雙氫青蒿素聯(lián)合順鉑對(duì)荷瘤大鼠的免疫功能的影響

裴曄 李娟 史小榮

摘要：

目的：研究不同劑量的雙氫青蒿素聯(lián)合順鉑對(duì)荷瘤大鼠的免疫抑制作用的影響。方法：1.將低分化上皮性卵巢癌細(xì)胞株NUTU-19注入F344大鼠的右腋皮下，建立人卵巢癌移植瘤的動(dòng)物模型。2.將建模成功的40只F344大鼠分隨機(jī)為5組，即順鉑對(duì)照組、空白對(duì)照組、順鉑+雙氫青蒿素高劑量組、順鉑+雙氫青蒿素中劑量組、順鉑+雙氫青蒿素低劑量組。觀察干預(yù)后各組移植瘤抑瘤率，取出瘤體，進(jìn)行腫瘤形態(tài)學(xué)觀察，顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)。無(wú)菌取脾，測(cè)T/B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的測(cè)定，用ELISA方法檢測(cè)大鼠血清IL-2及IFN-γ變化情況。結(jié)果：1.順鉑+雙氫青蒿素各組抑瘤率與順鉑組相比升高顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。2.移植瘤組織病理學(xué)監(jiān)測(cè)：瘤細(xì)胞的體積較大，胞質(zhì)疏松，核深染，有不同程度的核固縮、核碎裂及核溶解，細(xì)胞中可見(jiàn)局灶性壞死。3.順鉑+雙氫青蒿素高劑量組大鼠T/B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、血清IL-2及IFN-γ明顯高于順鉑組（P0.001）。結(jié)論：（1）DHA聯(lián)合順鉑對(duì)荷瘤大鼠卵巢癌皮下移植瘤的生長(zhǎng)有抑制作用，其聯(lián)合作用功效強(qiáng)于單用順鉑，增強(qiáng)了順鉑的敏感性。（2）DHA聯(lián)合順鉑對(duì)荷瘤大鼠機(jī)體免疫功能有增強(qiáng)作用，通過(guò)提高荷瘤大鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能及血清IL-2和IFN-γ的水平，可能降低患者卵巢癌復(fù)發(fā)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞：雙氫青蒿素；卵巢癌；大鼠；順鉑；淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率；IL-2 IFN-γ

【中圖分類號(hào)】

R711.75 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】1002-3763（2014）05-0004-02

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，因其早期診斷困難，且死亡率居?jì)D科惡性腫瘤首位，成為直接威脅著婦女生命健康的疾病之一。雖然經(jīng)典的卵巢癌細(xì)胞減滅術(shù)和化療水平不斷改進(jìn)，但晚期卵巢癌五年存活率仍未明顯升高。隨著免疫生物學(xué)、分子生物學(xué)和腫瘤免疫學(xué)的深入研究，為腫瘤的免疫治療提供了新的思路。本實(shí)驗(yàn)旨在研究青蒿素及其衍生物抗腫瘤作用，嘗試將順鉑與其聯(lián)合使用，探討使用青蒿素后荷瘤大鼠免疫狀態(tài)的改變，試圖尋找青蒿素降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，改變其轉(zhuǎn)歸的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料：

低分化上皮性卵巢癌細(xì)胞株NUTU-19，購(gòu)自上海橋杜商貿(mào)有限公司細(xì)胞中心；F344大鼠40只， 8-9周齡，雌性，體重140～150g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)寄生蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)細(xì)胞操作過(guò)程 將卵巢癌細(xì)胞株NUTU-19，復(fù)蘇后移至培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)基，放于培養(yǎng)箱中（37℃，5%CO2），在細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.2 動(dòng)物模型建立 建立F344大鼠卵巢癌動(dòng)物模型，共40只。調(diào)整卵巢癌細(xì)胞株NUTU-19細(xì)胞懸液濃度為4x107/ml，于每只大鼠右腋皮下注射0.2ml細(xì)胞懸液，觀察移植瘤生長(zhǎng)情況。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法

接種后第10天每只大鼠右腋長(zhǎng)有約0.4*0.4cm腫瘤，將荷瘤大鼠隨機(jī)分為5組，每組8只。各組大鼠同時(shí)治療，如下：

（1）空白對(duì)照組：每只腹腔注射生理鹽水2ml，隔天一次。

（2）順鉑組：每只腹腔注射順鉑3mg/kg，隔天一次。

（3）DHA高劑量+順鉑組：DHA400mg/kg +順鉑3mg/kg腹腔注射，隔天一次。

（4）DHA中劑量+順鉑組：DHA300mg/kg +順鉑3mg/kg腹腔注射，隔天一次。

（5）DHA低劑量+順鉑組：DHA200mg/kg +順鉑3mg/kg腹腔注射，隔天一次。

1.2.4 測(cè)定抑瘤率：給藥5次后禁食，第二天乙醚麻醉處死大鼠，迅速摘取瘤體，稱重并記錄。抑瘤率（%）=（空白荷瘤組平均瘤重-各實(shí)驗(yàn)組平均瘤重）/空白荷瘤組平均瘤重×100%2.5脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的測(cè)定 乙醚麻醉處死大鼠，無(wú)菌取大鼠脾臟，剪碎、研磨，200目篩過(guò)濾，制備為單個(gè)細(xì)胞懸液，加入10ml的NH4Cl于37℃水浴10分鐘裂解紅細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml，制成脾淋巴細(xì)胞懸液。用MTT法測(cè)定脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（OD）值，以SI（刺激指數(shù)）值高低反映脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的高低，SI計(jì)算公式：SI=PHA刺激孔OD平均值/細(xì)胞對(duì)照孔OD平均值。

1.2.6 檢測(cè)大鼠血清IL-2和IFN-γ的濃度 按照上述ELisa試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法： 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)X±s表示，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSSl3.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，行單因素方差分析及組問(wèn)比較最小顯著差（1east significant difference，LSD）法。以=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 順鉑+雙氫青蒿素對(duì)大鼠腫瘤生長(zhǎng)的作用：

順鉑+雙氫青蒿素高劑量組、中劑量組和低計(jì)量組對(duì)卵巢腫瘤抑制率分別為30.26%、47.32%及62.13%，順鉑組抑瘤率28.14%，順鉑+雙氫青蒿素各組、順鉑組與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。順鉑+雙氫青蒿素各組抑瘤率與順鉑組相比，高劑量雙氫青蒿素組抑瘤率最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

2.2 移植瘤組織病理學(xué)檢測(cè)：

接種10天后，每只大鼠右側(cè)腋下接種處均長(zhǎng)出一瘤結(jié)節(jié)，大小約0.4*0.4cm。呈球形，質(zhì)硬，活動(dòng)尚可，表明皮膚血管豐富。各組干預(yù)后處死大鼠取瘤體制片，鏡下觀察：瘤細(xì)胞的體積較大，胞質(zhì)疏松，核深染，有不同程度的核固縮、核碎裂及核溶解，細(xì)胞中可見(jiàn)局灶性壞死。

2.3 雙氫青蒿素對(duì)大鼠的免疫功能的影響：

2.3.1 實(shí)驗(yàn)各組大鼠T/B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的變化： 實(shí)驗(yàn)各組大鼠T/B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率見(jiàn)表1。同空白組比較，順鉑+雙氫青蒿素高劑量組、中劑量組和低劑量組大鼠T/B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。順鉑+雙氫青蒿素高劑量組大鼠T/B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率明顯高于順鉑組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.001）。如表-1。

3.2 各組大鼠血清IL-2及IFN-γ水平變化。同空白對(duì)照組相比，順鉑治療組大鼠血清IL-2及IFN-γ水平均有所下降（P<0.001）。順鉑+青蒿素中劑量組和低劑量組血清IL-2及IFN-γ水平與順鉑組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；順鉑+青蒿素高劑量組與順鉑組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。如表-2、表-3。

3 討論

卵巢癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，威脅婦女的生命健康，近年來(lái)雖然在治療方面有了一定的進(jìn)展，但是耐藥性的出現(xiàn)，

腫瘤的短期復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移使得患者五年存活率仍舊沒(méi)有明顯改善，故尋找新的抗腫瘤治療途徑成為現(xiàn)今的研究熱點(diǎn)。

3.1 雙氫青蒿素抗腫瘤的作用：

在不斷研制新藥的同時(shí)，老藥新用也是研究抗腫瘤藥物的一個(gè)途徑。1991年，我國(guó)學(xué)者鄧有安等^[1]首次報(bào)道了青蒿素衍生物能有選擇性殺傷活白血病P388細(xì)胞。隨后孫瑋辰等^[2]研究人員發(fā)現(xiàn)青蒿素能殺傷具有增生分裂能力的腫瘤干細(xì)胞。美國(guó)華盛頓大學(xué)的Lai研究員^[3]及Singh副研究員^[4]也先后研究發(fā)現(xiàn)，加入全轉(zhuǎn)鐵蛋白，DHA對(duì)培養(yǎng)的人白血病淋巴細(xì)胞的具有很強(qiáng)殺傷作用，而比對(duì)正常人淋巴細(xì)胞的不敏感。此后的研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素對(duì)肝癌、胃癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌等多種腫瘤均具有抗癌活性，且作用廣泛。青蒿素還可以通過(guò)抑制腫瘤新生血管形成、與Fe²⁺作用的細(xì)胞毒作用、抑制端粒酶活性以及損傷細(xì)胞線粒體等多種作用機(jī)制而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用^[6-10]。經(jīng)病理組織觀察發(fā)現(xiàn)，青蒿素各干預(yù)組卵巢腫瘤細(xì)胞凋亡、壞死程度明顯升高，從而發(fā)揮了其抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，增加了順鉑化療的敏感性。

2 雙氫青蒿素對(duì)卵巢惡性腫瘤的免疫調(diào)節(jié)作用

2.1 雙氫青蒿素對(duì)免疫細(xì)胞的影響：

免疫細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和輔助細(xì)胞兩大類。研究表明DHA能抑制B淋巴細(xì)胞分裂增殖，促進(jìn)CD4T細(xì)胞和CD8T細(xì)胞的分裂增殖；并且減少B細(xì)胞分泌抗體，減輕體液免疫反應(yīng)，免疫復(fù)合物生成減少^[16]；青蒿素等通過(guò)活化Ts細(xì)胞，抑制體液免疫，Ts細(xì)胞增多會(huì)進(jìn)一步降低抗體水平^[12-15]。本實(shí)驗(yàn)中高劑量組青蒿素聯(lián)合順鉑治療卵巢癌荷瘤大鼠后其體內(nèi)T/B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率明顯上升，表明青蒿素可能通過(guò)增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng)從而增強(qiáng)其抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。

2.2 雙氫青蒿素對(duì)免疫因子的影響：

免疫細(xì)胞及其分泌的免疫因子在腫瘤的發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用?；罨馨图?xì)胞及巨噬細(xì)胞分泌的許多細(xì)胞因子，如TNF-γ等，因其能專一殺傷腫瘤細(xì)胞而無(wú)礙于正常細(xì)胞而日趨受到人們的重視。譚先杰等^[17]的研究結(jié)論為DHA能制卵巢癌細(xì)胞的體外增殖，該作用可能與其下調(diào)癌細(xì)胞內(nèi)ERK 1/2的磷酸化水平有關(guān)。董妍君等人^[18-19]還進(jìn)一步深入探討了DHA治療LA的免疫分子機(jī)理，主要是通過(guò)調(diào)節(jié)免疫活性物質(zhì)產(chǎn)生起作用，包括IL-1、6，腫瘤壞死因子等免疫因子的表達(dá)。IL-2是新近發(fā)現(xiàn)的具有潛在抗腫瘤作用的免疫調(diào)節(jié)性因子，是由輔助性T細(xì)胞產(chǎn)生的，具有促進(jìn)T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)Lak細(xì)胞促進(jìn)B細(xì)胞分泌抗體，促進(jìn)T細(xì)胞殺傷作用以及增強(qiáng)NK細(xì)胞活性等作用^[20]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中IL-2、IFN-γ在青蒿素高劑量聯(lián)合順鉑組明顯高于其他各組，根據(jù)結(jié)果推斷青蒿素聯(lián)合順鉑治療卵巢癌不僅抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，而且通過(guò)改變機(jī)體免疫狀態(tài)，增加細(xì)胞因子水平對(duì)，從而對(duì)其預(yù)后進(jìn)行了改善，降低了患者復(fù)發(fā)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為我們今后卵巢癌提供了嶄新的治療途徑，為腫瘤免疫治療提供了理論基礎(chǔ)。

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