表面光滑平整，周?chē)驼＼浌墙M織接合較好，而對(duì)照組再生軟骨表面凹陷，色澤泛黃，厚度較薄，見(jiàn)圖1（封二）。

2.4組織學(xué)電鏡觀察 術(shù)后12周，實(shí)驗(yàn)組造模缺損區(qū)被再生軟骨組織覆蓋，表面光滑平整，周?chē)驼＼浌墙M織接合較好，基質(zhì)染色變深，軟骨細(xì)胞數(shù)量增多，且大多為透明軟骨細(xì)胞，可見(jiàn)潮線(xiàn)。見(jiàn)圖2（封二）。

3 討 論

關(guān)節(jié)軟骨損傷后由于其特殊的生物學(xué)特點(diǎn)一般較難自我修復(fù)，特別是較大面積缺損（缺損面積＞2cm2，深度＞4mm）時(shí)無(wú)法自行修復(fù)。目前臨床上主要應(yīng)用方法有①微鉆孔技術(shù)：該法通過(guò)特定工具鉆透軟骨下骨，直達(dá)軟骨下松質(zhì)骨，使松質(zhì)骨內(nèi)富含骨髓多能干細(xì)胞的凝血塊集結(jié)在鉆孔區(qū)，從而誘導(dǎo)鉆孔區(qū)的軟骨組織再生。此技術(shù)操作簡(jiǎn)單易行，為軟骨缺損面積＜1cm2的患者的首選治療方法[3-5]；②自體骨軟骨的馬賽克移植技術(shù)：該法是通過(guò)自體關(guān)節(jié)非負(fù)重區(qū)的骨軟骨作為供體，通過(guò)特定工具，獲取一定數(shù)量的骨軟骨柱作為移植物，直接以馬賽克技術(shù)鑲嵌于缺損區(qū)，不需內(nèi)固定。該方法可在關(guān)節(jié)鏡下以微創(chuàng)手術(shù)的形式完成，并保持了移植體和移植區(qū)的緊密連接，具有取材方便，無(wú)排異，修復(fù)能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[4-5]。此外，有學(xué)者對(duì)自體取材區(qū)進(jìn)行了進(jìn)一步的探索[6]，但依然存在供區(qū)不足的情況，因此臨床上面對(duì)大面積的軟骨缺損尚無(wú)有效的修復(fù)方法。

實(shí)驗(yàn)研究方面主要集中在兩個(gè)方面:①組織移植：即運(yùn)用新鮮的自體或同種異體骨軟骨作為移植材料。②細(xì)胞的移植：通過(guò)自體或異體骨髓干細(xì)胞的體外PCR擴(kuò)增再輔以一定的框架載體形成工程化的軟骨移植材料。此類(lèi)研究主要集中在工程載體、種子細(xì)胞和調(diào)控因子等方面。載體包括天然和人工合成可降解的復(fù)合物如膠原、明膠、纖維蛋白和藻酸鹽、聚酸乳、聚羥基乙酸及其共聚物等。種子細(xì)胞主要有軟骨細(xì)胞、骨髓多能干細(xì)胞（BMSCs）和胚胎干細(xì)胞（ESs）等。調(diào)控因子種類(lèi)繁多，其中以骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）的研究最多[6-9]。但該類(lèi)方法操作復(fù)雜，技術(shù)要求較高，目前僅處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，如運(yùn)用于臨床尚待進(jìn)一步的探索。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)含自體富集骨髓干細(xì)胞的松質(zhì)骨移植在修復(fù)大面積兔關(guān)節(jié)軟骨缺損時(shí)，對(duì)膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度、大體標(biāo)本觀察、修復(fù)的表面積比等均有良好的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)支持，可以作為一種軟骨移植的方法供臨床上選擇使用。

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自體松質(zhì)骨作為移植載體，具有生物相容性好、無(wú)排斥反應(yīng)、不需要內(nèi)固定等優(yōu)點(diǎn)；以富集的自體骨髓干細(xì)胞為種子細(xì)胞修復(fù)軟骨缺損，避免了單純松質(zhì)骨中骨髓干細(xì)胞量少的缺點(diǎn)；并且也避免了細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖（PCR）對(duì)時(shí)間、環(huán)境、設(shè)備、費(fèi)用上的較高要求。本研究證實(shí)，修復(fù)大面積關(guān)節(jié)軟骨缺損，在無(wú)法獲取足夠的自體骨軟骨時(shí)，可采用含自體富集骨髓干細(xì)胞松質(zhì)骨鑲嵌移植技術(shù)修復(fù)缺損軟骨[10]。

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Large Area Articular Cartilage Defect Repaired with Cancellous Bone Enriching Bone Marrow Stem Cells

HU Dexin,ZHU Bo,YING Xiaozhang,SHI Shiyuan.Department of Oethopedics,Zhejiang Province Hospital of the Integration of Traditional Chinese and Western Medicine,Hangzhou(310003),China

ObjectiveTo evaluate the therapeutic efficacy of cancellous bone enriching bone marrow stem cells in treatment of large area defects of articular cartilage in weight-bearing joints.MethodsSixty knees from 30 adult rabbits were randomly divided into experimental and control groups（n=30 in each）.Full-thickness articular cartilage defects in the femoral condyle of the knees were created.Cancellous bone enriching bone marrow stem cells was implanted for repair of the defects in experimental group.Spontaneous evolution occurred in control group.Rabbits were sacrificed in both groups at 4,8 and 12 weeks.Range of motion,macroscopic,and histological evaluation were observed.ResultsThe range of motion was better in experimental group than that in control group at any time point（P＜0.01）;at 12 weeks,the range of motion was almost normal in experimental group.Cancellous bone enriching bone marrow stem cell transplant completely repaired the lesions,but complete repair were not seen in control group（only about 20%lesions were repaired）,with a significant difference between two groups（P＜0.01）. The articular cartilage defect was well healed with regenerated cartilage that was with a 2/3 thickness of normal cartilage with smooth surface.Histological examination also showed a complete repair in the defect by bone marrow stem cell-derived cartilage.ConclusionCancellous bone enriching bone marrow stem cell implantation can repair large,full-thickness articular cartilage defects by regenerating hyaline-like cartilage.

rabbit；cartilage；cancellous bone；implantation；bone marrow stem cells

2013-08-27

杭州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技重點(diǎn)項(xiàng)目（No.20070433Q20）

胡德新，E-mail：huhudexin@163.com