香石竹毛狀根誘導(dǎo)、離體培養(yǎng)及其植株再生

施和平，朱遠鋒，王蓓，孫蔣兵，黃勝琴

華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室，廣東廣州510631

組織工程與細胞培養(yǎng)

香石竹毛狀根誘導(dǎo)、離體培養(yǎng)及其植株再生

施和平，朱遠鋒，王蓓，孫蔣兵，黃勝琴

華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室，廣東廣州510631

為了探討利用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化所產(chǎn)生的毛狀根來創(chuàng)新香石竹種質(zhì)的可能性，本文采用葉盤法，建立了發(fā)根農(nóng)桿菌Agrobacterium rhizogenes對香石竹Dianthus caryophyllus L.葉片外植體的遺傳轉(zhuǎn)化及其植株再生體系。結(jié)果表明，發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834感染香石竹幼嫩葉片外植體12 d后，從葉片外植體切口中脈處產(chǎn)生白色毛狀根，21 d后約90%的葉片外植體產(chǎn)生毛狀根。所獲得的無菌毛狀根能在無外源激素的MS固體和液體培養(yǎng)基中快速自主生長。PCR擴增和硅膠薄層層析結(jié)果顯示發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的rol B和rol C基因以及冠癭堿合成酶基因已在香石竹毛狀根基因組中整合并得到表達。將毛狀根置于MS+6-BA 1.0?3.0 mg/L +NAA 0.1?0.2 mg/L中培養(yǎng)15 d后產(chǎn)生淡黃綠色的疏松愈傷組織。愈傷組織不定芽分化的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L，培養(yǎng)6周后不定芽分化率為100%；平均每個愈傷組織產(chǎn)生30?40個不定芽；將不定芽轉(zhuǎn)至1/2 MS或1/2 MS+0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基中10 d后產(chǎn)生不定根，發(fā)育成再生植株。再生植株移植于栽培基質(zhì)中20 d后，成活率達95%以上。

香石竹，發(fā)根農(nóng)桿菌，毛狀根，植株再生

毛狀根(Hairy roots)是發(fā)根農(nóng)桿菌Agrobacterium rhizogenes Ri質(zhì)粒的含生根基因(rol gene)的T-DNA片段在植物細胞基因組中插入、整合和表達所產(chǎn)生的結(jié)果[1]。與根癌農(nóng)桿菌A.tumefaciens相比，發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化具有許多優(yōu)點，如毛狀根為單細胞起源(即每一條毛狀根都是由一個細胞被T-DNA遺傳轉(zhuǎn)化表達的結(jié)果)，具激素自主型生長，不含致瘤基因，不僅容易再生形成轉(zhuǎn)化植株，而且其再生植株不會出現(xiàn)根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化常出現(xiàn)的嵌合體等[2-3]，因而在高等植物基因工程及植物種質(zhì)創(chuàng)新和性狀改良等方面更具應(yīng)用價值。目前已建立了發(fā)根農(nóng)桿菌對百余種植物的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了其毛狀根及其再生轉(zhuǎn)化植株[3-4]，而且這些轉(zhuǎn)化植株常表現(xiàn)出一些形態(tài)、生長習(xí)性或觀賞性狀方面的變異，如天竺葵Pelargonium sp.觀賞特性的改良和芳香氣味的產(chǎn)生[5]、菊苣Cichorium intybus的無需春化即可開花[5]、長壽花Kalanchoe blossfeldiana和紫高杯花Nierembergia scoparia的植株矮化[7-8]、長春花花葉形態(tài)改變[9]、碧冬茄的提早開花[10]、比利時菊苣的開花習(xí)性改變等[11]；彰示出發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化在植物性狀改良及新的有益性狀培育方面具有的巨大潛力，表明毛狀根完全可用作園藝植物種質(zhì)創(chuàng)新、新品種培育和性狀改良的有效工具。

香石竹Dianthus caryophyllus L.又名康乃馨、麝香石竹，是世界上商業(yè)性栽培最重要的四大切花之一。但國內(nèi)市場流行的品種大都為引進的國外品種，且極少有自主培育的新品種[12]。因而，目前國內(nèi)有關(guān)香石竹的研究大都集中在其快速繁殖[13]、切花保鮮[14-15]、試管內(nèi)開花[16]等方面；而有關(guān)其種質(zhì)創(chuàng)新和性狀改良的研究則大都是利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化來提高其抗病性[17]或瓶插壽命[18]等；少見有關(guān)利用含生根基因的發(fā)根農(nóng)桿菌對香石竹的遺傳轉(zhuǎn)化及其毛狀根植株再生以及利用毛狀根多態(tài)性來進行其種質(zhì)創(chuàng)新或新品種培育的研究報道。為了探討利用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化所產(chǎn)生的毛狀根多態(tài)性來創(chuàng)新香石竹的種質(zhì)，培育出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新品種，本文報道發(fā)根農(nóng)桿菌對香石竹葉片外植體的遺傳轉(zhuǎn)化以及其可自主生長的毛狀根組織培養(yǎng)和植株再生的結(jié)果，旨在為今后從毛狀根再生植株中篩選出花色變異的新品種及開展毛狀根的多倍體育種奠定實驗和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細菌菌株及培養(yǎng)

農(nóng)桿堿型發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834由德國馬丁?路德大學(xué)的Peter Lindemann博士提供。挑取該農(nóng)桿菌單菌落，接種于添加20 μmol/L乙酰丁香酮的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩(160 r/m in)培養(yǎng)30 h后，供感染用。

1.2 外植體制備

實驗所用的香石竹Dianthus caryophyllus L.購自廣州花博園。取香石竹的幼嫩葉片用0.1%升汞消毒8 min，無菌水漂洗后，切成1.5?2.5 cm2左右的葉片外植體，接種于無外源激素的MS培養(yǎng)基[19]預(yù)培養(yǎng)24 h后，用于轉(zhuǎn)化。

1.3 毛狀根的誘導(dǎo)和培養(yǎng)

將上述預(yù)培養(yǎng)的葉片外植體浸入用MS培養(yǎng)基稀釋2倍的發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834菌懸液中15 min，取出、吸干多余菌液并放回原培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2 d后，轉(zhuǎn)入MS+500 mg/L頭胞噻肟鈉的無外源激素的MS培養(yǎng)基上，在25℃每天14 h散射光下誘導(dǎo)毛狀根。切取從外植體產(chǎn)生的毛狀根置于含500 mg/L頭胞噻肟鈉的無外源激素的MS培養(yǎng)基上進行單根除菌培養(yǎng)，直到獲得無菌的毛狀根。

1.4 毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化鑒定

采用Ri質(zhì)粒TL-DNA(T-DNA左臂)rol基因的PCR擴增和TR-DNA(T-DNA右臂)的冠癭堿合成酶基因的表達產(chǎn)物冠癭堿的硅膠薄層層析來對香石竹毛狀根及其再生植株進行遺傳轉(zhuǎn)化鑒定。

1.4.1 毛狀根rol基因的PCR擴增

取能在無外源激素的培養(yǎng)基上快速自主生長的無菌毛狀根500 mg，按Edwards等[20]的方法提取毛狀根基因組DNA，純化后用作PCR擴增的模板。以非轉(zhuǎn)化植株根的基因組總DNA作對照。根據(jù)Furner等[21]和Choi等[4]發(fā)表的序列，設(shè)計用于擴增rol B、rol C和vir C的PCR引物，其序列如表1所示，均由中國科學(xué)院上海細胞生物研究所合成。

在0.2 m L的硅化離心管中加入模板DNA 50 ng，Taq DNA聚合酶2 U，PCR反應(yīng)總體積為50 μL。PCR擴增參數(shù)如下：rol B和rol C基因擴增條件相同，其PCR擴增的反應(yīng)參數(shù)為：94℃熱變性3 m in；94℃變性1 m in，53.5℃退火1 m in和72℃延伸反應(yīng)1 m in，進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10 m in。而vir C基因的擴增條件為：94℃起始熱變性5 m in，30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性45 s，55℃退火45 s和72℃延伸反應(yīng)2 m in，最后72℃延伸7 m in。擴增產(chǎn)物采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和EtBr染色進行分析。

1.4.2 冠癭堿的硅膠薄層層析

參照Tanaka等[22]的方法進行并略加修改：取香石竹毛狀根，或其毛狀根再生植株、發(fā)根農(nóng)桿菌菌體各適量，充分研磨成粉狀，加入70%乙醇，浸泡過夜，次日離心取上清液濃縮，點樣于硅膠薄層層析板(GF254型，10 cm×20 cm，青島海洋化工廠出品)上，展層、染色和拍照。

表1 PCR擴增所用的引物及其序列Tab le 1 Prim er sequences used for the PCR am p lification

1.5 毛狀根愈傷組織誘導(dǎo)及其植株再生

將上述遺傳轉(zhuǎn)化鑒定呈陽性的香石竹毛狀根切成2?3 cm的根段，接入MS+6-BA 1.0?3.0 mg/L +NAA 0.1?0.2 mg/L培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織；30 d后，將愈傷組織轉(zhuǎn)入MS+6-BA 1.0?2.0 mg/L+NAA 0.01?0.02 mg/L進行不定芽分化，待所產(chǎn)生的不定芽長至3?4 cm時，接入1/2 MS無激素培養(yǎng)基或1/2 MS+NAA 0.5 mg/L的固體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，長成完整植株。

1.6 再生植株的盆栽及其性狀觀察

移栽前，去掉封口膜，將生根良好的再生植株置于散射光下煉苗4?5 d后取出，洗去根部的瓊脂培養(yǎng)基后，移植在含椰糠：泥炭土(1∶2)營養(yǎng)基質(zhì)的花盆中，并用保鮮膜覆蓋3?4 d后，轉(zhuǎn)入25℃溫室中培養(yǎng)，并觀察記錄再生植株生長發(fā)育情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 香石竹毛狀根的誘導(dǎo)和培養(yǎng)

未感染的香石竹葉片外植體在無外源激素的MS+500 mg/L頭胞噻肟鈉的培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)1個月后無一生根，僅可見大部分的葉片外植體邊緣部分變黃或變褐；而感染發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834的香石竹葉片外植體培養(yǎng)12 d后，從其葉片外植體切口中脈處或附近表面產(chǎn)生白色、被短根毛的毛狀根(圖1A)；21 d后約90%的葉片外植體產(chǎn)生毛狀根。將所產(chǎn)生的毛狀根切下并置于MS+500 mg/L頭胞噻肟鈉中單根除菌培養(yǎng)，每隔7 d左右轉(zhuǎn)接1次，約5?6次后即可完全除菌。無菌毛狀根可在無外源激素的MS固體或液體培養(yǎng)基上快速自主生長，且具較多分枝(圖1B和1C)。所獲得的可自主快速生長的無菌毛狀根置于無外源激素的MS培養(yǎng)基中繼代保存，供進行遺傳轉(zhuǎn)化鑒定用。

2.2 毛狀根rol基因的PCR擴增

rol B和rol C是發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒TL-DNA(T-DNA左臂)上的2個生根基因。而vir C是Ri質(zhì)粒中參與T-DNA轉(zhuǎn)化過程但本身并不整合入植物基因組中的毒性基因之一。以rolB、rol C和vir C的引物分別從香石竹對照根、毛狀根基因組DNA及發(fā)根農(nóng)桿菌單菌落擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖2。從圖2可見，利用rol B和rol C的PCR引物能從香石竹毛狀根的總DNA及發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834單菌落克隆中分別擴增到期望的540 bp和770 bp左右的特異性DNA片段，而從非轉(zhuǎn)化根的總DNA中擴增不到任何片段(圖2)；而以vir C引物僅能從發(fā)根農(nóng)桿菌菌落中擴增出約650 bp條帶，而不能從香石竹毛狀根和非轉(zhuǎn)化根基因組DNA中擴增出任何片段。這說明，發(fā)根農(nóng)桿菌含rol基因的TL-DNA(T-DNA左臂)已在香石竹毛狀根基因組中整合并得到表達。

當(dāng)發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的TR-DNA(T-DNA右臂)部分整合到宿主植物細胞DNA中后，在轉(zhuǎn)化細胞中就能合成特異的冠癭堿(Opines)；而發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒本身雖有冠癭堿合成酶基因，但該基因只在真核生物中表達，其自身(菌體)不能合成冠癭堿[2]。如果香石竹毛狀根及其再生植株為Ri質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化，那么它們細胞中就會有冠癭堿的合成，硅膠薄層層析顯色結(jié)果應(yīng)成陽性。因而，冠癭堿的有無也可作為Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的指標之一。圖3為香石竹毛狀根及其再生植株冠癭堿的硅膠薄層層析檢測結(jié)果。從圖3可見，上述經(jīng)rol基因PCR擴增呈陽性的發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834菌株誘導(dǎo)香石竹葉片外植體產(chǎn)生的毛狀根及其再生植株能檢測到冠癭堿(甘露堿)，而對照植株及發(fā)根農(nóng)桿菌菌體中則沒有檢測到冠癭堿(甘露堿)的存在。這說明，除發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的rol基因外，Ri質(zhì)粒的含編碼冠癭堿合成酶基因的TR-DNA也已在香石竹毛狀根及其再生植株基因組中整合并得到表達。

圖1 香石竹(康乃馨)毛狀根誘導(dǎo)，離體培養(yǎng)及其植株再生Fig.1 Induction and in vitro culture of hairy roots and its plant regeneration of D.caryophyllus.(A)Hairy root formation from cut surface of leaf explants inoculated w ith A.rhizogenes ATCC15834 for 12 d.(B)Solid culture of hairy roots for 14 d.(C)Liquid culture of hairy roots for 40 d.(D)Adventitious shoot formation of hairy roots after cultured for 25 d in liquid phytohormone-free MS medium.(E)Adventitious shoots formation from hairy roots after cultured on solid MS+6-BA 1.0 mg/L.(F)Callus formation from hairy roots cultured on MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L.(G)Adventitious shoots formation from callus when cultured on MS+6-BA 2.0+NAA 0.02 for 28 d.(H) Proliferation culture of adventitious shoots cultured in liquid medium MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L(I) Pot-grown untransformed plants(left)and hairy roots-regenerated plants(right).

2.3 毛狀根愈傷組織誘導(dǎo)及其不定芽分化

將上述遺傳轉(zhuǎn)化鑒定呈陽性的香石竹毛狀根切成2?3 cm的根段，轉(zhuǎn)入MS+6-BA 1.0?3.0 mg/L+ NAA 0.1?0.2 mg/L的培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導(dǎo)。接種8 d后毛狀根根段開始變粗、膨大，并逐漸產(chǎn)生出淺綠色疏松愈傷組織，15 d后所有毛狀根根段均形成愈傷組織，并隨著培養(yǎng)時間延長，其愈傷組織體積迅速增大(圖1F)。將上述毛狀根根段形成的淺綠色疏松愈傷組織轉(zhuǎn)入MS+6-BA 1.0?2.0 mg/L+NAA 0.2?0.02 mg/L的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)35 d后，可見從膨大的愈傷組織表面逐漸分化出綠色芽點，并發(fā)育成叢生不定芽(圖1G)。在供試的各培養(yǎng)基中，香石竹毛狀根愈傷組織不定芽分化的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L，培養(yǎng)6周后不定芽分化率為100%；平均每個愈傷組織產(chǎn)生30?40個不定芽。同時發(fā)現(xiàn)，將愈傷組織所產(chǎn)生的不定芽置于MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L中液體振蕩培養(yǎng)時，不僅不定芽能增殖，而且在不定芽增殖同時還能從不定芽基部產(chǎn)生出白色不定根(圖1H)；另外，雖然在液體培養(yǎng)基產(chǎn)生的不定芽存在輕度的玻璃化現(xiàn)象，但當(dāng)玻璃化再生苗轉(zhuǎn)至MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)2周后，仍能發(fā)育成健壯的植株。此外，在實驗中還發(fā)現(xiàn)，香石竹毛狀根系在無外源激素的液體MS培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)30 d后，也可直接從毛狀根起始根段處產(chǎn)生出少量不定芽(圖1D)。另外，當(dāng)毛狀根根段在僅加1.0 mg/L 6-BA的MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)35 d后，也可從少數(shù)毛狀根的起始根段頂端產(chǎn)生出綠色芽點，并逐漸分化出不定芽；但其幼芽誘導(dǎo)率僅為25%(圖1E)。該法與上述先形成愈傷組織再繼代培養(yǎng)再生不定芽的方法相比，雖然不定芽誘導(dǎo)率相對較低，分化的不定芽數(shù)也較少，平均每個毛狀根產(chǎn)生的不定芽數(shù)目僅為4?6；但其不需繼代，不僅實驗操作簡單，且獲得再生植株的時間也較短。

圖2 香石竹毛狀根vir C、rol B和rol C基因的PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳分析Fig.2 Gel electrophoresis analysis of PCR fragments of Vir C,rol B and rol C genes amplified from the genome DNA of D.caryophyllu hairy roots.1:1 kb DNA marker;2?5:fragments w ith vir C primers;6?9: fragments w ith rol B primers;10?13:fragments w ith rol C primers;2,6 and 10:fragments amplified from the colony of A.rhizogenes ATCC15834;3,7 and 11: fragments from untransformed roots;4,5,8,9,12 and 13:fragments amplified from hairy roots.

圖3 香石竹毛狀根及其再生植株冠癭堿的硅膠薄層層析檢測Fig.3 Detection of opines in hairy roots and its regenerated plants of D.caryophyllus by silica gel thin layer chromatography.1:extract of agrobacterium;2: control root extract;3:transformed plant extract;4: hairy root extract;Man:mannopine.

2.4 不定芽生根誘導(dǎo)及移栽

切取高3?4 cm的健壯不定芽分別轉(zhuǎn)接到不含或含有0.5 mg/L NAA的1/2 MS固體培養(yǎng)基進行生根誘導(dǎo)，約接種10 d后從不定芽基部逐漸分化出白色不定根，且隨著培養(yǎng)時間的延長，不定根的數(shù)量逐漸增加，不定根不斷伸長，發(fā)育成完整植株；其中，尤以不定芽在添加0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基中產(chǎn)生的不定根更多而粗。

待再生植株根長到3?5 cm時，打開香石竹無菌苗封口膜，并在恰當(dāng)光強下煉苗3?4 d后，取出并洗去根部的培養(yǎng)基，移植至盛椰糠：泥炭土(1∶2)的花盆中，并用保鮮膜覆蓋和置于散射光下培養(yǎng)，待3?5 d后香石竹植株葉片逐漸恢復(fù)正常生長后，去掉保鮮膜，轉(zhuǎn)入25℃溫室中光照培養(yǎng)。20 d后統(tǒng)計，再生植株的移栽成活率達95%以上(圖1I)；并可觀察到部分毛狀根再生植株葉片較對照略變寬，或節(jié)間略縮短，或頂端優(yōu)勢減弱，而更多有關(guān)毛狀根再生植株的生長形態(tài)及觀賞性狀變化正在觀察中。

3 討論

迄今為止，利用發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的T-DNA片段在植物細胞基因組中的整合和表達所產(chǎn)生的生長迅速的毛狀根培養(yǎng)物來進行園藝植物種質(zhì)創(chuàng)新或改良園藝植物的觀賞性狀，已在紫高杯花Nierembergia scoparia和長壽花Kalanchoe blossfeldiana等多種園藝植物中獲得成功[7-8]。國內(nèi)外也有學(xué)者開展了發(fā)根農(nóng)桿菌對石竹科植物康乃馨遺傳轉(zhuǎn)化的研究報道；如利用發(fā)根農(nóng)桿菌對其帶節(jié)莖段的轉(zhuǎn)化，獲得了康乃馨D.caryophyllus L.品種“Indios”的毛狀根[23]；但少見有關(guān)發(fā)根農(nóng)桿菌對石竹屬植物香石竹其他品種遺傳轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)研究報道。與已有的研究相比，在本實驗中我們用含野生農(nóng)桿堿型Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834對香石竹葉片外植體的遺傳轉(zhuǎn)化，不僅獲得了可自主生長的毛狀根；而且通過組織培養(yǎng)途徑，無論是直接再生途徑還是間接再生途徑都獲得了香石竹毛狀根的再生植株。此外，在本實驗中還觀察到，發(fā)根農(nóng)桿菌感染香石竹葉片外植體后可不經(jīng)愈傷組織階段直接從其切口部位產(chǎn)生根原基，發(fā)育成毛狀根，而這與Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化胡蘿卜Daucus carota L.塊根切片和煙草Nicotiana tabacum L.莖切段時，僅由形成的愈傷組織再產(chǎn)生毛狀根的方式不同[24]。然而，馬鈴薯葉片外植體和塊莖切塊被發(fā)根農(nóng)桿菌感染后則直接產(chǎn)生毛狀根，但其莖段外植體則從形成的愈傷組織上長出毛狀根[25]。而發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化甘草Glycyrrhiza uralensisi Fisch子葉和下胚軸時，毛狀根既可直接從切口處產(chǎn)生，也可從切口處形成的愈傷組織上長出[26]。此外，我們曾用發(fā)根農(nóng)桿菌感染藥用植物商陸Phytolacca esculenta van Houtte葉柄外植體時，則不經(jīng)愈傷組織階段，直接從其切口部分產(chǎn)生根原基，發(fā)育成毛狀根，而其葉片外植體則可直接從切口表面或從形成的愈傷組織上形成毛狀根[27]。這表明，發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植物細胞后，毛狀根的形態(tài)發(fā)生方式可因植物種類和感染部位等不同而有所差異。

能否從毛狀根產(chǎn)生出再生植株，是利用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的毛狀根多態(tài)性來進行園藝植物種質(zhì)創(chuàng)新和品種改良的前提和關(guān)鍵。已有的研究表明，發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的毛狀根可通過直接分化出芽獲得再生植株；也可以先形成愈傷組織，再從愈傷組織分化出芽獲得再生植株[3,28]。如玉米毛狀根可在培養(yǎng)基上先形成愈傷組織，然后再逐漸分化出芽獲得再生植株[3]。而且，同一植物的毛狀根也可以通過兩種或兩種以上的方式獲得再生植株。如張繼棟等發(fā)現(xiàn)木本曼陀羅Datura arborea L.毛狀根在適宜培養(yǎng)基上可直接誘導(dǎo)不定芽；也可以先在適宜培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出愈傷組織，然后再誘導(dǎo)出不定芽[28]。而這與本實驗結(jié)果有些相似。在本實驗中，香石竹毛狀根也可先在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上形成愈傷組織，然后再通過將愈傷組織轉(zhuǎn)入添加不同濃度6-BA和NAA組合的不定芽分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出不定芽而獲得再生植株；同時也發(fā)現(xiàn)，香石竹毛狀根也可僅在無激素液體MS培養(yǎng)基中無需繼代，培養(yǎng)30 d后直接再生出不定芽；或在僅加1 mg/L 6-BA的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)35 d后，直接從毛狀根起始根段處產(chǎn)生少量不定芽。雖然后者的不定芽誘導(dǎo)率較低，僅為25%；但因不需繼代，操作更簡單，且獲得再生植株的時間也較短。已有的研究表明，在發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中，由于T?DNA插入植物基因組的位置、長度和拷貝數(shù)千差萬別[29]，植物感染部位就會產(chǎn)生在形態(tài)、生長習(xí)性或觀賞性狀和次生代謝產(chǎn)物含量等方面各異的毛狀根克隆[5,9-11]，這些單細胞起源的變異克隆為新的優(yōu)良性狀的發(fā)現(xiàn)和篩選提供了方便和可能。而本文所建立的發(fā)根農(nóng)桿菌對花卉植物香石竹葉片外植體的遺傳轉(zhuǎn)化體系以及其可自主生長的毛狀根的植株再生體系，為今后利用從多態(tài)性毛狀根再生植株中篩選到觀賞性狀改變或改良的新種質(zhì)或利用其毛狀根多倍體化來獲得其多倍體新種質(zhì)奠定了實驗技術(shù)基礎(chǔ)，并提供了可能性。

REFERENCES

[1]Tepfer M,Casse-Delbart F.Agrobacterium rhizogenes as a vector for transform ing higher plants.M icrobiol Sci,1987,4(1):24–28.

[2]Li JL,Xu XL,Chen JS.Agrobacterium rhizogenes Ri plasm id and its application.Prog Biotechnol, 1993,14(2):8–14(in Chinese).李集臨,徐香玲,陳金山.發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒及其應(yīng)用.生物工程進展,1993,14(2):8–14.

[3]Xu HW,Zhou XF,Lu JM,et al.Hairy roots induced by Agrobacterium rhizogenes and production of regenerative plants in hairy root cultures in maize.Sci China C:Life Sci,2005, 35(6):497–501(in Chinese).徐洪偉,周曉馥,陸靜梅,等.發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)玉米毛狀根發(fā)生及再生植株.中國科學(xué)C輯, 2005,35(6):497–501.

[4]Giri A,Narasu M L.Transgenic hairy roots:recent trends and applications.Biotechnol Adv,2000,18 (1):1–22.

[5]Pellegrineschi A,Damon JP,Valtorta N,et al. Improvement of ornamental characters and fragrance production in lemon-scented geranium through genetic transformation by Agrobacterium rhizogenes.Biotechnology,1994,12(1):64–68.

[6]Kamada H,Ono A,Saitou T,et al.No requirement of vernalization for flower formation in Ri-transformed Cichorium plants.Plant Tiss Cult Lett,1992,9(3):206–213.

[7]Christensen B,Sriskandarajah S,Serek M,et al. Transformation of Kalanchoe blossfeldiana w ith rol genes is useful in molecular breeding towards compact grow th.Plant Cell Rep,2008,27(9): 1485–1495.

[8]Godo T,Tsujii O,Ishikawa K,et al.Fertile transgenic plants of Nierembergia scoparia sendmer obtained by a m ikimopine type strain of Agrobacterium rhizogenes.Sci Horticult,1997, 68(1):101–111.

[9]Choi PS,Kim YD,Choi KM,et al.Plant regeneration from hairy root cultures transformed by infection w ith Agrobacterium rhizogenes in Catharanthus roseus.Plant Cell Rep,2004,22 (11):828–831.

[10]W inefield C,Lew is D,Arathoon S,et al. A lteration of Petunia plant form though the introduction of the rol C gene from Agrobacterium rhizogenes.Mol Breed,1999,5(6):543–551.

[11]Limari MA,Sun LY,Douat C,et al.Natural genetic transformation by Agrobacterium rhizogenes:annual flowering in biennials,belgian endive and carrot.Plant Physiol,1998,118(2): 543–550.

[12]Xiong L.Carnation.Beijing:China Agricultural Publishing House,1999:133–135(in Chinese).熊麗.香石竹.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1999: 133–135.

[13]Huang DH,Zhou Q,Tao XH,et al.Tissue culture and rapid propagation of the short carnation.Chin Agri Sci Bull,2007,23(9):103–106(in Chinese).黃冬華,周群,陶秀花,等.矮生香石竹的組織培養(yǎng)和快速繁殖.中國農(nóng)學(xué)通報,2007,23(9): 103–106.

[14]Zhao Y,Li XF.Study of 6-BA on preservation effect of cut carnation.Acta Agric Bor-occid Sin, 2008,17(2):254–257(in Chinese).趙瀅,李新鳳.6-BA對香石竹切花保鮮效果的研究.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報,2008,17(2):254–257.

[15]Liu JP,He SG,Lü PT,et al.Effect of sodium dichloroisocyanurate on preservation of cut carnation(Dianthus caryphyllus L.).Acta Horticul Sin,2009,36(1):121–126(in Chinese).劉季平,何生根,呂培濤,等.二氯異氰脲酸鈉處理對香石竹切花的保鮮效應(yīng).園藝學(xué)報,2009, 36(1):121–126.

[16]Tang DT,Xu MX,Feng YH.In vitro floweringfrom explants in Dianthus chinensis L.and factors influenced flower formation.Acta Horticul Sin, 1996,23(3):277–280(in Chinese).唐定臺,徐民新,馮永紅.石竹試管花的誘導(dǎo)及其影響因子的研究.園藝學(xué)報,1996,23(3): 277–280.

[17]Wu Y,Dong J,Guo BL,et al.Estimating coldresistance of transgenic Dianthus chinese w ith CBF1 gene.Chin Agri Sci Bull,2007,23(5): 59–61(in Chinese).吳琰,董靜,郭寶林,等.轉(zhuǎn)CBF1基因地被石竹的抗寒性評價.中國農(nóng)學(xué)通報,2007,23(5): 59–61.

[18]Yu YX,Bao MZ.Integration of different T-DNA structures of ACC oxidase gene into carnation genome extended cut flower vase-life differently. Chin J Biotech,2004,20(5):704–707(in Chinese).余義勛,包滿珠.不同結(jié)構(gòu)的外源ACC基因?qū)胂闶駥ζ坎鍓勖挠绊?生物工程學(xué)報, 2004,20(5):704–707.

[19]Murashige T,Skoog F.A revised medium for rapid grow th and bioassays w ith tobacco tissue culture.Physiol Plant,1962,15(3):473–497.

[20]Edwards K,Johnstone C,Thompson C.A simple and rapid method for the preparation of plant genom ic DNA for PCR analysis.Nucleic Acids Res,1991,19(6):1349.

[21]Furner I,Huffman G,Amasino R,et al.An Agrobacterium transformation in the evolution of the genus Nicotiana.Nature,1986,319:422?427. [22]Tanaka N,Hayakawa M,Mano Y,et al.Infection of turnip and radish storage roots w ith Agrobacterium rhizogene s.Plant Cell Rep,1985, 4(2):74?77.

[23]Fan HQ,Yao QH,Peng RH,et al.A prelim inary study on carnation by Ri plasm id of Agrobacterium rhizogenes.Acta Agric Shanghai, 2001,17(1):35–38(in Chinese).范惠琴,姚泉洪,彭日荷,等.發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化康乃馨初步研究.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報,2001, 17(1):35–38.

[24]Bercetche J,Chriqui D,Adam S,et al. Morphogenetic and cellular reorientation induced by Agrobacterium rhizogenes(strains 1855,2659 and 8196)on carrot,pea and tobacco.Plant Sci, 1987,52(3):195–210.

[25]Ottaviani MP,Schel JHN,H?nisch Ten Cate Ch H. Variation in structure and plant regeneration of Agrobacterium rhizogenes transformed and control roots of the potato cv.Bintje.Plant Cell Tiss Org Cult,1990,20(1):25–34.

[26]Chen SY,Hou SS,Gui YL,et al.In vitro transformation of cotyledons and hypocotyls of Glycyrrhiza uralensis Fisch by Agrobacterium rhizogenes.J Wuhan Bot Res,1991,9(4): 301–304(in Chinese).陳士云,侯嵩生,桂耀林,等.發(fā)根土壤桿菌體外轉(zhuǎn)化甘草子葉及下胚軸.武漢植物學(xué)研究, 1991,9(4):301–304.

[27]Shi HP,Liang P,Quan H.Induction and culture of hairy roots in Phytolacca esculenta and its saponin production.Chin J Biotech,2003,19(1): 46–49(in Chinese).施和平,梁朋,權(quán)宏.商陸毛狀根的誘導(dǎo)、培養(yǎng)及其皂甙的產(chǎn)生.生物工程學(xué)報,2003,19(1): 46–49.

[28]Zhang JD,Yang XQ,Qiao AM,et al.Plant regeneration from hairy roots of Datura arborea L. J Tropic Subtropic Bot,2008,16(5):480–485(in Chinese).張繼棟,楊雪清,喬愛民,等.木本曼陀羅毛狀根植株再生體系的建立.熱帶亞熱帶植物學(xué)報, 2008,16(5):480–485.

[29]David C,Petit A,TempéJ.T-DNA length variability in mannopine hairy root:more than 50 kilo base pairs of pRi T-DNA can integrate in plant cells.Plant Cell Rep,1988,7(2):92–95.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Induction and in vitro culture of hairy roots of Dianthus caryophyllus and its p lant regeneration

Heping Shi,Yuanfeng Zhu,Bei Wang,Jiangbing Sun,and Shengqin Huang
Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development,College of Life Science,South China Normal University,Guangzhou 510631,Guangdong,China

To use Agrobacterium rhizogenes-induced hairy roots to create new germplasm of Dianthus caryophyllus,wetransformed D.caryophyllus w ith A.rhizogenes by leaf disc for plant regeneration from hairy roots.The white hairy roots could be induced from the basal surface of leaf explants of D.caryophyllus 12 days after inoculation w ith A.rhizogenes ATCC15834.The percentage of the rooting leaf explants was about 90%21 days after inoculation.The hairy roots could grow rapidly and autonomously in liquid or solid phytohormone-free MS medium.The transformation was confirmed by PCR amplification of rol gene of Ri plasm id and silica gel thin-layer chromatography of opines from D.caryophyllus hairy roots.Hairy roots could form light green callus after cultured on MS+6-BA 1.0?3.0 mg/L+NAA 0.1?0.2 mg/L for 15 days. The optimum medium for adventitious shoots formation was MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L,where the rate of adventitious shoot induction was 100%after cultured for 6 weeks.The mean number of adventitious shoot per callus was 30?40.The adventitious shoots can form roots when cultured on phytohormone-free 1/2 MS or 1/2 MS+0.5 mg/L NAA for 10 days.When the rooted plantlets transplanted in the substrate m ixed w ith perlite sand and peat(volume ratio of 1:2),the survival rate was above 95%.

Dianthus caryophyllus,Agrobacterium rhizogenes,hairy roots,plant regeneration

January 25,2014;Accep ted:June 9,2014

Heping Shi.Tel:+86-20-85214793;E-mail:shihp@scnu.edu.cn

施和平,朱遠鋒,王蓓,等.香石竹毛狀根誘導(dǎo)、離體培養(yǎng)及其植株再生.生物工程學(xué)報,2014,30(11):1742–1750.

Shi HP,Zhu YF,Wang B,et al.Induction and in vitro culture of hairy roots of Dianthus caryophyllus and its plant regeneration.Chin J Biotech,2014,30(11):1742–1750.

Suppo rted by:Comm ittee of Science and Technology in Guangdong Province,China(No.2011B020304006).

廣東省科技計劃項目(No.2011B020304006)資助。