一次性生物反應器懸浮培養(yǎng)HEK 293細胞生產Ad-IFNγ的工藝

吳全德，黃文林,2,3,4,5

1中國科學院微生物研究所，北京100101 2中山大學附屬腫瘤醫(yī)院，廣東廣州510010 3廣東省腫瘤靶向治療新藥研發(fā)企業(yè)重點實驗室，廣東廣州510663 4廣東省發(fā)展和改革委員會基因藥物工程實驗室，廣東廣州510663 5廣州達博生物制品有限公司，廣東廣州510663

一次性生物反應器懸浮培養(yǎng)HEK 293細胞生產Ad-IFNγ的工藝

吳全德1，黃文林1,2,3,4,5

1中國科學院微生物研究所，北京100101 2中山大學附屬腫瘤醫(yī)院，廣東廣州510010 3廣東省腫瘤靶向治療新藥研發(fā)企業(yè)重點實驗室，廣東廣州510663 4廣東省發(fā)展和改革委員會基因藥物工程實驗室，廣東廣州510663 5廣州達博生物制品有限公司，廣東廣州510663

腺病毒載體是極具發(fā)展前景的基因治療載體之一，為獲得一條新型腺病毒規(guī)?；a工藝，研究采用5 L振蕩激流式一次性生物反應器懸浮培養(yǎng)HEK293細胞來生產重組腺病毒載體。細胞經種子鏈逐步擴增后，接種至AP10生物反應器，采用CD293無血清培養(yǎng)基流加培養(yǎng)懸浮HEK293細胞，細胞密度達約2.0×106個/m L時，以30 MOI(Multiplicity of infection)感染重組Ad-IFNγ(Recombinant adenovirus-interferon gamma)，48 h后收獲細胞，3次凍融裂解離心收獲上清病毒粗產品。采用殼蛋白免疫法快速測定粗產品滴度。結果表明，采用振蕩激流式一次性生物反應器，流加HEK293細胞懸浮培養(yǎng)6 d，密度可達2.0×106個/m L，Ad-IFNγ粗產量達1.49×1013IFU(Infectious unit)，單細胞包裝量達3 800 IFU/cell。采用陰離子交換層析法純化重組腺病毒，回收率35.9%。建立了利用5 L激流式一次性生物反應器懸浮培養(yǎng)HEK293細胞生產重組腺病毒載體Ad-IFNγ的初步工藝。

重組腺病毒，HEK 293細胞懸浮培養(yǎng)，一次性生物反應器，分離純化，陰離子交換層析

腺病毒載體是極具發(fā)展?jié)摿Φ幕蛑委熭d體之一[1]，在全球已報道1 970例基因治療臨床試驗中占23.5%[2]。探索規(guī)?；?、高效和可重復的符合GMP標準的重組腺病毒生產工藝，是臨床試驗和商業(yè)生產的迫切需求[3-5]。HEK293是最常用的腺病毒包裝細胞系，傳統(tǒng)采用微載體、紙片載體、固定床等預裝載體于生物反應器內貼壁培養(yǎng)[3,6-7]，缺點是不易放大。懸浮馴化培養(yǎng)操作簡便，易于放大，使用無血清CD(Chem ical define)級培養(yǎng)基，避免動物來源成分所產生的潛在風險，利于下游純化工作的開展[8]。近年，一次性生物反應器(Single use bioreactor)或稱拋棄型生物反應器(Disposable bioreactor)逐漸應用于生物制藥[9-12]。一次性生物反應器因易操作，交叉污染風險低，并經過FDA認證，能有效縮短生產周期及降低生產成本等優(yōu)點而廣受歡迎[9]。

研究采用懸浮HEK293作為包裝細胞，在5 L振蕩激流式一次性生物反應器中培養(yǎng)生產Ad-IFNγ，并采用Q sepharose XL陰離子交換層析進行分離純化，初步建立了基于振蕩激流式一次性生物反應器的重組腺病毒生產工藝。

1 材料與方法

1.1 細胞和病毒

懸浮HEK 293細胞由中山大學附屬腫瘤醫(yī)院實驗研究部惠贈。Ad-IFNγ由廣州達博生物饋贈，按常規(guī)方法進行擴增保存。

1.2 培養(yǎng)基

CD 293干粉購自Gibco公司，細胞級純水由純水儀(M illipore,GER)制備；添加4 mmol/L谷氨酰胺(Sigma,USA)，調節(jié)pH 7.0，經0.22 μm過濾除菌。

1.3 細胞種子擴增

懸浮293細胞從液氮中取出快速復蘇，37℃，置于搖床培養(yǎng)，120 r/m in。經傳代逐步放大培養(yǎng)后，接種至5 L振蕩激流式一次性生物反應器(Am Protein current bioreactor 10,APCB10)，由杭州安普生物提供。

1.4 一次性生物反應器培養(yǎng)

反應器配套細胞培養(yǎng)袋、呼吸袋、取樣器均購自杭州安普生物。以密度3×105?6×105個/m L接種，溫度37℃，通CO2及0.5 mol/L NaOH調節(jié)pH 7.0?7.2，通過自動控制系統(tǒng)通入混合O2/N2/空氣控制DO 40%?50%，起始轉速55 r/m in，隨培養(yǎng)體積擴大提高至65 r/m in。

每24 h取樣，計算細胞密度及存活率，測定葡萄糖和乳酸濃度。細胞密度大于1×106個/m L開始流加培養(yǎng)，流加率0.6?1(前24 h培養(yǎng)體積的0.6?1倍)。經4?6 d，細胞密度達到2×106個/m L，按30 MOI感染Ad-IFNγ，48 h后收獲感染細胞。加入3倍體積細胞裂解液[Tris 50 mmol/L,M gCl22 mmol/L,NaCl 100 mmol/L,pH 8.0]重懸凍融裂解，離心得上清粗產品經純化并于–80℃保存。

1.5 陰離子交換層析純化

采用50 m LQ XL(GE Healthcare,USA)陰離子交換層析柱純化病毒。病毒粗產品經核酸酶(M erck，GER)處理1 h，經0.45 μm過濾澄清后上樣，450 mmol/L NaCl洗脫收獲病毒。

1.6 檢測方法

1.6.1 細胞計數(shù)及活力檢測

采用血球計數(shù)板點樣計算細胞密度，臺盼藍拒染法計算細胞活率，計數(shù)3次取平均值。

1.6.2 乳酸濃度及葡萄糖濃度測定

乳酸測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；葡萄糖測定試劑盒購自上海榮盛生物藥業(yè)公司；按說明書進行測定。

1.6.3 病毒感染滴度測定

采用殼蛋白免疫法進行感染滴度測定[13]。抗殼蛋白抗體、共軛辣根過氧化物酶二抗均由中山大學附屬腫瘤醫(yī)院實驗研究部饋贈。

1.6.4 純化病毒產品的純度檢測

產品純度采用紫外吸收法測A260/A280比值。

2 結果

2.1 懸浮HEK293細胞種子擴增

細胞復蘇體積15 mL，搖床轉速120 r/min。細胞密度達到1×106?1.5×106個/mL，開始傳代，傳代密度控制在5×105?7×105個/mL，保證了細胞穩(wěn)定性及倍增時間。建立了一條細胞種子擴增鏈，見表1。

表1 搖床培養(yǎng)種子擴增鏈Table 1Seed train process using shaking culture

圖1 反應器中細胞生長及葡萄糖、乳酸濃度曲線Fig.1Cell growth curve and concentration curve of glucose and lactate of the bioreactor.(A)Cell growth and viability curve of the first trial of inoculating with 5.0×105cells/mL.(B)Concentration control of glucose and lactate during the first trial.(C)Cell growth and viability curve of the second trial of inoculating with 3.0×105cells/mL.(D)Concentration control of glucose and lactate during the second trial.(E)Cell growth and viability curve of the third trial of inoculating with 6.5×105cells/mL.(F)Concentration control of glucose and lactate during the third trial.The black arrows in(C)(E)show that portions of cell culture were inoculated into other bioreactors(data not show)and then the rest were re-inoculated into APCB10.

2.25 L一次性生物反應器懸浮培養(yǎng)293細胞

分別以5.0×105、3.0×105、6.5×105個/mL接種至反應器，每24 h取樣，繪制生長曲線，如圖1A、1C、1E。箭頭處表示排出部分細胞作其他研究(結果未顯示)，留部分細胞重新接種。前48 h細胞生長緩慢，此后進入快速生長期。密度達1×106個/m L (約48?72 h)，流加培養(yǎng)，流加率為0.6?1/d，倍增時間約24 h。同時，圖1C、1E表明，重新接種細胞直接進入快速生長期。監(jiān)測葡萄糖和乳酸濃度，見圖1B、1D、1F，發(fā)現(xiàn)能量充足，乳酸低于20 mmol/L，反映細胞營養(yǎng)供給和代謝抑制因子均在可控水平[3]。細胞密度最終達到2×106個/m L時，加入Ad-IFNγ感染，48 hpi收獲感染細胞。

2.3 粗產品感染滴度測定

通過快速測定病毒感染滴度，見表2。結果表明，采用APCB10一次性生物反應器懸浮培養(yǎng)，得到了穩(wěn)定的Ad-IFNγ產量。

2.4 陰離子交換層析

采用Q XL陰離子交換層析法，低鹽上樣，450 mmol/L NaCl洗脫得到目的峰見圖2。經檢測病毒滴度回收率35.9%，比活性4%，A260/A280=1.27。

表2 病毒感染滴度測定結果Table 2 The p roduction of in fective units

圖2 Q XL陰離子交換層析純化Ad-IFNγFig.2 Anion-exchange chromatography of Ad-IFNγ lysate.

3 討論

流加培養(yǎng)通過添加新鮮培養(yǎng)基，補充營養(yǎng)，稀釋代謝副產物，維持細胞生長。流加培養(yǎng)無需截留器，硬件要求低，操作簡便，在哺乳動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)，特別是在一次性生物反應器中更常見[14]。但易受副產物累積制約，影響細胞狀態(tài)。因此優(yōu)化培養(yǎng)條件，控制流加時間及流加率極為重要。試驗發(fā)現(xiàn)，細胞密度在1×106?1.5×106個/m L時，細胞狀態(tài)良好，流加率為0.6?1/d，能保證細胞快速生長，縮短培養(yǎng)周期。密度增加至一定程度(＞1×106個/mL)，會出現(xiàn)“細胞密度效應(Cell density effect)”[3,8,15]。普遍認為與營養(yǎng)耗竭或副產物積累有關，但機制未明。補充營養(yǎng)或者更新培養(yǎng)基效果有限，并導致成本提高[5,8,16]。因此，綜合考慮成本及可操作性等因素，我們認為在密度2×106個/m L感染合適。報道指出，腺病毒顆粒單位(Adenovirus particle unit)單細胞包裝量在104?105VP/m L之間，而其中具有感染能力單位(Infectious units)不足十分之一甚至更低[3]。我們獲得單細胞病毒產量分別是2 200 IFU/cell、 1 700 IFU/cell和3 800 IFU/cell，與其他工藝相比，具有一定的競爭力。

氯化銫密度梯度離心是經典的腺病毒純化方法，但不適于規(guī)?；a。人們開發(fā)各種高通量純化工藝，如離子交換、凝膠過濾、擴張床、膜過濾等，以取代氯化銫密低梯度離心[17-19]。研究采用Q XL陰離子交換層析，獲得了35.9%的整體回收率。腺病毒的純化因工藝選擇有所不同，如Peixoto等采用擴張床層析，獲得了32%回收率[19]，Eglon等采用陰離子交換+凝膠過濾層析，獲得36%回收率[18]，Riske等采用膜吸附+凝膠過濾+陰離子交換層析，獲得(33±3)%回收率[20]，Liang等采用陽離子交換、親和層析、凝膠過濾層析分別獲得了39%、29%和24%回收率[21]。腺病毒的純化受緩沖液選擇、澄清方法等因素影響。選擇合適的緩沖液能夠保證核酸酶活性，降解宿主DNA，降低樣品粘度，便于澄清處理，去除細胞雜質及病毒凝集，減少位阻效應，能有效提高病毒回收率[18]。因此，篩選緩沖液配方，改進澄清方法，是腺病毒純化的關鍵之一。

一次性(拋棄型)生物反應器是生物制藥產業(yè)的新熱點。反應器配套耗材由經過FDA認證的特殊材質制成，安全性高。采用γ射線輻照無菌預處理，擯棄了傳統(tǒng)生物反應器繁冗耗能的滅菌程序，保證不同批次生產的物理隔絕。因此，采用一次性生物反應器，能降低生產成本，降低能耗，縮短生產周期，減少交叉污染風險[9]。研究選用非攪拌振蕩激流式一次性生物反應器生產重組腺病毒，取得了良好效果。

懸浮HEK 293細胞經種子鏈擴增以及一次性生物應器流加培養(yǎng)，溫度控制37℃，pH 7.1?7.2，DO 40%?50%，轉速55?65 r/m in，細胞密度提高至2×106個/m L，病毒粗產率達到3 800 IFU/cell，采用陰離子交換層析純化腺病毒產品，得到35.9%的回收率，初步建立了利用5 L振蕩激流式一次性激流式生物反應器懸浮培養(yǎng)HEK 293細胞生產Ad-IFNγ的生產工藝，同時為擴大生產規(guī)模奠定基礎，對其他類型的重組腺病毒產品生產也具有參考意義。

REFERENCES

[1]Connelly S.Adenoviral Vectors,in Gene Therapy Technologies,Applications and Regulations.Chichester: John W iley&Sons,Ltd,2001:87–107.

[2]Vectors Used in Gene Therapy Clinical Trial.[2014–02–2]. http://www.w iley.com/legacy/w ileyc hi/genmed/clinical/.

[3]Nadeau I,Kamen A.Production of adenovirus vector for gene therapy.Biotechnol Adv,2003,20(7/8):475–489.

[4]Liu H,Liu XM,Li SC,et al.A high-yield and scaleable adenovirus vector production process based on high density perfusion culture of HEK 293 cells as suspended aggregates. J Biosci Bioeng,2009,107(5):524–529.

[5]Kamen A,Henry O.Development and optim ization of an adenovirus production process.J Gene Med,2004,6 Suppl 1:S184–S192.

[6]Morishita N,Katsuda T,Kubo S,et al.Immobilization of 293 cells using porous support particles for adenovirus vector production.Cytotechnology,2010,62(4):293–300.

[7]Wu S,Huang GY,Liu J.Production of retrovirus and adenovirus vectors for gene therapy:a comparative study using m icrocarrier and stationary cell culture.Biotechnol Progr,2002,18(3):617–622.

[8]Ferreira TB,Ferreira AL,Carrondo M J,et al.Two different serum-free media and osmolality effect upon human 293 cell grow th and adenovirus production.Biotechnol Lett, 2005,27(22):1809–1813.

[9]Eibl R,Kaiser S,Lombriser R,et al.Disposable bioreactors: the current state-of-the-art and recommended applications in biotechnology.Appl M icrobiol Biotechnol,2010,86(1): 41–49.

[10]Kwon J,Yang Y,Cheon S,et al.Bioreactor engineering using disposable technology for enhanced production of hCTLA4Ig in transgenic rice cell cultures.Biotechnol Bioeng,2013,110(9):2412–2424.

[11]Sun B,Yu X,Kong W,et al.Production of influenza H1N1 vaccine from MDCK cells using a novel disposable packed-bed bioreactor.Appl M icrobiol Biotechnol,2013, 97(3):1063–1070.

[12]Thomassen YE,van der Welle JE,van Eikenhorst G,et al. Transfer of an adherent Vero cell culture method between two different rocking motion type bioreactors w ith respect to cell grow th and metabolic rates.Process Biochem,2012, 47(2):288–296.

[13]Zhang YL,Liu RY,Ke ML,et al.A hexon immunoassay for titering recombinant adenovirus.Chin J Pathophysiol,2005, 21(4):830–832(in Chinese).張艷玲,劉然義,柯妙拉,等.殼蛋白免疫法測定重組腺病毒滴度的方法學評價.中國病理生理雜志,2005, 21(4):830–832.

[14]Krahe M.Biochem ical Engineering,in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry.CH:Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA,2003,5:549–617.

[15]Ferreira TB,Ferreira AL,Carrondo MJ,et al.Effect of re-feed strategies and non-ammoniagenic medium on adenovirus production at high cell densities.J Biotechnol, 2005,119(3):272–280.

[16]Henry O,Dormond E,Perrier M,et al.Insights into adenoviral vector production kinetics in acoustic filter-based perfusion cultures.Biotechnol Bioeng,2004, 86(7):765–774.

[17]Lee D,Kim B,Seol D.Improved purification of recombinant adenoviral vector by metal affinity membrane chromatography.Biochem Bioph Res Co,2009,378(3): 640–644.

[18]Eglon MN,Duffy AM,O'Brien T,et al.Purification of adenoviral vectors by combined anion exchange and gel filtration chromatography.J Gene Med,2009,11(11): 978–989.

[19]Peixoto C,Ferreira TB,Carrondo M J,et al.Purification of adenoviral vectors using expanded bed chromatography.J Virol Methods,2006,132(1/2):121–126.

[20]Riske F,Berard N,A lbee K,et al.Development of a platform process for adenovirus purification that removes human set and nucleolin and provides high purity vector for gene delivery.Biotechnol Bioeng,2012,11(3): 848–856.

[21]Liang Z,Wu J,Huang J,et al.Bioactivity and stability analysis of endostatin purified from fermentation supernatant of 293 cells transfected w ith Ad/rhEndo. Protein Expres Purif,2007,56(2):205–211.

(本文責編 陳宏宇)

Producing Ad-IFN gamma by suspension culture of HEK 293 cells in a disposable bioreactor

Quande Wu1,and Wenlin Huang1,2,3,4,5
1 Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China 2 Sun Yat-sen University Cancer Center,Guangzhou 510010,Guangdong,China 3 Guangdong Provincial Key Laboratory of Tumor-targeted Drug,Guangzhou 510663,Guangdong,China 4 Guangdong Provincial Development and Reform Commission Key Laboratory of Gene Medicine,Guangzhou 510663,Guangdong,China 5 Guanzhou Doublle Bioproducts Corperation,Guangzhou 510663,Guangdong,China

Adenovirus vectors are prom ising delivery systems for gene therapy.We established a new process for clinic trial ofrecombinant adenovirus vectors using a novel disposable bioreactor.The suspension HEK293 cells were inoculated into a 5 L disposable bioreactor w ith parameters control of pH,DO,agitation and temperature.A fter 6 days of a fed-batch culture,the final cell density reached 2.0×106cells/m L.The culture was infected w ith Ad-IFNγ at an MOI of 30.The harvest was performed at approximately 48 h post-infection and crude viral lysate was obtained after 3 freeze/thaw cycles and centrifugation.The maximum titers of crude viral lysate was 1.49×1013Infectious units(IFU)and the bulk product specific was 3 800 IFU/cell. Purified Ad-IFNγ by anion-exchange chromatography and the final recovery of infectious unit reached 35.9%.The result demonstrates that an efficient and stable process of producing Ad-IFNγ using a disposable fed-batch bioreactor is established.

adenovirus vectors,suspension culture of HEK293 cell,disposable bioreactor,purification,anion-exchange chromatography

February 27,2014;Accep ted:April 15,2014

Wenlin Huang.Tel/Fax:+86-20-87343146;E-mail:drhuangwenlin@163.com

吳全德,黃文林.一次性生物反應器懸浮培養(yǎng)HEK293細胞生產Ad-IFNγ的工藝.生物工程學報,2014,30(11):1786?1790.

Wu QD,Huang WL.Producing Ad-IFN gamma by suspension culture of HEK 293 cells in a disposable bioreactor.Chin J Biotech,2014,30(11):1786?1790.

Supported by:Science and Technology Program of Guangdong Province(No.2011A 080502010),Major Drug Discovery of the 12th Five-year Program(No.2012ZX 09401015).

廣東省科技計劃項目(No.2011A 080502010)，十二五重大新藥創(chuàng)制項目(No.2012ZX 09401015)資助。

時間：2014-05-30網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140119.htm l