烏司他丁對(duì)肝大部切除合并缺血再灌注損傷后 肝再生和能量代謝的影響

譚 敬，朱宇麟，周榮勝，張曉琪，趙 鴿，劉齊寧

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，陜西西安 710061)

肝大部切除術(shù)中常使用肝門阻斷法減少術(shù)中出血，常不可避免地造成肝缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)。IRI不但造成肝細(xì)胞死亡，也會(huì)使肝再生能力受損[1]。肝再生的調(diào)控是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，不但有眾多細(xì)胞因子參與，而且DNA合成、細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化、有絲分裂都是能量消耗過程因此維持穩(wěn)定的能量代謝是維持肝再生的重要方面。烏司他丁(Ulinastatin, UTI)，一種尿胰蛋白酶抑制劑，具有抑制多種酶(胰蛋白酶、磷脂酶A2、透明質(zhì)酸酶、彈性蛋白酶等)的活性，在治療胰腺炎、抗腫瘤、抗休克和肝臟切除圍手術(shù)期等方面已經(jīng)引起了廣泛的重視。以往研究證實(shí)UTI對(duì)肝IRI具有良好的保護(hù)作用[2]。我們也發(fā)現(xiàn)UTI對(duì)肝IRI后的肝再生有保護(hù)作用[3]。但是，UTI對(duì)肝再生影響的機(jī)制尚未完全清楚。本研究擬在建立大鼠70%肝大部切除合并IRI模型的基礎(chǔ)上，觀察UTI對(duì)肝再生過程中能量代謝的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康清潔級(jí)雄性SD大鼠120只，3月齡，體質(zhì)量230～280 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2試劑及儀器烏司他丁由廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司提供(批號(hào)03091123)；AnnexinV/FITC細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自珠海健康元生物醫(yī)藥有限公司；兔抗鼠細(xì)胞核增殖抗原(PCNA)抗體試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；ATP、ADP、AMP標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自日本Olympus公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司；高壓液相色譜儀購(gòu)自美國(guó)HP公司。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物分組和模型制備 120只大鼠隨機(jī)分為三組，分別為單純肝切除組(PH)、肝切除合并缺血再灌注組(PHIR) 和烏司他丁組(UTI)，每組40只。大鼠術(shù)前禁食8 h，不禁飲。100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3 mL/100 g)，經(jīng)陰莖背靜脈注入稀釋肝素(500 U/kg)，使其肝素化。仰臥位固定四肢，燈照保暖，常規(guī)剔毛消毒，取劍突下腹正中縱行切口約3 cm，依次切開腹壁各層進(jìn)入腹腔，顯露肝十二指腸韌帶，以3-0絲線結(jié)扎肝左、中葉根部，行左、中葉肝臟切除術(shù)，約占70%肝總體積。保留肝(肝右、尾葉)作不同處理：PH組不阻斷保留肝葉血流；PHIR組在切除肝左、中葉的同時(shí)用小號(hào)無損傷動(dòng)脈夾阻斷肝右、尾葉的血流30 min，后恢復(fù)其血流；UTI組與PHIR組肝臟切除及保留肝斷流處理相同，但于缺血前5 min經(jīng)尾靜脈給予UTI 50 000 U/kg。術(shù)后皮下注射含青霉素的生理鹽水2 mL(80 000 U/mL)預(yù)防感染。各組分別于再灌注后1、6、12、24和48 h采集下腔靜脈血4 mL和肝右葉相同部位肝組織約3 g進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)，每時(shí)點(diǎn)8只大鼠。

1.3.2檢測(cè)指標(biāo) ①丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase, ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)：將各時(shí)點(diǎn)采集的大鼠下腔靜脈血，以半徑20 cm、4 000 r/min(35 000 g)離心10 min，分離上層血清，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT和AST活性。②肝細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptosis index, AI)：取儲(chǔ)存肝組織1.0 g，解凍后制備肝細(xì)胞懸液，經(jīng)消化、計(jì)數(shù)，取(3～5)×105個(gè)細(xì)胞置于流式管中，PBS液洗滌離心2次。加入稀釋的結(jié)合緩沖液100 μL，吹打混勻后加入5 μL的AnnexinV/FITC和10 μL的碘化丙啶(PI)，室溫下避光反應(yīng)15 min。再加入400 μL PBS吹打混勻后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡指數(shù)。③殘肝再生度：按SHERGILL等[4]提供的方法略加修改計(jì)算肝再生度。大鼠肝臟左、中葉切除后立即稱重(B)，用以計(jì)算大鼠初始肝重(A=B/0.7)，即切除肝重為初始肝重的70%。預(yù)定時(shí)點(diǎn)處死大鼠后，切下全部保留肝組織并稱重(C)。肝再生度計(jì)算公式為：肝再生度=[(C-0.3×A)/A]×100%。④殘肝組織PCNA：采用免疫組化法測(cè)定再灌注后24和48 h兩時(shí)點(diǎn)肝組織PCNA，按PCNA免疫組化試劑盒提供的方法制備肝細(xì)胞切片和PCNA染色，以胞核呈現(xiàn)界限清楚的棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。每只大鼠取5張切片，光鏡下每張切片隨機(jī)挑選10個(gè)200倍視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中100個(gè)肝細(xì)胞中含有的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算各組平均PCNA陽(yáng)性百分率。⑤肝組織ATP、ADP和AMP的含量和能量負(fù)荷：采用高壓液相色譜法測(cè)定ATP、ADP和AMP的含量，將ATP、ADP和AMP標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成外標(biāo)母液備用。取術(shù)后24、48 h大鼠肝組織1 g，液氮研磨后加20倍體積0.4 moL/L的HClO4制取勻漿，4 ℃、4 000 r/min離心5 min，取上清。再用2.5 moL/L的K2CO3調(diào)pH至中性，4 ℃、4 000 r/min離心5 min，取上清檢測(cè)ATP、ADP和AMP的濃度。色譜條件為ODS柱(250×4.6 id 5 μm)，流動(dòng)相為0.05 moL/L磷酸鹽緩沖液與甲醇，室溫條件下流速1.0 mL/min，UV 254 nm，ATT-3，吸收率0.02，紙速0.5 cm/min，進(jìn)樣量10 μL。組織能量負(fù)荷公式為([ATP]+0.5[ADP])/([ATP]+[ADP]+[AMP])[5]。

1.3.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若組間方差齊，則組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，并行藥物處理和時(shí)間交互作用檢驗(yàn)；若組間方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1UTI抑制了IRI后血清ALT、AST活性升高PH組ALT、AST活性于再灌注早期逐漸升高，12 h達(dá)高峰，隨后逐漸下降。與PH組比較，PHIR組各時(shí)點(diǎn)ALT、AST活性升高更加明顯(P<0.05)。UTI組各時(shí)點(diǎn)ALT、AST活性較PHIR組有所降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。不同處理與時(shí)間交互作用的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1各組不同時(shí)點(diǎn)血清ALT、AST活性的比較

Tab.1 Serum ALT and AST activities in each group at different time points after reperfusion

n=8)

與PH組比較，*P<0.05；與PHIR組比較，#P<0.05。

2.2UTI減輕了IRI引起的肝細(xì)胞凋亡PHIR和UTI組再灌注后AI逐漸升高，12 h達(dá)峰值，隨后下降。與PH組相比，PHIR組AI于6 h到48 h明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與PHIR組相比，UTI組AI于再灌注6 h到24 h明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。不同處理與時(shí)間交互作用的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3UTI減輕了IRI對(duì)肝再生的抑制與PH組比較，PHIR組術(shù)后24、48 h肝再生度降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，UTI組肝再生度雖然下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與PHIR組比較，UTI組術(shù)后24、48 h肝再生度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。與PH組比較，PHIR組術(shù)后24、48 h PCNA表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，UTI組PCNA雖然下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與PHIR組比較，UTI組術(shù)后24、48 h PCNA表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3、圖1)。

表2各組不同時(shí)點(diǎn)殘肝組織細(xì)胞凋亡指數(shù)(%)的比較

Tab.2 Apoptosis index of the regenerated liverin each group at different time points

n=8)

與PH組比較，*P<0.05；與PHIR組比較，#P<0.05。

表3各組24、48h肝再生度和PCNA陽(yáng)性率的比較

Tab.3 Regenerated liver weight and PCNA positivity rate in each group at 24h and 48h after reperfusion

n=8)

與PH組比較，*P<0.05 ；與PHIR組比較，#P<0.05。

2.4UTI改善了IRI后的肝組織代謝與PH組相比，PHIR和UTI組再灌注24、48 h的ATP含量都明顯下降(P<0.05)，但UTI組ATP含量較PHIR組明顯升高(P<0.05)。PHIR組和UTI組48 h ADP和AMP含量都明顯高于PH組(P<0.05)。UTI組的能量負(fù)荷優(yōu)于PHIR組(P<0.05，表4)。

圖1三組術(shù)后24、48h肝組織PCNA的表達(dá)情況

Fig.1 The expression of PCNA in hepatic issues in the three groups at 24 h and 48 h after operation (PCNA, ×200)

A1、A2：PH組；B1、B2：PHIR組；C1、C2：UTI組。

表4各組24、48h肝組織ATP、ADP和AMP含量和能量負(fù)荷的比較

Tab.4 ATP, ADP and AMP contents and energy charge in hepatic tissues of each group at 24 h and 48 h after reperfusion

n=8)

與PH組比較，*P<0.05；與PHIR組比較，#P<0.05。

3 討 論

肝臟具有強(qiáng)大的再生功能，但當(dāng)伴有肝組織部分缺失時(shí)，IRI可引發(fā)肝再生能力下降,誘發(fā)術(shù)后肝功能衰竭[1,5]。本研究結(jié)果顯示PHIR組血清ALT和AST，肝細(xì)胞凋亡指數(shù)都明顯高于PH組，表明本研究中PHIR組出現(xiàn)明顯的肝功能損害，說明模型制備是成功的；而PHIR組殘肝組織的PCNA表達(dá)和肝再生度較PH組明顯降低，說明IRI確實(shí)抑制了肝大部切除術(shù)后殘肝再生功能，這與以往的研究結(jié)果相同[6]。

UTI是由143個(gè)氨基酸組成的酸性糖蛋白，含有由5個(gè)氨基酸連接的Kunitz型結(jié)構(gòu)域，能抑制α-糜蛋白酶、胰蛋白酶等多種蛋白酶。研究表明UTI能通過抑制中性粒細(xì)胞的活化和脫顆粒而減輕IRI[7]。本研究結(jié)果顯示UTI預(yù)處理后，UTI組的血清ALT和AST，肝細(xì)胞凋亡指數(shù)都明顯低于PHIR組，而再灌注后24h和48h的PCNA陽(yáng)性表達(dá)率和肝再生度明顯高于PHIR組，表明UTI不但能減輕肝大部切除術(shù)合并缺血再灌注的肝IRI，也能明顯緩解IRI對(duì)肝再生的抑制作用。

肝再生過程受眾多細(xì)胞因子的調(diào)控，我們發(fā)現(xiàn)UTI可能通過TNF-α/IL-6/STAT- 3信號(hào)通路調(diào)節(jié)肝再生[3]。而肝再生也是一個(gè)耗能過程，DNA合成、細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換和有絲分裂等過程都需要大量能量。ATP是細(xì)胞內(nèi)主要的能量物質(zhì)，細(xì)胞進(jìn)行DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂增殖必須依賴足夠數(shù)量的ATP。觀察表明肝切除后肝組織釋放ATP調(diào)節(jié)肝臟再生[8]。肝硬化的患者,部分肝切除后，肝細(xì)胞存在能量代謝失衡，ATP 水平顯著降低，導(dǎo)致肝再生狀態(tài)顯著地受到抑制,易誘發(fā)肝功能衰竭。線粒體是細(xì)胞內(nèi)生成ATP的主要場(chǎng)所，IRI會(huì)造成線粒體損傷，使線粒體產(chǎn)生ATP的能力發(fā)生障礙[9]。我們也發(fā)現(xiàn)IRI會(huì)促進(jìn)肝線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放，破壞正常的線粒體膜電位，而正常的線粒體膜電位是合成ATP的基礎(chǔ)[10]。UTI通過其膜穩(wěn)定作用，對(duì)肝IRI時(shí)的線粒體損傷具有保護(hù)作用[11]。TAIE等[12]發(fā)現(xiàn)UTI對(duì)腎IRI的保護(hù)作用與促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ATP和Na濃度恢復(fù)，維護(hù)細(xì)胞內(nèi)酸堿水平，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)有關(guān)。本研究證實(shí)UTI預(yù)處理后，再灌注24 h和48 h的肝組織ATP含量和能量負(fù)荷水平明顯高于PHIR組，表明UTI對(duì)肝再生的促進(jìn)作用與維持能量代謝，增高肝細(xì)胞內(nèi)ATP水平有關(guān)，其原因可能與UTI減輕了再灌注后線粒體損傷有關(guān)。

綜上所述，本研究提示UTI對(duì)肝大部切除合并IRI具有保護(hù)作用，UTI預(yù)處理能促進(jìn)殘肝再生，其機(jī)制與促進(jìn)肝組織的能量代謝，增加ATP水平有關(guān)。

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