肺炎嗜衣原體MOMP基因的克隆與原核表達(dá)

張存亮，聶福平，王昱，楊俊，李應(yīng)國，蔡家利

(1.重慶理工大學(xué)，重慶 400060;2.重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，重慶 400020;3.重慶大學(xué)，重慶 400030)

肺炎嗜衣原體MOMP基因的克隆與原核表達(dá)

張存亮1，2，聶福平2，3，王昱2，3，楊俊2，李應(yīng)國1，蔡家利2

(1.重慶理工大學(xué)，重慶 400060;2.重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，重慶 400020;3.重慶大學(xué)，重慶 400030)

克隆了肺炎嗜衣原體外膜主蛋白(major out membrane protein，MOMP)基因，并進(jìn)行了原核表達(dá)。根據(jù)GenBank公布的肺炎嗜衣原體MOMP基因序列，設(shè)計克隆引物后用普通PCR方法擴(kuò)增出肺炎嗜衣原體MOMP基因的完整片段，將其克隆到pMD－19T后進(jìn)行測序，經(jīng)序列比對正確后將此片段亞克隆到表達(dá)載體pET－32a(+)中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，再采用SDS－PAGE和Western－Blot檢測重組蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明:本研究克隆了肺炎嗜衣原體MOMP基因并在原核系統(tǒng)中成功表達(dá)了MOMP重組蛋白，且Western－Blot顯示該重組蛋白具有免疫學(xué)活性。

肺炎嗜衣原體;MOMP基因;克隆;原核表達(dá)

肺炎嗜衣原體(chlamydophila pneumoniae，Cpn)是衣原體科下嗜衣原體屬的一種嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生致病微生物，可引起人的非典型性肺炎、支氣管炎、咽喉炎等呼吸系統(tǒng)疾病。另外，有研究表明，肺炎嗜衣原體感染與心血管疾病相關(guān)，例如冠心病、擴(kuò)張型心肌病等。尤其是它在動脈粥樣硬化形成過程中的作用受到了國內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注［1］。目前，肺炎嗜衣原體已被列為對中國人衛(wèi)生健康有重大影響的十二種病原微生物之一。

MOMP是肺炎嗜衣原體外膜蛋白的主要成分，占外膜蛋白總量的60%以上。通過對外膜主蛋白的研究，發(fā)現(xiàn)其不僅在肺炎嗜衣原體黏附宿主細(xì)胞的過程中起重要作用，而且本身也是一種重要的抗原，能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答［2］。

本研究通過對肺炎嗜衣原體MOMP基因進(jìn)行克隆，構(gòu)建了原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中高效表達(dá)，然后對重組蛋白進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 載體及菌株

肺炎嗜衣原體菌株AR－39，購自美國菌種保藏中心;克隆載體pMD－19T，購自寶生物工程(大連)有限公司;原核表達(dá)載體pET－32a(+)、大腸桿菌Rosetta(DE3)，均購自默克密理博;大腸桿菌DH5α，購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 主要試劑

Ex Taq酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶SalⅠ、NotⅠ，均購自寶生物工程(大連)有限公司;膠回收試劑盒(50)、質(zhì)粒提取試劑盒(100)為OMEGA產(chǎn)品;Western－Blot實驗所用二抗、HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG、辣根過氧化氫酶DAB顯色試劑盒，購自生工生物工程(上海)有限公司;聚偏二氟乙烯(PVDF)膜為Roche公司產(chǎn)品。

1.3 引物的設(shè)計與合成

將GenBank中登記的肺炎嗜衣原體基因全序列及其MOMP基因序列下載并通過軟件MEGA5.1進(jìn)行比對，設(shè)計合成了1對克隆引物和1對表達(dá)引物。

克隆上引物:5’－GTCGCCAAAATATGAGTAATAGCG－3’;克隆下引物:5’－ACAAGGTGAGGAGAAATTCTAAGC－3’。表達(dá)上引物:5’－ACGCGTCGACTTATGAAAAAACTCTTAAAG－3’(下劃線為引入的SalⅠ酶切位點);表達(dá)下引物:5’－ATTT GCGGCCGCGAATCTGAACTGACCAGA－3’(下劃線為引入的NotⅠ酶切位點)。以上引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.4 MOMP基因的PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:反應(yīng)總體積是25 μL。其組成包括:10×Ex Taq Buffer(Mg Free)2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 2 μL，25 mmol/L MgCl22μL，上下游克隆引物各0.5 μL，Taq聚合酶(5 U/ μL)0.125 μL，超純水14.875 μL，模板2.5 μL。

反應(yīng)條件:94.0℃預(yù)變性3 min;而后35個循環(huán)，循環(huán)程序為:94.0℃變性30 s，53℃退火30 s，72.0℃延伸1 min;72.0℃再延伸5 min;18℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳鑒定，然后使用膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

1.5 基因的克隆與鑒定

將PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD－19T連接，按照常規(guī)方法［3］連接后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過氨芐青霉素抗性進(jìn)行篩選和PCR擴(kuò)增進(jìn)行鑒定;所得陽性克隆送寶生物工程(大連)有限公司測序，將獲得的陽性重組質(zhì)粒命名為pMD－19TMOMP。測序結(jié)果通過一系列軟件比對，得到正確的肺炎嗜衣原體菌株AR－39的MOMP基因序列，并上傳至美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)，得到的序列號為GenBank KC512913，以方便后續(xù)實驗及文章引援。

1.6 表達(dá)載體的構(gòu)建

使用上下游表達(dá)引物，參照1.4節(jié)的PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件對pMD－19T－MOMP進(jìn)行擴(kuò)增，得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用膠回收試劑盒進(jìn)行回收。對回收的pMD－19T－MOMP和pET－32a(+)載體質(zhì)粒分別進(jìn)行SalⅠ和NotⅠ雙酶切，膠回收后用T4 DNA連接酶4℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。提取陽性質(zhì)粒經(jīng)PCR和雙酶切鑒定正確后，將重組質(zhì)粒命名為pET－32a－MOMP。再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosseta(DE3)中，提取質(zhì)粒鑒定后，送寶生物工程(大連)有限公司測序。

1.7 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將含重組質(zhì)粒pET－32a－MOMP的Rosseta (DE3)接種于含氨芐青霉素抗性的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，放在37℃、130 r/min搖床振蕩過夜。取過夜培養(yǎng)物以體積比1∶100接種到新鮮的含氨芐青霉素抗性的營養(yǎng)肉湯中，搖菌至OD600值為0.6～0.8時，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.2 mmol/ L，收集細(xì)菌。4℃、12 000 r/min離心5 min，進(jìn)行SDS－PAGE分析。

1.8 重組蛋白的可溶性分析及Western-Blot鑒定

按照超聲破碎法對菌體進(jìn)行超聲破碎，離心后分別取上清和沉淀制樣并進(jìn)行SDS－PAGE分析。Western－Blot鑒定:將上述重組蛋白純化后制蛋白樣進(jìn)行SDS－PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上進(jìn)行Western－Blot實驗。一抗是小鼠的陽性血清，稀釋倍數(shù)是1∶1 000;二抗是辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，稀釋倍數(shù)是1∶2 500。最后，按照辣根過氧化氫酶DAB顯色試劑盒操作說明書進(jìn)行顯色及終止反應(yīng)。

2 實驗結(jié)果

2.1 目的基因PCR擴(kuò)增

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，擴(kuò)增出1條約1 200 bp的特異性條帶(見圖1)，與預(yù)期的目的片段大小基本一致。

圖1 MOMP基因的PCR擴(kuò)增

2.2 重組質(zhì)粒pMD-19T-MOMP的鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行凝膠鑒定，結(jié)果得到1條約1 200 bp的條帶(見圖2)，與預(yù)期的片段長度一致。將陽性質(zhì)粒送寶生物公司測序。此序列通過軟件處理后刪除克隆載體序列，得到MOMP基因序列。在美國國立生物技術(shù)信息中心中比對，結(jié)果一致率為99%。

圖2 重組質(zhì)粒pMD－19T－MOMP的PCR鑒定

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-MOMP的PCR和雙酶切鑒定

重組表達(dá)質(zhì)粒pET－32a－MOMP經(jīng)表達(dá)引物的PCR擴(kuò)增得到1條約1 200 bp條帶，與預(yù)計結(jié)果相符;pET－32a－MOMP經(jīng)T7引物的PCR擴(kuò)增得到1條約2 000 bp條帶，與預(yù)計結(jié)果相符;pET－32a－MOMP經(jīng)SalⅠ和NotⅠ雙酶切，得到兩條帶，一條約5 900 bp，另一條約1 200 bp，與預(yù)計結(jié)果相符。

圖3 重組質(zhì)粒pET－32a－MOMP的雙酶切和PCR鑒定

2.4 SDS-PAGE分析

重組質(zhì)粒pET－32a－MOMP經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在大腸桿菌Rosetta(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)蛋白的分子質(zhì)量約56 kDa，與預(yù)期的相對分子質(zhì)量相符(見圖4)。

圖4 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)

2.5 可溶性分析

重組質(zhì)粒pET－32a－MOMP經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，用超聲破碎法將菌液破碎。經(jīng)分析，該重組蛋白多以包涵體的形式存在。

2.6 蛋白質(zhì)印跡實驗(Western-Blot)鑒定

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白按常規(guī)方法純化后經(jīng)SDS－PAGE分析，用半干法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉后，依次加入已稀釋的一抗和二抗進(jìn)行孵育，最后使用顯色試劑盒進(jìn)行顯色。結(jié)果顯示(見圖5):在56 kDa處有1條蛋白印跡帶，表明該重組蛋白具有免疫學(xué)活性。

圖5 表達(dá)產(chǎn)物的Western－Blot分析

3 討論

肺炎嗜衣原體中編碼MOMP的基因開放閱讀框有1 167 bp，MOMP由366個氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量約40 kDa，MOMP包含4個可變區(qū)和5個保守區(qū)［4］。MOMP具有高度的保守性，不同菌株MOMP的基因序列是一致的，說明肺炎嗜衣原體可能只有一種基因型。該實驗克隆的MOMP基因全序列通過與GenBank公布的肺炎嗜衣原體MOMP基因序列比對，顯示結(jié)果一致率為99%。

肺炎嗜衣原體中的MOMP蛋白可刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的保護(hù)性免疫，是機(jī)體體液免疫反應(yīng)的主要目標(biāo)，因其含有血清特異性中和抗體決定簇，故在引起免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。肺炎嗜衣原體的MOMP是感染過程中引起機(jī)體免疫應(yīng)答的重要免疫原，成為Cpn檢測試劑的主要候選抗原之一。

4 結(jié)論

本文通過分子生物學(xué)方法成功克隆了肺炎嗜衣原體MOMP全長基因，并成功原核表達(dá)了MOMP重組蛋白。該重組蛋白經(jīng)蛋白質(zhì)印跡實驗鑒定具有免疫學(xué)活性，可作為抗原免疫小鼠，制備單克隆抗體，為進(jìn)一步研究肺炎嗜衣原體ELISA檢測試劑盒的組裝提供參考。

［1］Ramirez J A.Isolation of Chlamydia pneumoniae from the coronary artery of a patient with coronary atherosclerosis［J］.Ann Intern Med，1996，125，979－982.

［2］Wolf K，F(xiàn)ischer E，Mead D，et al.Chlamydia pneumoniae major outer membrane protein is a surface－exposed antigen that elicits antibodies primarily directed against conformation－dependent determinants［J］.Infect Immun，2001，69，3082－3091.

［3］薩姆布魯克J，拉塞爾D W.分子克隆試驗指南［M］.黃培堂，等，譯.北京:科學(xué)出版社，2002.

［4］Baghian A，Shaffer L，Store J，et al.Antibody response to epitopes of chlamydial major out membrane proteins on infectious elementary bodies and of the reduced polyacrylamide gel electrophoresis separated form［J］.Infect Immun，1990，58(5):1379－1383.

(責(zé)任編輯 何杰玲)

Cloning and Prokaryotic Expression of the MOMP Gene of Chlamydophila Pneumoniae

ZHANG Cun－liang1，2，NIE Fu－ping2，3，WANG Yu2，3，
YANG Jun2，LI Ying－guo1，CAI Jia－li2
(1.Chongqing University of Technology，Chongqing 400060，China;
2.Chongqing CIQ，Chongqing 400020，China;
3.Chongqing University，Chongqing 400030，China)

The MOMP complete gene of chlamydophila pneumoniae was cloned and expressed in prokaryotic expression system.The MOMP complete gene of Chlamydophila pneumoniae was amplified by normal PCR with designed cloning primers based on the reported in GenBank.The amplified MOMP complete gene was inserted into the cloning vector pMD19－T and then was sequenced.The correct MOMP gene was sub－cloned into expressed vector pET－32a(+)for prokaryotic expression in Rosetta (DE3)induced by IPTG.The MOMP gene was cloned and was submitted to NCBI.The recombinant proteins were expressed successfully in prokaryotic expression system.Western－Blot showed that the recombinant protein has antigenicity.

chlamydophila pneumoniae;MOMP gene;clone;prokaryotic expression

Q31

A

1674－8425(2014)04－0068－04

10.3969/j.issn.1674－8425(z).2014.04.015

2013－10－21

國家質(zhì)檢總局科技項目(2010IK030)

張存亮(1982—)，男，重慶墊江人，碩士研究生，主要從事疫苗及診斷技術(shù)研究。

張存亮，聶福平，王昱，等.肺炎嗜衣原體MOMP基因的克隆與原核表達(dá)［J］.重慶理工大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2014(4):68－71.

format:ZHANG Cun－liang，NIE Fu－ping，WANG Yu，et al.Cloning and Prokaryotic Expression of the MOMP Gene of Chlamydophila Pneumoniae［J］.Journal of Chongqing University of Technology:Natural Science，2014 (4):68－71.