全細胞催化生產(chǎn)苯乙酰-7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸的條件優(yōu)化

付金衡，趙健，林白雪，許楊，陶勇

1南昌大學中德聯(lián)合研究院，江西南昌330047 2中國科學院微生物研究所，北京100101

全細胞催化生產(chǎn)苯乙酰-7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸的條件優(yōu)化

付金衡1，趙健1，林白雪2，許楊1，陶勇2

1南昌大學中德聯(lián)合研究院，江西南昌330047 2中國科學院微生物研究所，北京100101

頭孢類抗生素由于廣譜性和低毒性被廣泛用于細菌感染的治療。7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸(7-am inodeacetoxycephalosporanic acid，7-ADCA)作為半合成頭孢類抗生素的重要中間體，需求量逐漸增加，而7-ADCA主要由G-7-ADCA(苯乙酰-7ADCA)脫?；玫健９I(yè)上多以化學法合成G-7-ADCA，成本高，污染嚴重。迫切需要對環(huán)境友好且經(jīng)濟高效的合成方法。在前期研究中，構建了一株可以將青霉素G轉化為G-7-ADCA的代謝工程菌(E.coli H7/PG15)。本研究通過單因素試驗對E.coli H7/PG15的G-7-ADCA合成過程進行優(yōu)化，包括底物組成及其最適濃度，轉化條件(菌體濃度、pH、青霉素濃度、MOPS濃度、葡萄糖濃度，鐵離子濃度和時間等)。優(yōu)化后，建立了全細胞催化法生產(chǎn)G-7-ADCA的工藝流程，使G-7-ADCA的產(chǎn)量穩(wěn)定在15 mmol/L左右，轉化率達到30%，具有操作簡便、高效和經(jīng)濟的優(yōu)勢。

苯乙酰-7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸,全細胞催化,生物轉化,條件優(yōu)化

β-內(nèi)酰胺類抗生素是臨床使用最多、應用最廣和評價最高的一類抗生素[1]。β-內(nèi)酰胺環(huán)的抗生素中最重要的兩類是青霉素和頭孢類抗生素。青霉素有抗菌譜相對較窄、致病菌耐藥性、對酸不穩(wěn)定、不能口服等缺點[2]。頭孢菌素是意大利科學家Giuseppe Brotzu發(fā)現(xiàn)的第一種頭孢類抗生素，它是對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有強抑制的廣譜抗生素[3]。與青霉素相比，頭孢菌素具有抗菌譜廣、耐青霉素酶、毒性低等優(yōu)點。頭孢類抗生素合成的主要材料為7-氨基頭孢烯酸(7-ACA)和7-ADCA。7-ACA由頭孢菌素C去側鏈制得，頭孢菌素C則通過頂頭孢霉發(fā)酵產(chǎn)生。但頭孢菌素C的發(fā)酵產(chǎn)量較青霉素要低很多，而且在任何pH下都易溶于水，所用的柱層析分離技術操作復雜、成本高昂、工藝周期長。7-ADCA是制造頭孢氨芐、頭孢羥氨芐、頭孢拉定等半合成頭孢菌素的重要中間體，需求量大，與7-ACA相比，在3位消除了不穩(wěn)定的乙酰氧基。它可由價廉易得的青霉素G擴環(huán)得到G-7-ADCA，然后用青霉素酰化酶去除側鏈即可得到7-ADCA。

目前在工業(yè)上生產(chǎn)7-ADCA的方法主要有兩種：一是將擴環(huán)酶克隆至產(chǎn)黃青霉，直接發(fā)酵產(chǎn)G-7-ADCA[4]，酶法脫側鏈后獲得7-ADCA，但該方法的產(chǎn)量低，周期長，技術復雜，國內(nèi)未見報道；二是以青霉素G為原料，采用化學法酯化、擴環(huán)、脫脂得到G-7-ADCA，然后去除側鏈得到7-ADCA[5]。但化學合成方法不但成本高而且嚴重污染環(huán)境[6]。利用青霉素擴環(huán)酶(DAOCS)使青霉素G擴環(huán)得到G-7-ADCA(圖1)，再去除7位側鏈得到7-ADCA被認為是可以取代化學法的低成本、低污染的良好方法[7]。

Hsu等[8]在體外利用改造過的擴環(huán)酶將青霉素轉化為G-7-ADCA，Gao等[9]使用含青霉素擴環(huán)酶的棒狀鏈霉菌或酶的提取物進行轉化。上述方法轉化條件十分嚴格，且體外環(huán)境下，青霉素擴環(huán)酶極易失活，生物轉化的效率極低。而全細胞催化法研究的較少，且主要使用霉菌進行試驗，效率和產(chǎn)量都很低。

本實驗室創(chuàng)新性地將擴環(huán)酶基因克隆至經(jīng)過改造的E.coli，初步試驗G-7-ADCA的轉化產(chǎn)量達到了3 g/L以上(另文發(fā)表)。本文在前期工作基礎上對影響其轉化過程的關鍵性因素進行摸索與優(yōu)化，為進一步對該菌進行工業(yè)改造提供研究基礎，并為以后的工業(yè)化生產(chǎn)提供啟示和參考。

圖1 由青霉素擴環(huán)酶催化的由青霉素G向G-7-ADCA的轉化Fig.1 DAOCS catalyzed conversion of penicillin G to G-7-ADCA.

1 材料與方法

1.1 菌種

工程菌E.coli H7/PG15由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

標準品青霉素G購自Sigma公司，轉化底物青霉素G為國產(chǎn)分析純試劑，購于華北制藥有限公司。標準品G-7-ADCA由中國科學院微生物研究所楊克遷研究員提供。

1.3 工程菌E.coli H7/PG15的誘導表達

將E.coli H7/PG15接種于裝有150 m L ZYM-5052自誘導培養(yǎng)基[10]的250 m L搖瓶中，30℃誘導20 h，4℃離心后用生理鹽水洗滌2次，用轉化底物重懸菌體進行轉化。

1.4 工程菌E.coli H 7/PG 15轉化條件的優(yōu)化

1)初始轉化條件：將離心后的菌體用轉化底物混合物重懸(OD600為30)，底物組成為：100 mmol/L青霉素G，0.5%葡萄糖，50 mmol/L MOPS(pH 7.5)，3.6 mmol/L FeSO4。將200 μL菌懸液接入20 m L試管，30℃，250 r/m in轉化20 h，進行以下發(fā)酵條件的優(yōu)化分析，所有因素均進行3次平行測定，結果取平均值。

2)轉化體系中菌體濃度：細菌經(jīng)誘導離心后收集菌體，用轉化底物重懸菌體，使得轉化體系中最終OD600分別為15、30、45、60和75，其他條件同1)。

3)轉化體系中pH：在最適的菌體濃度下，優(yōu)化轉化過程的初始pH(6.5、7.0、7.5、8.0和8.5)，其他條件同1)。

4)轉化底物中青霉素濃度:在最適的菌體濃度、pH條件下，優(yōu)化底物中青霉素濃度(20、30、40、50、100、150和200 mmol/L)。

5)轉化底物中MOPS濃度：在最適的菌體濃度、pH和青霉素濃度條件下，優(yōu)化底物中緩沖液MOPS的濃度(0、20、50、100、150和200 mmol/L)，其他條件同1)。

6)轉化底物中葡萄糖濃度：在最適的條件下，優(yōu)化底物中葡萄糖濃度(0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%和1.25%)，其他條件同1)。

7)轉化底物中二價鐵離子濃度:在最適的條件度下，優(yōu)化底物中二價鐵離子濃度(0、0.45、0.9、1.8和3.6 mmol/L)，其他條件同1)。

8)二硫蘇糖醇和抗壞血酸對轉化的作用：在最優(yōu)轉化條件下，在轉化開始時分別加入二硫蘇糖醇和抗壞血酸，確定兩者對轉化的作用。

9)轉化反應的時間：在最適的條件下，在不同的轉化時間進行取樣，確定最優(yōu)的轉化時間。

1.5 分析測定方法

生物轉化反應中轉化底物青霉素G的量和G-7-ADCA的含量采用HPLC進行測定。轉化反應液離心后收集上清，用去離子水稀釋50倍，再用0.22 μm的濾膜過濾后即可上樣，上樣量為5 μL。色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18(3.5 μm 4.6 mm× 100 mm)，流動相為的70%的10 mmol/L的KH2PO4(pH 3.0)、30%的乙腈和0.7%的三氟乙酸，柱溫25°C，流速為0.5 m L/m in，紫外檢測波長青霉素G為220 nm，G-7-ADCA為260 nm。采用外標法繪制標準曲線對轉化體系中的底物和產(chǎn)物進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 轉化體系中菌體濃度對轉化的影響

全細胞轉化體系中，菌體濃度對轉化有一定的影響，菌體越多催化反應的酶越多，但并不是菌體量越大越有利于轉化，因為轉化過程需要氧氣和a-酮戊二酸(圖1)，菌體量越大，對溶氧的要求越高。同時當體系中溶氧相對較低的時候，會限制細胞的TCA循環(huán)，減少a-酮戊二酸的供應。通過比較不同OD600對轉化效率的影響，確定在OD600為45時，G-7-ADCA的產(chǎn)量最高。

2.2 轉化過程中初始pH的影響

Gao等[9]利用棒狀鏈霉菌進行轉化時的最適pH為6.5，然而細菌與真菌具有不同的代謝環(huán)境，對于pH的要求也截然不同。另一方面，底物和產(chǎn)物的溶解性和pH有重要的關系，當產(chǎn)物G-7-ADCA的pH降低時，其溶解性也快速降低，直至析出，會影響反應的進行和產(chǎn)物的檢測。我們以不同初始pH進行轉化，結果pH 7.5的轉化效率最高(圖2)。然而，在pH為7的時候產(chǎn)量快速降低，說明酶的轉化過程對pH是十分敏感的，在圖6中，反應速度隨時間延長降低，我們猜測部分原因是由pH降低引起的(初始pH為7.5，轉化20 h后會降到6.5左右)。

圖2 不同初始pH對轉化的影響Fig.2 Effects of pH on the bioconversion.

2.3 轉化底物中青霉素濃度

Jie等[11]及Goo等[12]在進行胞外和胞內(nèi)轉化實驗時，使用的青霉素G濃度較低，最高只有12 mmol/L。我們使用的青霉素濃度較高，因此出現(xiàn)了一些新的狀況，即底物抑制效應。如圖3所示，在20 mmol/L開始，隨底物濃度增加，產(chǎn)物濃度隨著增加，而轉化率卻是一直降低，到達50 mmol/L后，G-7-ADCA的產(chǎn)量達到最高，隨著底物濃度的增加，產(chǎn)物濃度逐漸降低。說明在青霉素G濃度為50 mmol/L的時候底物的促進作用和抑制作用達到平衡，雖然高濃度的底物會使反應速度加快，從經(jīng)濟實用的角度我們認為青霉素G濃度在50 mmol/L或更低的水平。

2.4 轉化底物中MOPS的濃度

由于產(chǎn)物是有機酸，導致反應液pH下降。而擴環(huán)酶作用需要穩(wěn)定的pH環(huán)境。Goo等[12]在實驗中使用的緩沖液均為MOPS緩沖液。我們的預實驗顯示，MOPS比Tris-HCl和HEPE緩沖效果好?？赡苁且驗镸OPS在pH 7左右有較好的緩沖能力，維持了較適宜的擴環(huán)酶催化環(huán)境。不同濃度的MOPS緩沖液的緩沖能力不同，結果表明，100 mmol/LMOPS的緩沖效果最好(圖4)。

圖3 轉化底物中青霉素G濃度對轉化的影響Fig.3 Effects of penicillin G on the bioconversion.

圖4 轉化底物中不同MOPS濃度對轉化的影響Fig.4 Effects of MOPS on the bioconversion.

2.5 轉化底物中葡萄糖濃度的影響

轉化過程需要a-酮戊二酸作為底物。大腸桿菌中的a-酮戊二酸主要來源于TCA循環(huán)，而TCA循環(huán)需要葡萄糖推動。如圖5所示，當葡萄糖濃度為0.5%時G-7-ADCA的產(chǎn)量最高，達16 mmol/L，而后隨著葡萄糖濃度的增加底物濃度降低。我們檢測到隨著葡萄糖濃度增加乙酸的產(chǎn)量隨著增加，我們猜測是乙酸的增加使pH降低從而間接地影響了G-7-ADCA的產(chǎn)量。

圖5 轉化底物中葡萄糖濃度的影響Fig.5 Effects of glucose on the bioconversion.

2.6 轉化底物中二價鐵離子濃度

Fe2+是青霉素擴環(huán)酶重要的輔因子[13]，在轉化反應中起重要的作用。對不同濃度的Fe2+進行優(yōu)化，結果顯示，在Fe2+濃度為0.9 mmol/L時即可達到最優(yōu)的轉化效率，隨著Fe2+濃度的進一步增加，產(chǎn)物量不再增加。結果表明從0到3.6 mmol/L，產(chǎn)物增加不足5 mmol/L，說明Fe2+并不是影響轉化的關鍵因素，在實驗過程中我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e2+會快速的氧化成3價并變?yōu)辄S色沉淀，同時會形成膠體吸附一部分菌體，因此我們認為在轉化過程中要限制Fe2+的添加。

2.7 二硫蘇糖醇和抗壞血酸對轉化的作用

在體外實驗中，Jie及Cho等[11,14]均用到了二硫蘇糖醇和抗壞血酸，結果顯示，二者對轉化過程有一定的促進作用。而Sim等[15]認為二硫蘇糖醇和抗壞血酸對擴環(huán)酶起抑制作用。本研究中，初始轉化條件下，在轉化開始時分別加入二硫蘇糖醇(DTT)和抗壞血酸，結果表明：本研究中，二硫蘇糖醇和抗壞血酸均不是轉化反應所必需的，且對反應有輕微的抑制作用。

2.8 轉化反應的時間

利用前面實驗得到最優(yōu)的轉化條件進行轉化實驗，考察轉化時間對反應的影響。結果如圖6所示，隨著時間延長，反應速率逐漸降低，在轉化進行17 h之后，反應速率由開始的3 mmol/(L·h)降低到約0.1 mmol/(L·h)，考慮水分蒸發(fā)帶來的濃度差異(200 μL體系，轉化20 h水分蒸發(fā)12 μL)，可以認為反應已經(jīng)不再進行。因此，最優(yōu)的轉化時間為17 h。

圖6 轉化過程中產(chǎn)物濃度隨時間變化Fig.6 Effects of the time of bioconversion.

3 結論

針對目前G-7-ADCA生產(chǎn)的高成本、高污染問題，利用生物轉化法將廉價的底物青霉素G轉化為G-7-ADCA，完全可以解決工業(yè)生產(chǎn)中高成本高污染的問題，在Jie及Sim等[11,15]的研究中，轉化實驗需要用到a-酮戊二酸、亞鐵離子、DTT、抗壞血酸等，成分較為復雜，而對條件要求比較嚴格，如在Gao等[9]的研究中，pH和鐵離子的最適濃度在極小的范圍內(nèi)，且G-7-ADCA的產(chǎn)量低，一般都在1 mmol/L以下，遠遠達不到工業(yè)生產(chǎn)的要求。

本實驗室使用E.coli全細胞催化的方法進行生物轉化，具有轉化時間短、成本低與產(chǎn)量高的優(yōu)點。最適反應條件如下：E.coli H7/PG15菌體濃度OD600為45、50 mmol/L青霉素G，0.5%葡萄糖，100 mmol/L MOPS(pH 7.5)，0.9 mmol/L FeSO4，轉化17 h，可以使G-7-ADCA產(chǎn)量(15 mmol/L)和轉化率(30%)達到較高的水平。為全細胞催化生產(chǎn)G-7-ADCA的進一步研究和后期的發(fā)酵實驗提供啟示和參考。

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(本文責編 陳宏宇)

Optim ization of whole-cell biocatalysis for phenylacetyl-7-am inodeacetoxycephalosporanic acid production

Jinheng Fu1,Jian Zhao1,Baixue Lin2,Yang Xu1,and Yong Tao2
1 Sino-Germany Joint Research Institute,Nanchang University,Jiangxi 330047,Nanchang,China 2 Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China

Cephalosporins are w idely used antibiotics ow ing to their broad activity spectra and low toxicity.Many ofthese medically important compounds are made chem ically from 7-am inodeacetoxycephalosporanic acid.At present,this intermediate is made by synthetic ring-expansion of the inexpensive penicillin G to form G-7-ADCA,followed by enzymatic removal of the side chain to obtain 7-ADCA.The chem ical synthetic process is expensive,complicated and environmentally unfriendly.Environmentally compatible enzymatic process is favorable compared w ith chem ical synthesis. In our previous research,metabolic engineered Escherichia coli strain(H7/PG15)was constructed and used as whole-cell biocatalyst for the production of G-7-ADC w ith penicillin G as substrate.The whole-cell biocatalysis was studied by single factor experiment,including the composition of substrates and the conversion conditions(OD600,pH,concentration of penicillin G,MOPS,glucose,time and FeSO4).A fter optim ization,15 mmol/L of G-7-ADCA was obtained.The process is convenient,efficient and econom ic.This work would facilitate the industrial manufacturing and further product research.

phenylacetyl-7-aminodeacetoxycephalosporanic acid,whole-cell biocatalysis,biotransformation,conditions optim ization

February 24,2014;Accep ted:April 24,2014

Yang Xu.Tel:+86-791-8329479;E-mail:xuyang1951@163.com Yong Tao.Tel/Fax:+86-10-64807419;E-mail:taoyong@im.ac.cn

付金衡,趙健,林白雪,等.全細胞催化生產(chǎn)苯乙酰-7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸的條件優(yōu)化.生物工程學報,2014, 30(11):1781–1785.

Fu JH,Zhao J,Lin BX,et al.Optim ization of whole-cell biocatalysis for phenylacetyl-7-am inodeacetoxycephalosporanic acid production.Chin J Biotech,2014,30(11):1781–1785.

Supported by:The third Innovation Fund of“Industrial M icrobial Genomics Modification and Application”,Institute of M icrobiology,Chinese Academy of Sciences.

中國科學院微生物研究所第三批“工業(yè)微生物組學改造及應用”創(chuàng)新培育基金資助。