活血生肌中藥外用對大鼠失神經(jīng)支配創(chuàng)面角蛋白19表達(dá)的影響

董黎強(qiáng)成信法尹 航王昌興胡偉鋒

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨一科 杭州 310053 2浙江中醫(yī)藥大學(xué)

活血生肌中藥外用對大鼠失神經(jīng)支配創(chuàng)面角蛋白19表達(dá)的影響

董黎強(qiáng)1成信法2尹 航1王昌興1胡偉鋒1

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨一科 杭州 310053 2浙江中醫(yī)藥大學(xué)

目的觀察活血生肌外用中藥對大鼠失神經(jīng)支配創(chuàng)面角蛋白19（k19）陽性表達(dá)的影響。方法168只SD大鼠隨機(jī)分成龍血膏組、生肌膏組、失神經(jīng)組和正常組，每組42只。對前三組大鼠制造背部失神經(jīng)支配的深創(chuàng)面模型，之后各組創(chuàng)面分別以龍血生肌膏、生肌愈皮膏、凡士林外用治療；正常組大鼠背部制造深創(chuàng)面模型，以凡士林治療。觀察不同時(shí)間點(diǎn)各組創(chuàng)面愈合率、創(chuàng)面組織k19陽性表達(dá)率。結(jié)果各時(shí)間點(diǎn)正常組兩中藥組創(chuàng)面愈合率均高于失神經(jīng)組（P＜0.05，P＜0.01）。龍血膏組、生肌膏組k19陽性表達(dá)于第11天達(dá)峰值，失神經(jīng)組和正常組第15天達(dá)峰值。第4、7、11、15天時(shí)龍血膏組、生肌膏組k19陽性表達(dá)率明顯高于失神經(jīng)組和正常組（P＜0.05，P＜0.01），失神經(jīng)組低于正常組（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論活血生肌外用中藥對失神經(jīng)支配創(chuàng)面的愈合有促進(jìn)作用，可能與外用中藥增強(qiáng)了失神經(jīng)支配創(chuàng)面的表皮干細(xì)胞增殖與分化有關(guān)。

大鼠；創(chuàng)面；去神經(jīng)支配；生肌愈皮膏；龍血生肌膏；角蛋白19

截癱后肢體創(chuàng)面、壓力性及糖尿病性潰瘍多伴有創(chuàng)面范圍神經(jīng)支配的缺失或障礙[1]，失神經(jīng)支配的創(chuàng)面愈合較困難[2]。研究認(rèn)為，創(chuàng)面愈合與表皮干細(xì)胞（ESCs）的增殖、分化關(guān)系緊密[3]，神經(jīng)纖維物質(zhì)對表皮干細(xì)胞的調(diào)控發(fā)揮著重要作用[4]，而伴有神經(jīng)受損創(chuàng)面的愈合困難可能與這種調(diào)控的缺失密切相關(guān)[5]。鑒于表皮干細(xì)胞在創(chuàng)面修復(fù)中的重要作用，本課題以表皮干細(xì)胞表面標(biāo)記物角蛋白19（K19）為主要觀測指標(biāo)，探討活血生肌外用中藥干預(yù)失神經(jīng)支配創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠168只，體質(zhì)量220～250g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號：SYXK（浙）2003-0003。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 生肌愈皮膏（藥物組成：乳香、沒藥、當(dāng)歸、甘草、白芷、杏仁，濟(jì)南恒基制藥有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號：B20021045）。龍血生肌膏（藥物組成：地龍、血竭、生大黃、黃柏、乳香、沒藥、白及等，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院配制）。

1.3動(dòng)物模型制作 168只大鼠隨機(jī)分為龍血膏組、生肌膏組、失神經(jīng)組和正常組，每組42只。參照文獻(xiàn)制造失神經(jīng)支配的深創(chuàng)面模型[1]：取大鼠背部為手術(shù)部位，除正常組外，其余三組以0.3%戊巴比妥鈉按10mL/kg劑量腹腔注射麻醉后先離斷T11～13、L1～2脊神經(jīng)。繼而四組均以自制直徑1.5cm的環(huán)形紙板在大鼠脊柱右側(cè)旁開1cm外皮膚上作標(biāo)記，消毒后剪除直徑1.5cm的圓形皮膚，再以直徑1.5cm、深度2mm的自制金屬環(huán)鋸在相應(yīng)皮膚缺損區(qū)域肌肉上作環(huán)形切割，并以手術(shù)刀片去除該區(qū)域內(nèi)深度2mm的肌肉組織。術(shù)后龍血膏組、生肌膏組大鼠創(chuàng)面分別以龍血生肌膏、生肌愈皮膏各1g外用；失神經(jīng)組和正常組創(chuàng)面以凡士林外用。均以紗布包扎創(chuàng)面，每天定時(shí)換藥1次。每只大鼠均單籠喂養(yǎng)，并自由飲水、進(jìn)食。

1.4檢測指標(biāo) ①創(chuàng)面愈合率：造模后1、4、7、11、15、21、28天各組處死大鼠各6只，以數(shù)碼照相機(jī)等距離拍攝創(chuàng)面，將創(chuàng)面圖像掃入計(jì)算機(jī)，Image Pro Plus6.0軟件算出創(chuàng)面面積，再算出創(chuàng)面愈合指數(shù)，并測算創(chuàng)面愈合率[6]。②創(chuàng)面K19測定及觀察：不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠創(chuàng)面組織樣本進(jìn)行K19的免疫組織化學(xué)染色，光鏡下觀察K19的表達(dá)情況，K19陽性細(xì)胞呈現(xiàn)為細(xì)胞胞核復(fù)染為藍(lán)色，細(xì)胞漿為棕黃色，胞膜無著色。用Image pro plus6.0圖像分析系統(tǒng)分析軟件，測定距離創(chuàng)面中心0.6cm范圍內(nèi)的表皮及真皮K19表達(dá)陽性信號。每個(gè)標(biāo)本陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)方法：任意選擇20個(gè)400倍視野拍照，對每個(gè)視野內(nèi)的100個(gè)細(xì)胞進(jìn)行觀察，記錄該視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)，測算陽性細(xì)胞率[7]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示。對多組計(jì)量資料進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組創(chuàng)面愈合率比較 實(shí)驗(yàn)第4天始，各觀察時(shí)間點(diǎn)失神經(jīng)組創(chuàng)面愈合率明顯低于兩個(gè)中藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。正常組創(chuàng)面愈合率明顯高于失神經(jīng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。各時(shí)間點(diǎn)兩中藥組間創(chuàng)面愈合率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2各組K19陽性細(xì)胞表達(dá)率比較 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，術(shù)后第1天，各組創(chuàng)面K19陽性表達(dá)均少，失神經(jīng)組最低，與龍血膏組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。從造模后第4天起各組創(chuàng)面K19陽性細(xì)胞開始明顯增加。第4、7、11、15天4個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩中藥組K19陽性細(xì)胞率均高于失神經(jīng)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；正常組第4、7、11、15天4個(gè)時(shí)間點(diǎn)K19陽性細(xì)胞率均高于失神經(jīng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；兩中藥組第4、7、11、15天時(shí)間點(diǎn)K19陽性細(xì)胞率均高于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；四組第21、28天K19陽性細(xì)胞率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩中藥組K19陽性細(xì)胞率均于第11天達(dá)到峰值，而失神經(jīng)組和正常組則延遲至第15天才達(dá)到峰值。各時(shí)間點(diǎn)龍血膏組K19陽性細(xì)胞率均稍高于生肌膏組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

3 討論

研究提示，表皮生長因子（EGF）對于創(chuàng)面愈合的調(diào)控起著重要的作用，其機(jī)制主要是通過誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞的增殖和分化從而達(dá)到加速受損表皮的再生[2]。同時(shí)研究表明[4]，神經(jīng)因素與機(jī)體多種干細(xì)胞分化及遷移關(guān)系密切，表皮干細(xì)胞和感覺神經(jīng)纖維在時(shí)空分布上具有一致性。伴有神經(jīng)缺失或障礙的難愈合創(chuàng)面同時(shí)也存在著神經(jīng)纖維物質(zhì)對表皮干細(xì)胞調(diào)控的缺失[5]。因此，表皮干細(xì)胞目前已經(jīng)成為一個(gè)創(chuàng)面愈合的重要觀察指標(biāo)，如何促進(jìn)失神經(jīng)支配創(chuàng)面表皮干細(xì)胞的增殖、分化是一個(gè)值得研究的課題。目前對于特異性的表皮干細(xì)胞表面標(biāo)記物尚未統(tǒng)一認(rèn)識(shí),但對于如角蛋白15、19（K15、K19）和β1整合素等一些細(xì)胞表面糖蛋白，已被諸多學(xué)者加以關(guān)注[8]。研究指出[8]，K19被認(rèn)為不僅僅是毛囊隆突處干細(xì)胞的表面標(biāo)記物，也是表皮干細(xì)胞的表面標(biāo)記物,對于表皮干細(xì)胞的鑒定及分選都有著重要的意義。因此，我們選用K19作為觀察指標(biāo)，通過檢測K19的陽性表達(dá)反映表皮干細(xì)胞的含量變化，了解創(chuàng)面愈合的過程。

表1 各組創(chuàng)面愈合率比較（） %

表1 各組創(chuàng)面愈合率比較（） %

注：與失神經(jīng)組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

表2 各組創(chuàng)面組織中K19陽性細(xì)胞率比較（） %

表2 各組創(chuàng)面組織中K19陽性細(xì)胞率比較（） %

注：與失神經(jīng)組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別龍血膏組生肌膏組失神經(jīng)組正常組創(chuàng)面/個(gè)6 6 6 6第1天11.22±1.24△10.53±1.33 9.13±1.58 10.31±1.19第4天24.30±1.11△△** 23.52±1.25△△** 13.35±1.67 16.21±1.52△第7天48.39±2.69△△** 46.88±2.77△△** 22.65±1.82 30.45±1.74△△第11天73.16±3.19△△** 71.54±3.25△△** 32.38±2.23 42.62±2.81△△第15天59.12±2.19△△** 57.85±2.08△△* 48.62±2.54 55.27±1.88△△第21天28.43±1.33 27.67±1.22 27.33±1.65 29.21±2.01第28天16.20±1.83 14.81±1.21 14.67±1.72 15.28±0.98

中醫(yī)藥對于創(chuàng)面治療有著一套獨(dú)特的理論系統(tǒng)，而且歷史悠久，驗(yàn)效兼?zhèn)洹｝堁「嗑哂谢觥⑶鍩?、祛腐、生肌之功效，?yīng)用該藥治療諸多慢性難愈創(chuàng)面有較好療效。從藥物組方來看，龍血生肌膏與生肌愈皮膏方中皆有乳香、沒藥，兩藥膏均具活血生肌、消腫止痛之功效。生肌愈皮膏中的當(dāng)歸為補(bǔ)血活血之品，甘草為益氣、清熱解毒之藥，杏仁苦辛疏泄，入氣分。三味相伍補(bǔ)氣血、清解之力強(qiáng)，兼具活血消腫之功。而龍血生肌膏中的地龍具有解毒、活血化瘀、生肌止痛和抑菌作用，《本草綱目》記載能治潰爛、口舌糜瘡。血竭原名麒麟竭，曾被李時(shí)珍推祟為“活血圣藥”，稱其能“散瘀血諸痛”，可“治外傷出血不止……臁瘡潰久不合”。并認(rèn)為“乳香、沒藥雖主血病，而兼入氣分，此則專于血分者也。”方中地龍、血竭、乳香、沒藥合用，則活血生肌、化瘀止痛之效更專；更佐以黃柏和生大黃清熱燥濕，瀉火逐瘀；白及收斂止血，消腫生肌。因此，龍血生肌膏和生肌愈皮膏均具有很好的化瘀、清熱、祛腐、生肌之功效。

本研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)面失神經(jīng)支配后其愈合速度明顯慢于正常創(chuàng)面，而外用龍血生肌膏與生肌愈皮膏對于失神經(jīng)支配創(chuàng)面的愈合均有明顯促進(jìn)作用。失神經(jīng)支配創(chuàng)面K19的陽性表達(dá)率，在創(chuàng)面愈合的中、后期階段明顯低于正常創(chuàng)面。而外用中藥對于失神經(jīng)支配創(chuàng)面K19的陽性表達(dá)有明顯的促進(jìn)作用，兩中藥組均提前了K19陽性表達(dá)的峰值。龍血生肌膏促進(jìn)失神經(jīng)支配創(chuàng)面K19陽性表達(dá)的作用略優(yōu)于生肌愈皮膏，但兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。上述結(jié)果提示，中藥對失神經(jīng)支配創(chuàng)面表皮干細(xì)胞增殖分化的調(diào)節(jié)作用比較突出。

因此，我們認(rèn)為，外用愈創(chuàng)中藥對于失神經(jīng)支配創(chuàng)面的愈合有明顯的促進(jìn)作用，其機(jī)制可能與外用中藥能有效增強(qiáng)創(chuàng)面表皮干細(xì)胞的增殖分化有關(guān)。失神經(jīng)支配創(chuàng)面愈合過程復(fù)雜，影響因素眾多；并且促進(jìn)創(chuàng)面愈合的外用中藥種類繁多，有效成分難以明確。本實(shí)驗(yàn)僅提供了從表皮干細(xì)胞著手研究外用中藥促進(jìn)失神經(jīng)支配創(chuàng)面愈合作用機(jī)制的思路。對于外用中藥對神經(jīng)物質(zhì)與表皮干細(xì)胞之間的相關(guān)性、細(xì)胞內(nèi)外信號通路的影響等尚有待進(jìn)一步研究。

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Effect of the External Use of Chinese Traditional Medicine on Keratin 19 of the Denervated Wound of Rats

DONG Liqiang1，CHENG Xinfa2，YIN Hang1，WANG Changxing1，HU Weifeng1.1 Second Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou(310053)，China；2 Zhejiang Chinese Medical University

ObjectiveTo investigate the effect of the external use of Chinese medicine on the expression of Keratin 19（K19）in denervated wound healing of rats.MethodsOne hundred and sixty-eight SD rats were randomly divided into 4 groups:A group（longxuegao group），B group（shengjigao group），C group（denervated group），and D group（normal group），42 rats in each group.A wound with denervated whole layer skin defection was established on the back of every rat in A，B，and C groups，while a wound with whole layer skin defection was established on the back of every rat in D group.The rat in A and B groups were externally treated with the corresponding drugs，and the rat in C and D groups were treated with vaseline.The healing rates of wound were calculated and the level of K19 expression was determined by immunohistochemistry at different time points after intervention.ResultsThe healing rate of A，B，and D groups were higher than that of C group（P＜0.05）.The level of K19 expression of A and B groups reached the peak on d11，which was earlier than that of C and D groups（on d15）.On d4，d7，d11，d15，the level of K19 expression of A and B groups was significantly higher than that of C and D groups（P＜0.05 or P＜0.01），and that of C group was lower than that of D group（P＜0.05 or P＜0.01）.ConclusionThe external use of Chinese medicine can promote wound healing of denervation.Its mechanism may be related to enhancing proliferation and differentiation of epidermal stem cells in the healing process of the wound of denervation.

rats；wound；denervation；shengjiyupigao；longxueshengjigao；keratin 19

2013-10-08

修回日期：2014-02-27

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2009CA035）

董黎強(qiáng)，E-mail：dlq58@126.com，Tel：13867432797