半滑舌鰨稚魚脂肪分解關(guān)鍵酶基因的克隆及飼料中脂肪水平對其表達的調(diào)控?

艾慶輝，袁禹惠，麥康森，李松林，徐 瑋，張彥嬌，周慧慧

（中國海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東青島266003）

半滑舌鰨稚魚脂肪分解關(guān)鍵酶基因的克隆及飼料中脂肪水平對其表達的調(diào)控?

艾慶輝，袁禹惠，麥康森，李松林，徐 瑋，張彥嬌，周慧慧

（中國海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東青島266003）

克隆了半滑舌鰨脂肪分解關(guān)鍵酶基因即激素敏感脂肪酶（Hormone-sensitive lipase，HSL）和脂肪甘油三酯脂肪酶（Adipose triglyceride lipase，ATGL）cDNA部分序列，并探討了飼料中脂肪水平對半滑舌鰨稚魚HSL及ATGL基因表達的影響?？寺∷玫降腍SL和ATGL片段長度分別為589bp和581bp，序列和系統(tǒng)進化分析表明半滑舌鰨的HSL和ATGL與大部分魚類具有較高的同源性。采用不同水平的魚油配制成5種不同脂肪水平（6.68%、9.84%、13.47%、17.89%和21.88%干物質(zhì)）的等氮飼料，飼養(yǎng)35日齡半滑舌鰨稚魚30 d，養(yǎng)殖過程中每天飽食投喂5次，養(yǎng)殖實驗結(jié)束后采用實時熒光定量PCR分別測定各處理稚魚內(nèi)臟團的HSL及ATGL mRNA相對表達量。結(jié)果表明，高脂飼料組（21.88%）顯著促進了半滑舌鰨稚魚內(nèi)臟團HSL基因的表達（P＜0.05），但飼料脂肪水平對于半滑舌鰨稚魚內(nèi)臟團的ATGL表達量未產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05）。

激素敏感脂肪酶；脂肪甘油三酯脂肪酶；基因克隆及表達；半滑舌鰨；脂肪水平

甘油三酯（TG）主要以脂滴形式儲存在脂肪細胞的胞漿中，脂肪細胞脂滴內(nèi)所儲存的TG分解為游離脂肪酸（FFA）和甘油的過程，稱為脂肪分解或脂肪動員［1］。調(diào)節(jié)脂肪分解的限速酶主要包括經(jīng)典的激素敏感脂肪酶（Hormone-sensitive lipase，HSL）和2004年［2］才發(fā)現(xiàn)的脂肪甘油三酯脂肪酶（Adipose triglyceride lipase，ATGL）［2-4］，ATGL也被稱為含patatin樣磷脂酶結(jié)構(gòu)域酯酶2（Patatin-like phospholipase domaincontaining lipase 2，PNPLA2）、destnutrin或非鈣依賴磷酸酯酶ζ（ζ-isoform of a calcium-independent phospholipase A2，iPLA2ζ）［5］。HSL和ATGL均主要分布于脂肪組織，但在其他組織也有少量表達［1，6］。HSL可以水解多種底物，包括甘油三酯（TG）、甘油二酯（DG）、單?；视停∕G）、膽固醇酯以及其他酯質(zhì)。然而研究表明，在眾多底物中，HSL對TG的水解能力最弱，而DG是其水解率最高的底物［7］。與HSL不同，ATGL具有高度的底物特異性，它在TG的第一步水解反應(yīng)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，能特異性地將TG水解形成DG和FFA，但不能水解MG和膽固醇酯［2，4］。在許多哺乳動物上，已成功克隆到HSL和ATGL基因，并且許多研究表明HSL以及ATGL的轉(zhuǎn)錄水平受到激素水平、營養(yǎng)狀態(tài)等調(diào)控［8-13］。目前，在多種魚類上也已克隆到HSL和ATGL基因［13-18］。Han等［15］報道了高脂飼料促進了羅非魚肝臟及肌肉中HSL基因表達、抑制了腹腔脂肪中HSL的表達。Wang等［13］和吉紅等［18］的研究表明，飼料中的脂肪水平以及n-3長鏈多不飽和脂肪酸水平會顯著影響ATGL的基因表達。但在魚類上，飼料中營養(yǎng)素對于HSL和ATGL基因表達的調(diào)控研究還比較少，同時，在魚類上對比HSL和ATGL受到飼料中脂肪水平調(diào)控的研究還未見報道。

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaeυis）屬鰈形目（Pleuronectiformes）、舌鰨科（Cynoglossidae）、舌鰨屬（Cynoglossus），為我國近海底層的大型名貴經(jīng)濟鲆鰈魚類［19-20］。目前，人工養(yǎng)殖的魚類由于使用高脂及高植物油替代的飼料大多存在脂肪過量沉積的現(xiàn)象［21］，然而脂肪過量沉積可能會導(dǎo)致魚體產(chǎn)生脂肪肝等疾?。?2］，同時降低魚肉品質(zhì)［23］，進而影響?zhàn)B殖魚類的經(jīng)濟價值［13］。脂肪分解與脂肪沉積密切相關(guān)，因此，關(guān)于魚類脂肪分解及其調(diào)控機制的研究，對指導(dǎo)解決養(yǎng)殖魚類脂肪過量沉積問題具有重要的理論和實踐意義。但是在鲆蝶魚類上，關(guān)于營養(yǎng)素對脂肪分解關(guān)鍵酶基因表達的影響的研究還較少。此外，相比幼魚和成魚，稚魚生長快，代謝旺盛，對于飼料中營養(yǎng)素的調(diào)控更為敏感，因此本實驗采用舌鰨稚魚作為研究對象，通過克隆得到HSL和ATGL基因的核心序列，并探究飼料中不同脂肪水平對HSL及ATGL基因表達的影響，為進一步探討HSL和ATGL的作用機理及調(diào)控機制研究提供參考性資料。

1 材料與方法

1.1實驗動物及養(yǎng)殖條件

實驗用魚為購自山東省海陽市黃海水產(chǎn)有限公司的35日齡的半滑舌鰨稚魚，平均體重為（54±1）mg。養(yǎng)殖實驗也在山東省海陽市黃海水產(chǎn)有限公司進行。實驗開始時挑選外觀正常、體格健壯和活力充足的魚苗2 250尾，隨機分成15組，每組150尾，分別放于循環(huán)水系統(tǒng)中。實驗期間，水溫（23±1）℃，p H=8.0±0.2，鹽度30±3。

1.2內(nèi)臟團中總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

用Trizol試劑法提取半滑舌鰨稚魚內(nèi)臟團中的總RNA，并將提取的總RNA用DNase I（TaKaRa）處理去除RNA中可能存在的DNA污染。使用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，并采用NanoDrop

ND-1000（Wilmington，DE）確定RNA的質(zhì)量和濃度。取1μg RNA按照PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）（TaKaRa）說明書完成cDNA第一鏈的合成，保存于-20℃。

1.3脂肪分解關(guān)鍵基因ATGL及HSL核心序列的克隆

根據(jù)NCBI Genebank中的斑馬魚Danio rerio（XM_ 005158028）、金頭鯛Sparus aurata（EU254478）、斜帶石斑魚Epinephelus coioides（KF049203）以及人Homo sapiens（JF279441）、家牛Bos taurus（FJ897536）及大黃魚Larimichthys crocea（HQ916211）等物種的核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計HSL及ATGL的簡并引物（見表1）。

PCR反應(yīng)在Eppendorf Mastercycler gradient（Eppendorf，German）進行，反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃5 min，1個循環(huán)；變性94℃30 s，引物退火51.5℃30 s，引物延伸72℃1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，1個循環(huán)；4℃保存。用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測和回收目的基因條帶，然后將其連接到pEASY-T1載體（TransGen Biotech，China），轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細胞Escherichia coli TOP10中，經(jīng)培養(yǎng)后涂布氨芐培養(yǎng)基。挑選5個陽性克隆測序（上海博尚），使用BLAST網(wǎng)頁對測序結(jié)果進行比對分析（http：／／blast.ncbi. nlm.nih.gov／）。

1.4實時熒光定量PCR

以半滑舌鰨β-2微球蛋白（GenBank：FJ965561）基因作為內(nèi)參基因。根據(jù)已獲得的HSL、ATGL以及β-2微球蛋白序列，分別設(shè)計特異性引物（見表1）。反應(yīng)體系為25μL體系：1μL特異性引物（上游引物和下游引物，10μmol／L）、1μL模板cDNA、12.5μL 2× SYBR Premix Ex TaqTM（Takara，Japan）以及9.5μL無菌水。反應(yīng)條件為：95℃2 min；95℃10 s，58℃10 s，72℃20 s，40個循環(huán)。在每個PCR循環(huán)之后，通過溶解度曲線檢驗每個PCR反應(yīng)是否只有1個PCR產(chǎn)物。通過制作濃度標準曲線驗證目標序列與內(nèi)參序列的擴增效率是否一致，擴增效率計算公式為E=10（-1／Slope）-1［24］。本實驗中HSL、ATGL以及β-2微球蛋白的擴增效率分別為0.955 4，1.027 4和1.050 7。HSL以及ATGL的相對表達量采用2-ΔΔCt方法測定［25］。

表1 本實驗所使用的簡并引物和定量引物序列Table 1 Degenerated primers and real-time quantitative PCR primers used in this experiment

1.5飼料中脂肪水平對目的基因表達調(diào)控的研究

以脫脂白魚粉、酪蛋白、磷蝦粉、魷魚粉以及水解魚蛋白為主要蛋白源，以大豆卵磷脂和魚油為主要脂肪源。通過調(diào)節(jié)魚油水平設(shè)計5種不同脂肪水平（6.68%、9.84%、13.47%、17.89%和21.88%）的等氮微顆粒飼料（見表2），每個處理3個重復(fù)。每天人工投喂微顆粒飼料5次（6∶00、9∶00、15∶00、18∶00和 21∶00），飽食投喂，養(yǎng)殖周期30 d。實驗結(jié)束后，每組隨機選取6尾半滑舌鰨稚魚進行解剖，分離內(nèi)臟團于1.5 mL無RNase離心管中，并將離心管迅速放入液氮中，用于提取內(nèi)臟團總RNA。

1.6序列及數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用DNAman進行拼接和推導(dǎo)氨基酸序列，在ClustalW多重比對網(wǎng)頁上進行序列分析和比較，應(yīng)用MEGA5軟件N-J方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用Windows SPSS 19.0進行單因素方差分析（ANOVA），顯著水平為P＜0.05，數(shù)據(jù)表示為“平均值±標準誤”。

2 結(jié)果

2.1 ATGL及HSL核心序列克隆結(jié)果

PCR反應(yīng)得到的序列，經(jīng)過克隆測序，分別獲得長為589bp的HSL（KJ459044）和581bp的ATGL（KJ459046），它們分別編碼195和193個氨基酸（見圖1和2）。同源性比對可以看出，克隆得到的HSL片段與斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）HSL cDNA全序列（KF049203）相似性最高（99%），與金頭鯛（Sparus aurata）HSL片段（EU254478）相似性91%，與牙鲆（Paralichthys oliυaceus）HSL片段（AB828673）相似性為88%；克隆得到的ATGL片段與大黃魚（Larimichthys crocea）ATGL cDNA全序列（HQ916211）相似性84%，與鵪鶉（Coturnix coturnix）和人（Homo sapiens）ATGL cDNA全序列（GQ221783）相似性均為74%，與原雞（Gallus gallus）和家鼠（Mus musculus）ATGL cDNA全序列（NM_001163689）相似性均為73%。此結(jié)果顯示，人們用于RT-PCR的特異性引物序列正確，并克隆得到了實驗所需要的HSL和ATGL基因。

表2 實驗飼料配方及營養(yǎng)成分組成（干物質(zhì)）Table 2 Formulation and proximate analysis of the experimental diets（dry weight）／%

2.2 ATGL和HSL氨基酸序列系統(tǒng)進化分析

應(yīng)用MEGA5軟件N-J方法分別構(gòu)建了包括半滑舌鰨在內(nèi)的十余種脊椎動物的ATGL及HSL氨基酸序列系統(tǒng)進化樹（見圖3和4）。結(jié)果顯示：半滑舌鰨的HSL氨基酸序列與斜帶石斑魚、羅非魚、金頭鯛等大多數(shù)魚類的HSL序列可以聚為一支，而后與人、鼠等哺乳動物的HSL序列聚為一支，草魚的HSL氨基酸序列單獨成為一支；半滑舌鰨的ATGL氨基酸序列與斑馬宮麗魚及羅非魚聚為一支，再與大黃魚聚為一支，最后與鳥類（鵪鶉、原雞、綠頭鴨）和哺乳動物（人、羊、豬、鼠兔）聚為一支，長腭泥鰕虎魚的ATGL氨基酸序列單獨成為一支。

2.3不同脂肪水平對ATGL及HSL基因表達的影響

隨著飼料脂肪水平的升高，半滑舌鰨稚魚內(nèi)臟團HSL mRNA水平呈現(xiàn)升高的趨勢，且21.88%脂肪水平組HSL表達量顯著高于其他處理組（P＜0.05），但其他各處理組之間差異不顯著（P＞0.05）（見圖5）。與HSL有所不同，飼料脂肪水平對于半滑舌鰨稚魚內(nèi)臟團的ATGL表達量沒有產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05）（見圖6）。

圖1 半滑舌鰨HSL基因cDNA部分序列和翻譯的氨基酸序列Fig.1 The partial nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of cynoglossussemilaeυis HSL cDNA

圖2 半滑舌鰨ATGL基因cDNA部分序列和翻譯的氨基酸序列Fig.2 The partial nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of cynoglossussemilaeυis ATGL cDNA

圖3 根據(jù)NJ法構(gòu)建的ATGL氨基酸序列系統(tǒng)樹Fig.3 Phylogenetic tree showing the relationship of ATGL from cynoglossussemilaeυi s and other vertebrates on Neighbour-Joining method

圖4 根據(jù)NJ法構(gòu)建的HSL氨基酸序列系統(tǒng)樹Fig.4 Phylogenetic tree showing the relationship of HSL from cynoglossussemilaeυi s and other vertebrates on Neighbour-Joining method

圖5 飼料脂肪水平對半滑舌鰨稚魚內(nèi)臟團HSL基因表達的影響Fig.5 Effect of dietary lipid on HSL mRNA of larval cynoglossussemilaeυi s

圖6 飼料脂肪水平對半滑舌鰨稚魚內(nèi)臟團ATGL基因表達的影響Fig.6 Effect of dietary lipid on ATGL mRNA oflarval cynoglossussemilaeυi s

3 討論

HSL基因最早在大鼠中得到克隆和研究，隨后在人類、豬和小鼠中也檢測到該基因的存在［26］。根據(jù)目前Genebank的記錄，已經(jīng)在斜帶石斑魚、羅非魚、青鳉、黑棘鯛、金頭鯛以及草魚等魚類中分離到部分或全部HSL cDNA序列。ATGL基因由Zimmermann等［2］篩選脂肪酶基因及蛋白數(shù)據(jù)庫時發(fā)現(xiàn)，隨后在小鼠脂肪組織中第一次驗證并命名。目前在麗鯛、大黃魚、斑馬宮麗魚、青鳉、紅鰭東方鲀、羅非魚及長腭泥鰕虎魚等魚類中已克隆到部分或全部ATGL序列。Blast結(jié)果顯示，本實驗克隆到的半滑舌鰨HSL和ATGL基因序列片段與大部分魚類具有高度的相似性。此外，目前在虹鱒、河豚、青鳉、斑馬魚及牙鲆等魚類上克隆到了2種不同的HSL cDNA［14，27］，即HSL 1和HSL 2。Kittilson等［14］認為，由于親緣關(guān)系相近物種進化的一致性，很可能所有硬骨魚類都具有不止1個HSL轉(zhuǎn)錄本。因此，本實驗雖然只克隆到一種HSL轉(zhuǎn)錄本，但半滑舌鰨也可能存在其他HSL轉(zhuǎn)錄本。

從分子進化樹可以看出，大部分魚類如半滑舌鰨、斜帶石斑魚、羅非魚、青鳉、黑棘鯛及金頭鯛的HSL可以聚為一類，哺乳動物如人、猩猩和家鼠等的HSL聚為一類，而草魚的HSL單獨聚為一類，說明草魚的HSL在進化過程中較早分化出來，顯示了該酶進化的復(fù)雜性。與HSL類似，大部分魚類的ATGL可以聚為一類，哺乳動物和鳥類的ATGL分別聚為一類，但長腭泥鰕虎魚的HSL分化較早、單獨聚為一類?？傮w來看，半滑舌鰨HSL及ATGL氨基酸序列與大部分魚類進化關(guān)系較近，與哺乳動物的進化關(guān)系較遠，這與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和生化特征分類進化地位基本一致。

對哺乳動物的很多研究發(fā)現(xiàn)，HSL和ATGL均可受到飼料中營養(yǎng)水平的調(diào)節(jié)［28］。在本實驗中，高脂顯著促進了半滑舌鰨稚魚內(nèi)臟團HSL基因的表達，這與Han等［15］對羅非魚肝臟HSL基因表達研究的結(jié)果類似，說明在一定的高脂范圍，魚體會通過增加HSL基因的表達來緩解高脂造成的脂肪沉積。然而，在本實驗中，半滑舌鰨稚魚內(nèi)臟團ATGL基因的表達量并沒有受到飼料中脂肪水平的顯著影響。Wang等［13］報道，高脂會顯著降低大黃魚ATGL基因的表達。吉紅等［18］發(fā)現(xiàn)，草魚攝食n-3 LC-PUFA飼料后，在第1周和第2周ATGL基因的表達水平顯著高于對照組，但第3周后該基因的表達水平在處理組與對照組間無顯著差異。這些研究結(jié)果的不一致可能與實驗對象種類及規(guī)格、飼料所采用的油源以及養(yǎng)殖周期不盡相同有關(guān)。

ATGL和HSL均是脂肪組織甘油三酯動員的關(guān)鍵酶，但分別主要參與水解甘油三酯和甘油二酯［29］。HSL參與脂肪分解過程受到腎上腺素等促脂解激素的作用，其活性受到磷酸化和去磷酸化作用的調(diào)控［30］。ATGL發(fā)揮活性也受到激素的調(diào)節(jié)［29］，在小鼠上的研究發(fā)現(xiàn)ATGL也可以發(fā)生磷酸化和去磷酸化，但與HSL不同的是，其磷酸化過程不由PKA通路介導(dǎo)［2］。本實驗的對比結(jié)果顯示，半滑舌鰨稚魚飼喂不同脂肪水平的飼料后，HSL和ATGL在轉(zhuǎn)錄水平上的反饋調(diào)節(jié)并不一致，暗示調(diào)節(jié)HSL和ATGL基因表達的信號通路可能不同，而且半滑舌鰨稚魚可能不只通過轉(zhuǎn)錄水平，還通過其他水平（例如蛋白水平和磷酸化水平）調(diào)節(jié)機體的脂肪分解代謝。

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Lipolysis Related Genes Clone and Regulation by Dietary Lipid Level in Half-Smooth Tongue Sole（Cynoglossus Semilaevis）Larvae

AI Qing-Hui，YUAN Yu-Hui，MAI Kang-Sen，LI Song-Lin，XU Wei，ZHANG Yan-Jiao，ZHOU Hui-Hui（The Key Laboratory of Aquaculture Nutrition and Feed，Ministry of Agriculture，The Key Laboratory of Mariculture，Ministry of Education，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

The lipolysis related key enzymes，namely hormone-sensitive lipase（HSL）and adipose triglyceride lipase（ATGL），were cloned and the effects of dietary lipid level on HSL and ATGL genes expression were investigated in half-smooth tongue sole（Cynoglossus semilaeυis）larvae.The obtained partial cDNA of HSL and ATGL were 589bp and 581bp，respectively，and they shared high identities with many other fish species.A 30 day feeding trial was conducted to investigate the effects of dietary lipid level on HSL and ATGL genes expression.Five isoproteic diets were formulated with graded levels of lipid ranging from 6.68%to 21.88%dry weight.Each diet was randomly allocated to triplicate groups of 150 larval tongue sole（35 DAH，（54±1）mg）and fish were fed five times daily to apparent satiation during the feeding experiment.The relative mRNA expression level was decided by real-time quantitative polymerase chain reaction（qPCR）.Results showed that，high-lipid diet（21.88%）promoted HSL expression of larval visceral mass significantly（P＜0.05），while dietary lipid level did not affect the ATGL mRNA expression significantly（P＞0.05）.

hormone-sensitive lipase；adipose triglyceride lipase；gene clone and expression；Cynoglossussemilaeυis；dietary lipid

Q785；S 917.4

A

1672-5174（2014）10-065-07

責任編輯 朱寶象

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系—鲆鰈類體系建設(shè)專項（2010GB23600673）；國家科技支撐計劃項目（2011BAD13B01）資助

2014-07-10；

2014-09-05

艾慶輝（1972-），男，教授，博導(dǎo)。E-mail：qhai＠ouc.edu.cn