青蛤堿性蛋白酶水解物的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

王水霞 王珊珊

摘要：

目的：探討青蛤內(nèi)臟堿性蛋白酶水解物的體外抗氧化活性。方法：利用正交實(shí)驗(yàn)確定青蛤內(nèi)臟堿性蛋白酶的最佳酶解條件，測定水解物對清除DPPH自由基、清除超氧自由基、螯合力和還原鐵的能力。結(jié)果：水解物抗氧化活性最大的影響因素為pH值，最小的影響因素為水解時間，且當(dāng)溫度為50℃、時間為4h、加酶量為2000 u/g、pH為9時，水解物的抗氧化活性最強(qiáng)。在最佳抗氧化水解條件下得到的水解物，對羥自由基、DPPH自由基、Fe²⁺離子的螯合作用均有一定的清除活性。結(jié)論：堿性蛋白酶對青蛤水解得到的水解物具有較好的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：青蛤； 抗氧化性；清除率

【中圖分類號】

R453 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B 【文章編號】1002-3763（2014）05-0042-02

1 前言

青蛤（Cyclina sinensis（Gmelin））分布于我國沿海潮間帶的泥砂灘中，肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，經(jīng)濟(jì)價值頗高，倍受消費(fèi)者的青睞價值^[1]。目前，隨著海洋生物研究的深入開發(fā)和研究技術(shù)的提高，從海洋生物中尋找新的天然抗氧化劑已成為海洋藥物研究的重要目標(biāo)之一^[2]。應(yīng)用蛋白酶對生物蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，其水解的溶液中含有大量活性肽和氨基酸，如?；撬?、胱氨酸、組氨酸、色氨酸、賴氨酸、亮氨酸、纈氨酸都具有抗氧化能力。我國已從動植物（如鰱魚^[3]、牡蠣^[4]等）中用酶解的方法獲取大量活性肽。但有關(guān)青蛤內(nèi)臟堿性蛋白酶水解物的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)報道不多，本文是以新鮮青蛤?yàn)樵希妹附馄淙饷铀玫乃庖哼M(jìn)行清除DPPH自由基、清除超氧自由基、螯合和還原鐵的研究。

2材料與儀器

2.1實(shí)驗(yàn)原料及試劑：

新鮮的青蛤，購于舟山市場，去殼后，-20℃冰箱冷藏備用；堿性蛋白酶194000 u / g，工業(yè)級，北京亞太恒信生物科技有限公司；鄰二氮菲、DPPH、鐵氰化鉀購自上海晶純試劑有限公司，其余試劑為分析純均購置國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2.2儀器：BSA1245型電子天平 中國，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；

CF16RXⅡ高速冷凍離心機(jī) 日本，HITACHZ公司；

UV-1600PC型 紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；

SSW型微電腦電熱恒溫水槽 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

3實(shí)驗(yàn)方法

3.1正交實(shí)驗(yàn)：

參照文獻(xiàn)^[5]，選用堿性蛋白酶，考慮到1（溫度）、2（時間）、3（加酶量）、4（pH）四個因素，每個因素選三個水平進(jìn)行四個因素的正交實(shí)驗(yàn)，比較堿性蛋白酶在不同水解條件下的DPPH自由基清除率，從而確定堿性蛋白酶的最佳水解條件。

水解液的制備：青蛤→除去外殼取內(nèi)臟→內(nèi)臟破碎→以1∶ 3比例加水→加入堿性蛋白酶→水解→沸水滅活→放置冷卻→10000r /min離心10min→取上清液→冷凍干燥→DPPH自由基清除率測定。

3.2對DPPH自由基的清除作用：

按照文獻(xiàn)^[6-8]進(jìn)行DPPH自由基清除活性測定。配置DPPH濃度0.1 mmol/L（無水乙醇溶解）避光保存。方法：1mL樣品+1mLDPPH，混合均勻，避光保存30min，4000r/min離心10min，517nm處測吸光度Ai^[9]。同時測1mL無水乙醇+1mL樣品混合的測吸光度Aj，和1mLDPPH+1mL水混合測吸光度Ac。

DPPH清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%

3.3對羥自由基清除率的測定：

參考文獻(xiàn)^[10-12]所述的方法，并做了適當(dāng)調(diào)整。取濃度為0.75 mmol/L鄰二氮菲1mL在試管中，并且按順序加入pH值為7.4的磷酸緩沖液（PBS）2mL，樣品溶液1ml，充分混勻，然后加入濃度為0.75 mol/L的硫酸亞鐵1mL，混勻，加入0.03%雙氧水1mL，37℃水浴1小時，于536nm處測其吸光度As；空白組用水代替雙氧水，為Ab；損傷組用水代替樣品，為Ap。

清除率（%）=[（As-Ap）/（Ab-Ap）]×100%

3.4對Fe²⁺離子的螯合作用：

將干凈的具塞試管中分別依次加入不同質(zhì)量濃度的受試樣品（3mg/mL～20mg/mL）0.5mL， 20μM FeCl2溶液1 mL，混勻后加入0.5 mM ferrozine 1 mL，25℃反應(yīng)20min后于562 nm處測定吸光度Ab^[13]；空白組以水代替樣品，為Ac。

螯合力（%）=（1-Ab/Ac）×100%

3.5還原能力的測定：參考文獻(xiàn)^[14]并略有改動。將干凈的具塞試管中分別依次加人樣品1mL，另加入1mL Tris-HCl （0.2 mol/L，pH=6.6 ）及1%鐵氰化鉀2.5 mL，混勻后于50℃水浴20 min，然后加入10%三氯乙酸1.5 mL，混勻后3000 r/min離心10 min。精確移取上層清液2.0 mL，加入蒸餾水2.0 mL和0.1%三氯化鐵0.5 mL，混勻后放置10min，于700 nm處測定吸光度值A(chǔ)，吸光度值越大表明還原力越強(qiáng)^[15]。

4 結(jié)果與分析

4.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果：為了得到具有最佳抗氧化活性的堿性蛋白酶水解物，本實(shí)驗(yàn)以DPPH清除率為指標(biāo)，進(jìn)行4因素3水平L9（3）4的正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。

由表1可知，影響堿性蛋白酶水解物抗氧化活性的各因素排列順序?yàn)镈>A>C>B，即pH值影響最大，水解時間影響最??；堿性蛋白酶水解物抗氧化性最強(qiáng)的水解條件為A3B1C3D1。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇的溫度為50℃、時間4h、加酶量2000 u/g、pH9作為最佳水解條件。

4.2水解物對DPPH自由基的清除率：將最佳水解條件下得到的水解物冷凍干燥，檢測樣品濃度為1mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL時堿性蛋白酶水解物對DPPH自由基的清除率。結(jié)果見圖1所示，堿性蛋白酶水解物對DPPH自由基的清除率隨著濃度的升高而增大，當(dāng)濃度為5mg/mL

時，清除率達(dá)到91.24%。

4.3 水解物對羥自由基清除率：同樣設(shè)置5個濃度組，即2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL和10 mg/mL，分別檢測其對羥自由基的清除率。結(jié)果見圖2所示，不同濃度的堿性蛋白酶水解物對羥自由基均有一定程度的清除作用，并且隨著濃度升高，清除率增大，對羥自由基的清除率低于DPPH，當(dāng)濃度為10 mg/mL時，清除率為74.84%。

4.5 水解物的還原能力：同樣設(shè)置6個濃度組，即1 mg/mL、3 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL 、20 mg/mL，分別檢測其還原力。根據(jù)“3.5”還原力的測定方法，在700 nm處的吸光度越大，水解物的還原能力越強(qiáng)。結(jié)果見圖4所示，在所設(shè)置的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度增大，還原力增強(qiáng)，即呈現(xiàn)濃度依賴性。

〖XCG34.TIF〗

圖4 堿性蛋白酶水解物的還原力

5結(jié)論

本試驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)方法研究堿性蛋白酶對青蛤進(jìn)行水解時各因素及水平對抗氧化活性的影響。結(jié)果顯示，水解物抗氧化活性最大的影響因素為pH值，最小的影響因素為水解時間，且當(dāng)溫度為50℃、時間為4h、加酶量為2000 u/g、pH為9時，水解物的抗氧化活性最強(qiáng)。在最佳抗氧化水解條件下得到的水解水解物，對羥自由基、DPPH自由基、Fe²⁺離子的螯合作用均有一定的清除活性，且該水解物對自由基的清除率和還原力均呈現(xiàn)濃度依賴性。本試驗(yàn)研究表明：堿性蛋白酶對青蛤水解得到的水解物具有較好的抗氧化活性。這為青蛤酶解物的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供科學(xué)的理論依據(jù)。

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