桑葉總黃酮對(duì)糖尿病高脂血癥大鼠血糖、血脂和胸主動(dòng)脈p22phox mRNA表達(dá)的影響

張凇銘黃 平杜靜靜

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 杭州 310053 2浙江省中醫(yī)院

·論 著·

桑葉總黃酮對(duì)糖尿病高脂血癥大鼠血糖、血脂和胸主動(dòng)脈p22phox mRNA表達(dá)的影響

張凇銘1黃 平2杜靜靜1

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 杭州 310053 2浙江省中醫(yī)院

目的探討桑葉總黃酮（FML）對(duì)糖尿病高脂血癥大鼠血糖、血脂和胸主動(dòng)脈p22phox mRNA表達(dá)的影響。方法60只雄性SD大鼠隨機(jī)分成空白組、模型組、FML低、中、高劑量組和西藥組，每組10只，觀察FML對(duì)大鼠血糖、血脂、胸主動(dòng)脈p22phox mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果與空白組比較，模型組大鼠血糖、血脂顯著升高（P＜0.01），胸主動(dòng)脈p22phox mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）。與模型組比較，F(xiàn)ML中、高劑量組及西藥組大鼠血糖、血脂降低（P＜0.05或P＜0.01），F(xiàn)ML中、高劑量組及西藥組大鼠胸主動(dòng)脈p22phox mRNA表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論FML顯著降低糖尿病高脂血癥大鼠血糖、血脂水平，其機(jī)制可能與FML下調(diào)大鼠胸主動(dòng)脈p22phox mRNA表達(dá)，進(jìn)而抑制NADPH氧化酶活化有關(guān)。

大鼠；糖尿??；高脂血癥；桑葉總黃酮；p22phox mRNA；血糖；血脂

有研究表明，糖尿病無(wú)論大血管還是微血管的并發(fā)癥都有同一種發(fā)病機(jī)制—即高糖損傷后產(chǎn)生的氧化應(yīng)激[1]。氧化應(yīng)激擾亂了組織的正常功能。NADPH氧化酶活化是生成氧自由基的關(guān)鍵[2]，p22phox是導(dǎo)致NADPH酶活化的關(guān)鍵亞基[3]。也有研究表明，富含黃酮類化合物的植物提取物具有降低血脂、清除體內(nèi)自由基等功效[4]。本研究旨在通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討桑葉總黃酮（total flavonoid of mulberry leaf，F(xiàn)ML）抑制大鼠胸主動(dòng)脈p22phox mRNA表達(dá)作用，同時(shí)觀察FML對(duì)血糖、血脂等指標(biāo)的影響，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1動(dòng) 物 雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量（170±20）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SCXK（滬）2008-0016，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房。

1.2藥物與試劑 桑葉總黃酮（FML）（純度：50.5%；規(guī)格：1kg/包，塑封；批號(hào)ZL121016；南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司）；鏈脲佐菌素（STZ）（純度：99.89%；規(guī)格：500mg/瓶；批號(hào)B64927，北京博愛(ài)港商貿(mào)中心）；mRNA提取試劑（規(guī)格：50T；批號(hào)C周0584，世紀(jì)康為生物公司）；RT-PCR試劑盒（規(guī)格：2500T/50ul反應(yīng)體系，批號(hào)372300101，北京鼎國(guó)生物有限公司）；高糖高脂飼料（5%蛋黃粉、10%豬油、20%白糖、2%膽固醇、0.2%膽酸鈉、62.8%基礎(chǔ)飼料，浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1造模與分組 60只雄性SD大鼠依次編號(hào)為1～60號(hào)，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行完全隨機(jī)分組，隨后選取10只大鼠，作為空白組，予普通飼料喂養(yǎng)直到試驗(yàn)結(jié)束，其余50只大鼠按倪紅霞[5]高糖高脂飲食加STZ一次性腹腔注射法復(fù)制糖尿病高脂血癥大鼠模型，50只大鼠予高糖高脂飲食飼養(yǎng)4周，4周后所有大鼠禁食12h，空白組大鼠按30mg/kg腹腔注射pH4.4的檸檬酸緩沖液，其余50只大鼠一次性腹腔注射STZ（1%STZ 30mg/kg，現(xiàn)配），3天后所有大鼠測(cè)血糖及24h尿量，以血糖＞16.7mmol/L，尿量大于空白組50%者為造模成功，成模后的大鼠依舊按隨機(jī)數(shù)字表法再次完全隨機(jī)分為5組，即模型組、FML低劑量組（0.4g/3mL，F(xiàn)ML）、FML中劑量組（0.8g/3mL，F(xiàn)ML）、FML高劑量組（1.6g/3mL，F(xiàn)ML）、羅格列酮與辛伐他汀聯(lián)合組（以下簡(jiǎn)稱西藥組，0.2mg羅格列酮+ 0.8mg辛伐他西/3mL），每組各10只，采用固定時(shí)間灌胃給藥方式進(jìn)行，空白組及模型組予灌胃等體積的生理鹽水，1天1次，持續(xù)給藥4周，治療期間模型組及治療組繼續(xù)給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，直到試驗(yàn)結(jié)束。

2.2標(biāo)本收集 給藥4周后處死全部大鼠，以10%水合氯醛0.3mL/100g腹腔注射麻醉大鼠，常規(guī)消毒鋪巾，打開(kāi)胸腔，心臟取血，抗凝管保存，剝離胸主動(dòng)脈，放入液氮罐中，隨后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存待用。

2.3觀察指標(biāo)及方法

2.3.1血糖測(cè)定 采用強(qiáng)生血糖試紙及血糖儀，所有大鼠分別于造模前、給藥2周后及給藥4周后尾靜脈斷尾取血測(cè)血糖。

2.3.2血脂指標(biāo)測(cè)定 取全血1～2mL，放入抗凝管中妥善保存，委托浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)室測(cè)定CH、TG、LDL-C。

2.3.3胸主動(dòng)脈p22phox mRNA表達(dá) 采用RTPCR法。嚴(yán)格按照動(dòng)物組織總mRNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作方法操作，提取SD大鼠胸主動(dòng)脈總RNA。0.5mLEp管中加入3μg總RNA，Oligo（dT）18引物1uL，dNTPs 1μL，5×First-strand 4μL，M-MLV 1uL，RNA酶抑制劑1μL，用RNase水補(bǔ)足至20μL，離心后，42℃保溫60min，95℃5min，4℃2min，冰上驟冷后得到cDNA。引物根據(jù)Gene Bank序列用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)后由北京鼎國(guó)昌盛生物公司合成。p22phox的正向引物：5’-ACT CCC ATT GAG CCT AAA CC-3’;反向引物5’-GGA GCA ACA CCT TGG AAA C-3’;產(chǎn)物片段226bp。內(nèi)參GADPH正向引物：5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’；反向引物：5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’；產(chǎn)物片段452bp。PCR總體系10uL，其組成為cDNA 3μL，HS Taq 5μL，引物正反向各0.2μL，ddH2O 1.6μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)40次，72℃延伸10min。

2.3.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件，數(shù)據(jù)以（） 表示，計(jì)量資料進(jìn)行方差分析，組間均數(shù)兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1各組大鼠血糖比較 給藥2周和4周后FML低劑量組與模型組比較，雖有差異但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；FML中、高劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；西藥組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 各組給藥2周和4周血糖值比較（） mmol/L

表1 各組給藥2周和4周血糖值比較（） mmol/L

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

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3.2各組大鼠血脂比較 模型組與空白組各指標(biāo)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說(shuō)明造模成功。FML中、高劑量組和西藥組大鼠總膽固醇和甘油三酯降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。FML低、中、高劑量組和西藥組LDL-C降低與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)表2。

表2 各組血清CH、TG和LDL-C比較（） mmol/L

表2 各組血清CH、TG和LDL-C比較（） mmol/L

注：與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

3.3FML對(duì)SD大鼠胸主動(dòng)脈p22phox mRNA表達(dá)的影響 模型組胸主動(dòng)脈p22phox mRNA表達(dá)量較空白組明顯上調(diào)（P＜0.01）。FML低劑量組與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；FML中、高劑量組和西藥組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)表3。

表3 各組p22phox mRNA表達(dá)量比較（） ng/mL

表3 各組p22phox mRNA表達(dá)量比較（） ng/mL

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

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4 討論

糖尿病是心血管疾病發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素之一，高糖情況下內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生特異的功能改變導(dǎo)致血管脂質(zhì)斑塊形成是血管并發(fā)癥的主要表現(xiàn)。研究[6]表明，高糖有細(xì)胞毒性，降低細(xì)胞自由基清除功能，加速細(xì)胞凋亡。內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生功能改變的主要原因有：①氧化應(yīng)激增強(qiáng)，體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成增多；②內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；③誘發(fā)炎癥反應(yīng)。抑制細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激是保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能、防治糖尿病心血管并發(fā)癥的關(guān)鍵途徑之一[7]。

ROS在內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)與損傷過(guò)程中起關(guān)鍵作用，低水平的ROS可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，而高水平的ROS則可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。ROS的產(chǎn)生途徑有NOS失偶聯(lián)、NADPH氧化酶活化等，其中NADPH氧化酶活化是公認(rèn)的內(nèi)皮系統(tǒng)中最主要的ROS來(lái)源。NOX主要包括五個(gè)組分：p22phox、p47phox、Rac1、p67phox、p91phox[8]。p22phox是NADPH氧化酶活性必需亞單位。P22phox在72位和94位的組氨酸殘基是血紅蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，與NOX的功能密切相關(guān)。Christ等[9]用高濃度葡萄糖處理過(guò)的豬冠狀動(dòng)脈，分離出的細(xì)胞中能觀察到p22phox mRNA表達(dá)上調(diào)，Talija等[10]提高內(nèi)皮細(xì)胞p22phox mRNA表達(dá)后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS顯著增加。這些研究提示p22phox參與血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS的生成，增加氧化應(yīng)激反應(yīng)。

桑葉異名鐵扇子，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，桑葉性味甘、寒，甘所以益血，寒所以涼血，甘寒相合，故下氣而益陰，有補(bǔ)益之功，是中醫(yī)清熱解毒之要藥。1963年Sharat等首次報(bào)道桑葉水提液的降血糖作用，也有研究表明，富含黃酮類化合物的植物提取物具有降低血脂、降低ROS水平等功效。桑葉含豐富的黃酮類化合物，為純天然藥物，毒副作用小，適合糖尿病患者長(zhǎng)期服用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)FML治療后大鼠胸主動(dòng)脈p22phox mRNA相對(duì)表達(dá)量下調(diào)，大鼠血糖、血脂指標(biāo)降低，提示FML有抑制p22phox mRNA表達(dá)，降血糖、血脂的功效。其機(jī)制可能是：一方面FML下調(diào)p22phox mRNA表達(dá)，減少NADPH氧化酶活化，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞；另一方面降低體內(nèi)高糖環(huán)境，降低細(xì)胞毒性，減緩細(xì)胞凋亡。既往的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)ML具有降血脂作用，但并沒(méi)有說(shuō)明其降血脂的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)ML可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激關(guān)鍵活化酶必需亞單位p22phox mRNA表達(dá)，達(dá)到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞降低血脂防治糖尿病心血管并發(fā)癥，其作用大小與FML濃度有關(guān)。由于本實(shí)驗(yàn)樣本小，觀察時(shí)間短，尚存在一定不足，至于是否還有NADPH氧化酶亞單位參與ROS形成，F(xiàn)ML是否還作用于NADPH氧化酶的其他亞單位，F(xiàn)ML是否能具有預(yù)防炎癥反應(yīng)，其降糖又是通過(guò)哪些途徑發(fā)生作用，有待進(jìn)一步研究。

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Effects of Total Flavonoids from Mulberry Leaves on Blood Glucose,Blood Lipid and the expression of P22phox mRNA in Thoracic Aorta in Diabetic and Hyperlipidemia Rats

ZHANG Songming1,HUANG Ping2, Du Jingjing1.1 The First Clinical Medical College of Zhejiang University of Chinese Medicine,Hangzhou(310053), China;2 Zhejiang Provincial Hospital of TCM

ObjectiveTo investigate the influence of total flavonoids from mulberry leaves（FML）on blood glucose,blood lipid and the expression of p22phox mRNA in thoracic aorta in rats with diabetes and hyperlipidemia.MethodsDiabetes and hyperlipidemia rats were used in this study.Sixty SD male rats were randomly into blank group,model group,treatment groups（high,middle,low dose of FML and western medicine group）,10 in each group.The effect of FML on blood glucose,blood lipid and the expression of p22phox mRNA in thoracic aorta was observed.ResultsBlood glucose,blood lipid and the expression of p22phox mRNA in thoracic aorta in rats in model group were higher than those in blank group（P＜0.01）.Compared with model group,rats in middle and high dose of FML groups and western medicine group had lower blood glucose,blood lipid and decreased expression of p22phox mRNA in thoracic aorta（P＜0.05 or P＜0.01）.ConclusionFML can inhibit levels of blood glucose and blood lipids in diabetes and hyperlipidemia rats.This effect may be due to decreasing the expression of p22phox mRNA in thoracic aorta and then the activation of NADPH oxidase.

rats；diabetes；hyperlipidemia；flavonoids from mulberry leaves；p22phox mRNA；blood glucose；blood lipids

2013-08-27

浙江省科技廳、省團(tuán)委、教育廳基金資助項(xiàng)目（No.2012R410059）

黃平，Tel：18958025557；E-mail：htyhp_63@163.com