太平洋鱈魚(yú)腦中硫苷脂的分離純化和分析?

薛長(zhǎng)湖，宋 雨，徐 杰，賈子才，叢培旭

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）

太平洋鱈魚(yú)腦中硫苷脂的分離純化和分析?

薛長(zhǎng)湖，宋 雨，徐 杰，賈子才，叢培旭

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）

以太平洋鱈魚(yú)為原料，從鱈魚(yú)腦中分離硫苷脂，確立了提取及純化的條件，并對(duì)硫苷脂的純度和分子種進(jìn)行分析。首先，采用氯仿／甲醇（2∶1，v／v）提取總脂。然后，依次采用氯仿／甲醇／水（7∶3∶0.3，v／v／v）洗脫硅膠柱層析，含0.2 mol／L乙酸銨的氯仿／甲醇／水（30∶60∶8，v／v／v）洗脫DEAE Sephadex-A25離子交換柱層析，40%甲醇脫鹽和100%甲醇洗脫反相C8柱層析，獲得硫苷脂純品。最后，利用500YMC Diol液相色譜柱（3.0 mm×250 mm，5μm）分離，以正己烷／異丙醇（70∶30，v／v），異丙醇／水／甲酸／氨水（100∶13∶1∶0.14，v／v／v／v）為流動(dòng)相梯度洗脫，采用負(fù)電噴霧電離（ESI）和母離子掃描模式，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS／MS）法分析了鱈魚(yú)腦硫苷脂的純度和分子種組成，并比較了其與哺乳動(dòng)物腦中硫苷脂分子種組成的異同。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)制得的鱈魚(yú)腦硫苷脂純度為90.74%，與哺乳動(dòng)物類似，鱈魚(yú)腦硫苷脂的長(zhǎng)鏈堿基以鞘氨醇為主，主要分子種為d18∶1-C24∶1，但脂肪酸的羥基化程度略低，且含少量獨(dú)特的分子種，如d18∶1-22∶1和d18∶2-25∶2。

鱈魚(yú)腦；硫苷脂；分離純化；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；分子種

鱈形目魚(yú)類是海洋世界的大家族，已知約500余種，廣泛分布于世界各海域，是海洋漁業(yè)的主要捕撈對(duì)象。純正鱈魚(yú)指鱈屬（Gadus）魚(yú)類，包括太平洋鱈魚(yú)（Gadus macrocephalus）、大西洋鱈魚(yú)（Gadus morhua）和格陵蘭鱈魚(yú)（Gadus ogac）三大類［1］。太平洋鱈魚(yú)別稱大頭鱈（Pacific cod），廣泛分布于中國(guó)的黃、渤海地區(qū)，太平洋鱈魚(yú)除可以鮮食外還可加工成多種水產(chǎn)制品，鱈魚(yú)肝可用于提取魚(yú)肝油，鱈魚(yú)皮可用于制取明膠和膠原蛋白［2］，鱈魚(yú)骨可制備鱈魚(yú)骨鈣粉［3］，太平洋鱈魚(yú)具有潛在的巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

硫酸腦苷脂（簡(jiǎn)稱硫苷脂）是腦苷脂糖基的某一碳位的羥基被硫酸酯化所得的產(chǎn)物，是一種弱極性的鞘糖脂［4］。硫苷脂在生物界分布廣泛，主要存在于動(dòng)物體內(nèi)，特別在動(dòng)物腦中含量極為豐富，天然存在的硫苷脂最先發(fā)現(xiàn)于藻類，后來(lái)在軟體動(dòng)物［5-6］、軟骨魚(yú)和硬骨魚(yú)等無(wú)脊椎動(dòng)物［7-9］和哺乳動(dòng)物腦中也發(fā)現(xiàn)了硫苷脂。此外，硫苷脂也可通過(guò)化學(xué)法和酶法人工合成。硫苷脂生物活性獨(dú)特，其在體內(nèi)含量出現(xiàn)異常可能與Krabbe’s癥［10］、多發(fā)性硬化癥［11］、阿爾茲海默?。?2］以及Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病有關(guān)［13-14］，硫苷脂還會(huì)對(duì)表面介質(zhì)活性產(chǎn)生影響，具有促進(jìn)凝血、消炎的作用，并且對(duì)多種疾病如動(dòng)脈硬化、艾滋病、腫瘤等有一定的療效［15］，除此之外，硫苷脂還可增強(qiáng)生物體的機(jī)體免疫能力［16-17］。

海洋生物在復(fù)雜的生存環(huán)境與長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生許多陸地生物所不具有的獨(dú)特結(jié)構(gòu)和活性物質(zhì)。目前，由于我國(guó)水產(chǎn)品加工業(yè)中廢棄物的利用水平較低，導(dǎo)致大量的水產(chǎn)品下腳料無(wú)法得到有效地加工利用，這成為影響水產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵。以鱈魚(yú)加工為例，加工中產(chǎn)生的大量魚(yú)頭廢棄物未得到有效的利用。本文對(duì)太平洋鱈魚(yú)腦中硫苷脂的分離純化和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，這對(duì)于鱈魚(yú)加工中副產(chǎn)物的充分利用、鱈魚(yú)的高值化開(kāi)發(fā)和海洋新原料來(lái)源的發(fā)現(xiàn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

原料 新鮮太平洋鱈魚(yú)（Gadus macrocephalus）魚(yú)頭（購(gòu)于青島浩大實(shí)業(yè)有限公司）。

試劑 甲醇、氯仿（色譜純，德國(guó)Merck公司）、甲酸、氨水、正己烷、異丙醇（色譜純，美國(guó)Sigma公司）；Sulfatides標(biāo)準(zhǔn)品（Brain，Porcine，美國(guó)Avanti Polar Lipids公司）；HSGF254薄層硅膠板（煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所）；硅膠（300～400目，青島海洋化工廠）；反相C8硅膠填料（日本Fuji公司）；離子交換凝膠DEAE Sephadex-A25（GE Healthcare Bio-Sciences公司）；Supelclean ENVI-18 SPE（Tubes 3cc 500 mg，美國(guó)Supelco公司）；500YMC Diol分析柱（3.0 mm×250 mm，5μm）；0.22μm微孔濾膜（天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；甲醇、氯仿、超純水、乙酸銨、濃硫酸、無(wú)水乙醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

儀器 AL-204分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；RCT basic磁力攪拌器（德國(guó)IKA公司）；冷凍干燥機(jī)ALPHA1-4LD（德國(guó)CHRIST公司）；Elix5+Milli-QA超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；1260型高效液相色譜（美國(guó)Agilent公司）；G6410B三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總脂的提取 從新鮮太平洋鱈魚(yú)頭中分離出鱈魚(yú)腦，凍干，再采用氯仿／甲醇法進(jìn)行總脂提取，具體過(guò)程如圖1所示。取120 g凍干鱈魚(yú)腦，加入9倍體積的氯仿／甲醇（2∶1，v／v），在室溫下磁力攪拌1 h，過(guò)濾，濾渣再加入3倍體積氯仿／甲醇（2∶1，v／v）重復(fù)提取2遍，合并濾液。將合并溶液移入分液漏斗中再加入1／3體積10 g／L的Na2SO4溶液，充分萃取，靜置分層，收集下層有機(jī)相；上層再加入一定體積的氯仿，重復(fù)萃取2遍，最后將上下層合并，30℃旋蒸得到鱈魚(yú)腦總脂［18］。

圖1 從太平洋鱈魚(yú)腦中提取總脂的流程Fig.1 The extraction process of total lipid from the codfish brain

1.2.2 薄層色譜分析 樣品以氯仿溶解后，點(diǎn)樣于活化后的薄層色譜（TLC）板上，再以氯仿／甲醇／水（7∶3∶0.3，v／v／v）為展開(kāi)劑展開(kāi)。展開(kāi)后吹干，5%硫酸乙醇溶液110℃下顯色10 min。

1.2.3 硫苷脂分離純化

1.2.3.1硅膠柱層析 用50 mL氯仿溶解31 g鱈魚(yú)腦總脂，上樣于硅膠柱（80 mm×600 mm）中，依次用3倍柱體積的氯仿、氯仿／甲醇／水（80∶15∶1，v／v／v）、氯仿／甲醇／水（7∶3∶0.3，v／v／v）梯度洗脫，50 mL／瓶收集洗脫液，進(jìn)行TLC分析。將含硫苷脂的洗脫液合并，30℃下旋蒸至干，得到硫苷脂粗品。

1.2.3.2離子交換柱層析 將硫苷脂粗溶于氯仿／甲醇／水（30∶60∶8，v／v／v）后，上樣于DEAE Sephadex-A25離子交換柱（35 mm×600 mm）中，依次采用3倍體積的氯仿／甲醇／水（30∶60∶8，v／v／v）、含0.2 mol／mL乙酸銨的氯仿／甲醇／水（30∶60∶8，v／v／v）溶劑洗脫，控制流速2 mL／min，10 m L／管收集洗脫液，經(jīng)TLC分析，合并含硫苷脂的洗脫液，30℃下旋蒸至干，獲得較純的硫苷脂［19］。

1.2.3.3反相柱脫鹽 采用反相C8硅膠柱（25 mm× 560 mm）層析，先用500 mL 40%甲醇溶液平衡層析柱，樣品用40%甲醇溶解后上樣，500 mL 100%甲醇洗脫除去乙酸銨，再用500 mL 100%甲醇洗脫出硫苷脂，收集脫鹽后的硫苷脂溶液，30℃下旋蒸至干后，再加水超聲并凍干，得到鱈魚(yú)腦硫苷脂純品，稱量。

1.2.4 測(cè)定硫苷脂的純度和分子種 樣品處理：精確稱取1 mg鱈魚(yú)腦硫苷脂純品，溶于2 m L正己烷／異丙醇（7∶3，v／v）中，配制成500μg／mL的樣品溶液，4℃冷藏保存，待分析。

液相色譜-質(zhì)譜條件：500YMC Diol色譜柱（3.0 mm×250 mm，5μm），流速：0.5 mL／min，進(jìn)樣體積5μL；流動(dòng)相：A-正己烷／異丙醇（70∶30，v／v），B-異丙醇／水／甲酸／氨水（100∶13∶1∶0.14，v／v／v／v），梯度洗脫程序見(jiàn)表1。負(fù)電噴霧離子化（ESI）；一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍m／z 600～1 000；二級(jí)質(zhì)譜掃描范圍m／z 50～1 000；毛細(xì)管電壓4000V；噴霧氣壓40 psi；干燥氣流速9.0 L／min；氣體溫度350℃。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Adjustable gradient elution program

純度分析。硫苷脂標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過(guò)程如下：精確稱取1 mg硫苷脂標(biāo)準(zhǔn)品溶于1 mL正己烷／異丙醇（7∶3，v／v）中，梯度稀釋至500、250、50和10μg，另取1 mg純化后的硫苷脂樣品溶于1 mL正己烷／異丙醇（7∶3，v／v），每次進(jìn)樣5μL。根據(jù)硫苷脂標(biāo)準(zhǔn)品的提取離子色譜峰面積對(duì)含量做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相應(yīng)的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，再將硫苷脂樣品的提取離子色譜峰面積代入回歸方程，計(jì)算樣品純度。

分子種分析。采用正負(fù)離子模式分別分析硫苷脂標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜裂解規(guī)律。據(jù)此，在負(fù)離子模式下通過(guò)母離子掃描，找到樣品中不同硫苷脂分子種對(duì)應(yīng)的m／z，確定提取離子色譜峰面積。在正負(fù)離子模式下分別進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，進(jìn)一步確定長(zhǎng)鏈堿和脂肪酸的組成，從而確定其結(jié)構(gòu)和含量比例。

2 結(jié)果與討論

2.1鱈魚(yú)腦硫苷脂的分離純化結(jié)果

本文嘗試采用低毒高效的正己烷-異丙醇溶劑體系（3∶2，v／v）提取鱈魚(yú)腦中的總脂［20］。與傳統(tǒng)的氯仿／甲醇法作對(duì)照，分別取10 g凍干后的鱈魚(yú)腦進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)比較總脂提取率來(lái)評(píng)價(jià)2種提取方法的優(yōu)劣，以確定最終的提取體系。結(jié)果表明，以標(biāo)準(zhǔn)方法（氯仿-甲醇法）的提取率為100%計(jì)，正己烷／異丙醇法的相對(duì)提取率只有85.3%，故本文仍采用傳統(tǒng)的氯仿-甲醇法提取鱈魚(yú)腦總脂。

鱈魚(yú)腦總脂中含有游離脂肪酸、甘油酯、腦苷脂、磷脂等其他脂類，硅膠柱層析時(shí)，氯仿／甲醇／水（80∶15∶1，v／v／v）溶劑可將上述脂肪酸、甘油酯、腦苷脂等低極性脂類洗脫下來(lái)，再經(jīng)氯仿／甲醇／水（7∶3∶0.3，v／v／v）溶劑將硫苷脂成分洗脫出來(lái)，磷脂等其它極性脂類仍然保留在硅膠柱中。洗脫出的硫苷脂組分經(jīng)TLC檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)仍含有少量其他脂類。DEAE Sephadex-A25離子交換柱層析時(shí)，先采用氯仿／甲醇／水（30∶60∶8，v／v／v）洗脫，將不帶電荷的脂類去除，再采用含0.2 mol／mL乙酸銨的氯仿／甲醇／水（30∶60∶8，v／v／v）溶劑將帶有負(fù)電荷的硫苷脂洗脫出來(lái)。經(jīng)離子交換柱層析得到的硫苷脂中含有乙酸銨，為進(jìn)一步提高硫苷脂的純度，需要將乙酸銨脫除。

反相柱洗脫條件的確定。先將Supelclean ENVI-18 SPE柱活化，稱取含乙酸銨的硫苷脂5 mg，分別溶于3 mL不同濃度甲醇（100%，60%，40%），過(guò)膜，取1 mL上樣，再分別用3倍柱體積不同濃度的甲醇（100%，60%，40%）脫鹽，再用100%甲醇洗脫硫苷脂。將上述洗脫液分別進(jìn)行質(zhì)譜分析，采用負(fù)離子模式檢測(cè)硫苷脂特征碎片離子m／z 97，發(fā)現(xiàn)40%甲醇脫鹽效果較好且不會(huì)將硫苷脂組分洗脫下來(lái)，而100%甲醇可以將硫苷脂組分洗脫完全。最后，確定出硫苷脂的脫鹽和洗脫體系，并采用反相C8填料進(jìn)行大量樣品的脫鹽。

2.2鱈魚(yú)腦硫苷脂的純度分析

進(jìn)樣濃度在10～500μg范圍內(nèi)時(shí)，硫苷脂標(biāo)準(zhǔn)品都呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，y=5 600.8x+190 077（R= 0.995 5）。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得制備出的鱈魚(yú)腦硫苷脂純度為90.74%。

2.3鱈魚(yú)腦硫苷脂的分子種分析

2.3.1 一級(jí)質(zhì)譜分析 在負(fù)離子模式下，從母離子掃描圖譜（見(jiàn)圖2）看，硫苷脂的出峰時(shí)間在11～14 min，提取硫苷脂峰進(jìn)行分析，可以看到不同質(zhì)荷比的硫苷脂分子種（見(jiàn)圖3）。參考文獻(xiàn)［21-24］，對(duì)生物體內(nèi)硫苷脂分子脂肪酸和鞘氨醇部分的歸納以及個(gè)別硫苷脂分子的二級(jí)質(zhì)譜分析，推斷出8種鱈魚(yú)腦硫苷脂的主要分子種（見(jiàn)表2）。其中，m／z 888.9的硫苷脂分子種占鱈魚(yú)腦總硫苷脂的一半以上，為最主要的分子種形式。

2.3.2 二級(jí)質(zhì)譜分析 以［M-H］-m／z 888.9為例，在負(fù)離子模式下，硫苷脂分子碎裂產(chǎn)生硫酸半乳糖（m／z 241）、N-?；舅幔╩／z 390）和硫酸根（m／z 97）碎片（見(jiàn)圖4）。為了進(jìn)一步確定［M-H］-m／z 888.9硫苷脂分子種的脂肪酸和長(zhǎng)鏈堿結(jié)構(gòu)，通過(guò)正離子模式下的二級(jí)質(zhì)譜（見(jiàn)圖5），檢測(cè)到m／z 264碎片離子，該離子為d18∶1長(zhǎng)鏈堿的特征碎片。結(jié)合正負(fù)離子模式的二級(jí)質(zhì)譜，推斷出［M-H］-m／z 888.9對(duì)應(yīng)的硫苷脂分子種為d18∶1-24∶1。以此類推，得出其他不同m／z對(duì)應(yīng)的硫苷脂分子種。

圖2 負(fù)離子模式下鱈魚(yú)腦硫苷脂和硫苷脂標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of sulfatides from codfish brain and sulfatides standard in negative ion mode

圖3 鱈魚(yú)腦硫苷脂母離子掃描質(zhì)譜圖Fig.3 Precursor ion scan mass spectrogram of sulfatides from the codfish brain

圖4 負(fù)離子模式下硫苷脂分子d18∶1-24∶1的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.4 Negative MS2mass spectrum of d18∶1-24∶1 sulfatide

圖5 正離子模式下硫苷脂分子d18∶1-24∶1的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.5 Positive MS2mass spectrum of d18∶1-24∶1 sulfatide

表2 鱈魚(yú)腦的硫苷脂分子種Table 2 Sulfatide molecular species from the codfish brain

2.3.3 鱈魚(yú)腦硫苷脂和哺乳動(dòng)物腦硫苷脂的分子種比較 將鱈魚(yú)腦硫苷脂分子種與文獻(xiàn)［24］報(bào)道的豬腦、牛腦和兔腦等哺乳動(dòng)物硫苷脂分子種進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)腦中硫苷脂分子的長(zhǎng)鏈堿部分基本一致，大多為d18∶1，只有少數(shù)為d18∶2；在所有動(dòng)物腦中，d18∶1-24∶1都是最主要的分子種，比例都在30%以上。牛腦和兔腦中含24C脂肪酸的硫苷脂占70%以上，且脂肪酸的羥基化程度很高，而鱈魚(yú)腦中硫苷脂脂肪酸基本沒(méi)有羥基化。豬腦中含17種硫苷脂分子種；牛腦中含14種硫苷脂分子種；兔腦硫苷脂分子種與牛腦相似，有13種硫苷脂分子種，但［M-H］-m／z 906的硫苷脂分子含量明顯高于其他3種腦組織。通過(guò)比較來(lái)看，鱈魚(yú)腦硫苷脂有其它哺乳動(dòng)物不含的［M-H］-m／z 860.9（d18∶1-22∶1）、［M-H］-m／z 870.9（d18∶2-23∶2）和［M-H］-m／z 898.9（d18∶2-25∶2）3種硫苷脂分子，［M-H］-m／z 778.8（d18∶1-16∶0）和［M-H］-m／z 832.8（d18∶1-20∶1）所占比例遠(yuǎn)高于哺乳動(dòng)物。

3 結(jié)論

本文以太平洋鱈魚(yú)加工副產(chǎn)物鱈魚(yú)腦為研究對(duì)象，優(yōu)化了提取、純化硫苷脂的方法。通過(guò)3種柱層析的結(jié)合使用并嘗試不同的洗脫體系，確立了一套從動(dòng)物組織中有效提取、制備高純度硫苷脂的工藝路線。同時(shí)，采用靈敏、準(zhǔn)確的LC-MS／MS方法，分析了鱈魚(yú)腦硫苷脂的純度和分子種，并與哺乳動(dòng)物腦硫苷脂進(jìn)行比較，歸納出鱈魚(yú)腦硫苷脂的分子組成特點(diǎn)。本研究為鱈魚(yú)加工廢棄物的綜合利用和硫苷脂的活性研究提供了方法基礎(chǔ)。

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The lsolation and Molecular Species Analysis of Sulfatides from Codfish Brain

XUE Chang-Hu，SONG Yu，XU Jie，JIA Zi-Cai，CONG Pei-Xu
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

The objective of the research is to establish an efficient extraction and isolation workflow for purification of codfish sulfatides as well as procedures to determine the purity and molecular species of the purified sulfatides.The crude lipids extracted with chloroform／methanol（2∶1，v／v）were firstly applied to a normal phase silica column and fractions containing sulfatides were eluted with chloroform／methanol／water（7∶3∶0.3，v／v／v）.The fractions were combined and further applied to a DEAE-Sephadex A25 anion exchange column.Negative charged sulfatides were eluted with solvent chloroform／methanol／water（30∶60∶8，v／v／v）containing 0.2 mol／L ammonium acetate.Subsequent desalting procedure was achieved on a reversed chromatography by cleaning column with 40%methanol in water and recover sulfatides with methanol.The purity and molecular composition of purified sulfatides were determined by a normal phase liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry method.Gradient elution on a 500YMC Diol column（3.0 mm×250 mm，5μm）with solvent hexane／isopropanol（70∶30，v／v）and solvent isopropanol／water（100∶13，v／v）containing 0.8%formic acid and 0.1%aqueous ammonia can separate sulfatides successfully.Mass spectrometer was operated on negative ionization mode and the sulfatide molecules were detected by precursor ion scan.The purity of isolated codfish sulfatides is 90.74%. The most abundant molecule is d18∶1-C24∶1 and the major long chain base is sphingosine，both the characteristics are similar to mammalian sulfatides.However，the hydroxylation degree of fatty acids was lower than that of mammalian sulfatides，and unique molecules with structure d18∶1-C22∶1 and d18∶2-C25∶2 in lower content were also identified.

codfish brain；sulfatides；isolation and purification；liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry；molecular species

TS254.9

A

1672-5174（2014）10-051-06

責(zé)任編輯 朱寶象

長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（IRT1188）；“泰山學(xué)者”建設(shè)工程專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目資助

2014-08-03；

2014-09-24

薛長(zhǎng)湖（1964-），男，教授，博導(dǎo)。研究方向：水產(chǎn)品加工。E-mail：xuech＠ouc.edu.cn