AAV-ITR 單鏈DNA微載體在小鼠骨骼肌中的表達(dá)

朱冬琴，張?jiān)疲瑒悦?，張?/p>

中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所蘇州市分子診斷和治療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇蘇州215163

醫(yī)學(xué)與免疫生物技術(shù)

AAV-ITR 單鏈DNA微載體在小鼠骨骼肌中的表達(dá)

朱冬琴，張?jiān)疲瑒悦?，張?/p>

中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所蘇州市分子診斷和治療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇蘇州215163

AAV-ITR單鏈DNA微載體是一種基于腺相關(guān)病毒(AAV)倒置末端重復(fù)序列(ITR)的基因表達(dá)載體(AAV-ITR ssDNA m ini vector)。前期研究已證明AAV-ITR單鏈DNA微載體在HEK 293T細(xì)胞中具有較高的轉(zhuǎn)染、表達(dá)效率。本文中將相同拷貝數(shù)的AAV-ITR單鏈DNA微載體、3?-ITR末端錯(cuò)配的AAV-ITR單鏈DNA微載體(AAV-ITRmm ssDNA mutant vector)、AAV-ITR雙鏈DNA和質(zhì)粒分別用TurboFect轉(zhuǎn)入小鼠骨骼肌中，比較檢測(cè)AAV-ITR單鏈DNA微載體與其他基因表達(dá)載體在小鼠體內(nèi)1周、1個(gè)月及3個(gè)月的表達(dá)效率。組織切片經(jīng)熒光顯微鏡觀察及熒光灰度值分析表明，相同分子摩爾數(shù)的AAV-ITR單鏈DNA微載體比AAV-ITR雙鏈DNA和質(zhì)粒在不同時(shí)期表達(dá)效率都要高且更穩(wěn)定。提取注射3個(gè)月后的肌肉組織的DNA，用熒光定量PCR分析比較各載體的存留分子數(shù)。RT-PCR的結(jié)果顯示AAV-ITR單鏈DNA微載體在注射3個(gè)月后的存留分子數(shù)較其他載體高。綜合結(jié)果顯示AAV-ITR單鏈DNA微載體在動(dòng)物體內(nèi)具有表達(dá)效率高和長(zhǎng)久穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)，有可能開(kāi)發(fā)為基因治療的一種高效、穩(wěn)定的新型載體。

腺相關(guān)病毒(AAV)，倒置末端重復(fù)序列(ITR)，基因表達(dá)微載體，體內(nèi)表達(dá)，RT-PCR,基因治療

目前用于基因治療的載體主要有病毒載體(如逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒等)和非病毒載體(如質(zhì)粒載體)[1-6]。病毒載體雖然效率高但容易引起不同程度的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，而且還存在插入突變、致癌等風(fēng)險(xiǎn)[7-9]。一些病毒載體還有包裝基因容量的限制，如腺相關(guān)病毒(AAV)載體，最大包裝容量?jī)H4.7 kb[10]。而且，病毒基因載體的包裝、生產(chǎn)復(fù)雜繁瑣，不利于大規(guī)模的生產(chǎn)和臨床使用。質(zhì)粒載體雖然制備簡(jiǎn)單[11]，但它們的轉(zhuǎn)染效率低[12]。而且質(zhì)粒載體中有質(zhì)粒復(fù)制序列，抗菌素抗性選擇基因等大量細(xì)菌DNA，特別是細(xì)菌DNA序列中CpG序列的含量是哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA的4倍，會(huì)引起機(jī)體的組織免疫反應(yīng)、細(xì)胞炎癥和基因表達(dá)的沉默化[13-14]。另外質(zhì)粒載體分子量較大，需要較多的非病毒轉(zhuǎn)染試劑包裝攜帶，從而很容易產(chǎn)生細(xì)胞毒性[13-14]。因此，安全高效的基因治療載體是當(dāng)今基因治療領(lǐng)域需要突破的一個(gè)瓶頸。

AAV基因組中的倒置末端重復(fù)序列(ITR)為125 nt的核苷酸序列，能形成自我互補(bǔ)的倒T型發(fā)夾結(jié)構(gòu)[8-9]。ITR的發(fā)夾結(jié)構(gòu)不僅可以引發(fā)AAV的基因組合成第二條鏈，還可幫助其在細(xì)胞中形成穩(wěn)定的環(huán)狀多聚體和類染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而使外源基因能持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)[10,15]。我們利用ITR的這種結(jié)構(gòu)和功能優(yōu)勢(shì)，結(jié)合微環(huán)狀DNA(M inicircle DNA)載體[16-19]的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出AAV-ITR單鏈DNA微載體(AAV-ITR ssDNA m ini vector)[20]。AAV-ITR單鏈DNA微載體含有一個(gè)單鏈基因表達(dá)框，表達(dá)框兩端為AAV基因組的ITR序列。另外，有研究證明ITR中的D序列會(huì)阻礙AAV第二鏈的合成，從而阻礙基因的表達(dá)[8-9]。所以AAV-ITR單鏈DNA微載體中ITR的D序列均被除去，以獲得第二鏈的快速合成，使基因得到高效表達(dá)。前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明去除了D序列的AAV-ITR單鏈DNA微載體在HEK 293T細(xì)胞中的確具有更高的表達(dá)效率[20]。

本實(shí)驗(yàn)主要是檢測(cè)AAV-ITR單鏈DNA微載體在小鼠骨骼肌中的表達(dá)效率。將相同拷貝數(shù)的AAV-ITR單鏈DNA微載體、AAV-ITR雙鏈DNA和質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入小鼠骨骼肌中，同時(shí)以相同拷貝數(shù)的ITR末端錯(cuò)配的AAV-ITR單鏈DNA微載體(AAV-ITRmm ssDNA mutant vector)作為對(duì)照，檢測(cè)AAV-ITR單鏈DNA微載體在小鼠體內(nèi)不同時(shí)期的表達(dá)效率。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法比較分析了3種載體在注射第3個(gè)月后的載體分子數(shù)。綜合結(jié)果表明AAV-ITR單鏈DNA微載體比AAV-ITR雙鏈DNA和質(zhì)粒在不同時(shí)期表達(dá)效率都要高且更穩(wěn)定。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

pUC57-m inivector-EGFP質(zhì)粒、pUC57-m inivector-EGFP-mutant質(zhì)粒、大腸桿菌sure由蘇州醫(yī)工所醫(yī)學(xué)制品檢驗(yàn)室構(gòu)建保存，HEK293T細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，胎牛血清購(gòu)自Gibico公司。限制性內(nèi)切酶NotⅠ、SmaⅠ購(gòu)自Fermentas公司。Goldview染料購(gòu)自Solarbio公司，瓊脂糖粉購(gòu)自Biowest公司，TurboFect in vivo transfection reagent購(gòu)自Thermo公司，多聚甲醛、水合氯醛、氯化鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純以上。核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL5 000 marker)購(gòu)自TaKaRa公司，質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司。DNeasy Blood&Tissue Kit購(gòu)自QIAGEN公司，GoTaq qPCR Master M ix購(gòu)自Promega公司。4?5周ICR雄性小鼠、高壓飼料、進(jìn)口墊料、小鼠籠等購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，微量注射器購(gòu)自Ham ilton公司。

1.2 載體的制備及鑒定

首先，將本研究中涉及的基因表達(dá)載體，包括pUC57-minivector-EGFP質(zhì)粒、AAV-ITR雙鏈DNA、AAV-ITR單鏈DNA微載體、ITR末端錯(cuò)配的AAV-ITR單鏈DNA微載體進(jìn)行制備和鑒定。pUC57-m inivector-EGFP質(zhì)粒(圖1A)由本實(shí)驗(yàn)已構(gòu)建，通過(guò)轉(zhuǎn)化sure大腸桿菌直接擴(kuò)增，再用Axygen大抽試劑盒提取。通過(guò)SmaⅠ酶切、Goldview染色電泳檢測(cè)鑒定ITR是否完整。pUC57-m inivector-EGFP通過(guò)NotⅠ酶切，膠回收得到AAV-ITR雙鏈DNA(圖1B)。AAV-ITR雙鏈DNA 95℃變性5 m in后，迅速置于冰上冷卻5 m in，得到AAV-ITR單鏈DNA微載體(圖1C)。Goldview染色電泳檢測(cè)雙鏈DNA及通過(guò)熱變性得到的微載體片段，再經(jīng)過(guò)體外轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞檢測(cè)GFP的表達(dá)。ITR末端錯(cuò)配的AAV-ITR單鏈DNA微載體(圖1D)的制備和鑒定同上。

1.3 基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染ICR小鼠骨骼肌

通過(guò)如下公式，計(jì)算相同拷貝數(shù)下的各載體用量。樣品拷貝數(shù)(copies/μL)=樣品濃度(ng/μL)×10–9×6.02×1023(阿伏伽德羅常數(shù))/樣品分子量(堿基對(duì)數(shù)bp×648)。取相同拷貝數(shù)的AAV-ITR單鏈DNA微載體、AAV-ITR雙鏈DNA、pUC57-m inivector-EGFP質(zhì)粒、ITR末端錯(cuò)配的AAV-ITR單鏈DNA微載體分別轉(zhuǎn)染ICR小鼠骨骼肌。

圖1 AAV-ITR各載體的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The diagram of different AAV-ITR vectors.(A)pUC57-m inivector-EGFP.(B)AAV-ITR double strand DNA. (C)AAV-ITR single strand DNA m ini vector.(D)AAV-ITRmm ssDNA mutant vector.

注射1周表達(dá)效果檢測(cè)：將4?5周的ICR雄性小鼠按體重年齡平均分成13個(gè)組，每組3只。第一組為空白對(duì)照，第二組到第四組分別注射DNA拷貝數(shù)呈梯度上升的AAV-ITR單鏈DNA微載體2×1012copies(2 μg)、5×1012copies (5 μg)、1×1013copies(10 μg)，第五組到第七組分別注射DNA拷貝數(shù)呈梯度上升的AAV-ITR雙鏈DNA 2×1012copies(4 μg)、5×1012copies (10 μg)、1×1013copies(20 μg)，第八組到第十組分別注射DNA拷貝數(shù)呈梯度上升的pUC57-m inivector-EGFP質(zhì)粒2×1012copies (10 μg)、5×1012copies(25 μg)、1×1013copies (50 μg)，第十一組到第十三組分別注射DNA拷貝數(shù)呈梯度上升的ITR末端錯(cuò)配的AAV-ITR單鏈DNA微載體AAV-ITR 2×1012copies(2 μg)、5×1012copies(5 μg)、1×1013copies(10 μg)。上述十三組于1周后處死，取相應(yīng)的骨骼肌置于1%多聚甲醛中固定。

注射1個(gè)月表達(dá)效果檢測(cè)：將4?5周的ICR雄性小鼠按體重年齡平均分成10個(gè)組，每組3只。第一組為空白對(duì)照，第二組到第四組分別注射DNA拷貝數(shù)呈梯度上升的AAV-ITR單鏈DNA微載體2×1012copies(2 μg)、5×1012copies (5 μg)、1×1013copies(10 μg)，第五組到第七組分別注射DNA拷貝數(shù)呈梯度上升的AAV-ITR雙鏈DNA 2×1012copies(4 μg)、5×1012copies (10 μg)、1×1013copies(20 μg)，第八組到第十組分別注射DNA拷貝數(shù)呈梯度上升的pUC57-minivector-EGFP質(zhì)粒2×1012copies(10 μg)、5×1012copies(25 μg)、1×1013copies(50 μg)。上述十組于1個(gè)月后處死，取相應(yīng)的骨骼肌置于1%多聚甲醛中固定。

注射3個(gè)月表達(dá)效果檢測(cè)：將4?5周的ICR雄性小鼠按體重年齡平均分成4個(gè)組，每組3只。第一組為空白對(duì)照，第二組注射1×1013copies(10 μg)的AAV-ITR單鏈DNA微載體，第三組注射1×1013copies(20 μg)的AAV-ITR雙鏈DNA，第四組注射1×1013copies(50 μg)的pUC57-minivector-EGFP質(zhì)粒。上述四組于3個(gè)月后處死，取相應(yīng)的骨骼肌置于1%多聚甲醛中固定。

轉(zhuǎn)染試劑采用TurboFect in vivo transfection reagent。轉(zhuǎn)染方法如下：例如將10 μg的質(zhì)粒DNA用5%的滅菌葡萄糖溶液補(bǔ)至100 μL，渦旋振蕩充分混勻。加入1.2 μL的TurboFect試劑并渦旋混勻。于室溫中靜置20 m in。然后用微量注射器注入小鼠后腿肌肉中。其余實(shí)驗(yàn)組中的TurboFect的用量隨轉(zhuǎn)染用的DNA拷貝數(shù)的比例擴(kuò)大。

1.4 制作石蠟切片及熒光顯微分析

將固定后的肌肉組織沖洗后進(jìn)行脫水和硬化，二甲苯透明20 m in，石蠟浸滲5 h。浸蠟完全后再用石蠟包埋，最后再按4 μm厚度從不同角度進(jìn)行切割。撈起切片后寫(xiě)上編號(hào)。將石蠟切片至于熒光顯微鏡(ZEISS)下觀察并拍攝熒光圖(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)507 nm)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

將拍攝得到的熒光圖通過(guò)Image J(National institutes of health)測(cè)量其平均灰度值(Ostu校準(zhǔn)方法)，用以反映不同載體的表達(dá)強(qiáng)度。得到的熒光灰度值再進(jìn)行方差分析(SPSS 17.0 Inc，Chicago，USA)并繪制柱狀圖以比較各載體的表達(dá)效率。

1.6 Real-time PCR比較分析pUC57-m inivector-EGFP、AAV-ITR dsDNA和AAV-ITR ssDNA m ini vector注射3個(gè)月后的載體存留分子數(shù)

收取注射了1×1013copies、周期為3個(gè)月的AAV-ITR單鏈DNA微載體、AAV-ITR雙鏈DNA和pUC57-m inivector-EGFP小鼠骨骼肌。然后用QIAGEN DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA抽提。設(shè)計(jì)并合成一對(duì)GFP片段引物(由上海生工生物工程合成)，F(xiàn)5??3?GCTCCTCCCAGACAACCA，R5??3?CAGCAGCGGTCACAAACT。最后，以SYBGreen為熒光染料進(jìn)行Real-time PCR，比較3種載體的相對(duì)含量。

2 結(jié)果

2.1 各表達(dá)載體注射小鼠1周表達(dá)結(jié)果

注射1周小鼠骨骼肌切片的熒光顯微鏡分析和熒光灰度值分析結(jié)果顯示(圖2)，AAV-ITR雙鏈DNA(圖2A,b1?b3)，pUC57-minivector-EGFP質(zhì)粒(圖2A,c1?c3)和AAV-ITR單鏈DNA微載體(圖2A,a1?a3)的GFP表達(dá)強(qiáng)度從DNA低拷貝數(shù)2×1012copies到高拷貝數(shù)1×1013copies呈現(xiàn)出遞增的趨勢(shì)?？截悢?shù)為1×1013copies時(shí)，雙鏈DNA表達(dá)相對(duì)弱(圖2A，b3)，質(zhì)粒的熒光強(qiáng)度與單鏈微載體的相當(dāng)(圖2A，a3?c3)，且都比較高。ITR末端錯(cuò)配的AAV-ITR單鏈DNA微載體(圖2A，d1?d3)GFP蛋白表達(dá)均不高。正如熒光灰度值分析結(jié)果顯示(圖2B)，1×1013copies的AAV-ITR單鏈DNA微載體的灰度值最高，質(zhì)粒其次，雙鏈DNA的表達(dá)較低，ITR末端錯(cuò)配的AAV-ITR單鏈DNA微載體表達(dá)最低。

2.2 各表達(dá)載體注射小鼠1個(gè)月表達(dá)結(jié)果

注射1個(gè)月小鼠骨骼肌切片的熒光顯微鏡分析和熒光灰度分析結(jié)果顯示(圖3)，低拷貝數(shù)2×1012copies和5×1012copies用量的載體表達(dá)較弱(圖3A，a1?2,b1?2，c1?2)。在1×1013copies用量下，雙鏈DNA的熒光強(qiáng)度與質(zhì)粒相當(dāng)(圖3A，b3：c3)，而AAV-ITR單鏈DNA微載體(圖3A，a3)熒光最強(qiáng)。熒光灰度值分析(圖3B)也顯示，雙鏈DNA的灰度值與質(zhì)粒相當(dāng)，1×1013copies的AAV-ITR單鏈DNA微載體的GFP表達(dá)是最高的。低拷貝數(shù)的載體表達(dá)很低，與空白對(duì)照相差不大，且不同載體在低拷貝數(shù)下的表達(dá)沒(méi)有明顯差別。

圖2 AAV-ITR單鏈DNA微載體、ITR末端錯(cuò)配的AAV-ITR單鏈DNA微載體、AAV-ITR雙鏈DNA和質(zhì)粒載體在小鼠骨骼肌中一周的GFP表達(dá)Fig.2 The GFP expression of AAV-ITR ssDNA mini vector,AAV-ITR dsDNA,pUC57-minivector-EGFP and AAV-ITRmm ssDNA mutant vector in mice skeletal muscle one week after injection.(A)Fluorescence microscope pictures,50×.a1?3:GFP expression ofAAV-ITR ssDNAmini vector w ith 2×1012copies,5×1012copies,1×1013copies respectively;b1?3:GFP expression of AAV-ITR dsDNA mini vector w ith 2×1012copies,5×1012copies,1×1013copies respectively;c1?3:GFP expression of pUC57-minivector-EGFP plasmid w ith 2×1012copies,5×1012copies,1×1013copies respectively;d1?3:GFP expression of AAV-ITRmm ssDNA mutant vector w ith 2×1012copies,5×1012copies,1×1013copies respectively.(B)The average GFP fluorescence strength of ssDNA mini vector,AAV-ITR dsDNA mini vector,pUC57-minivector-EGFP and AAV-ITRmm ssDNA mutant vector in ICRmice skeletal muscle.

圖3 AAV-ITR單鏈DNA微載體、AAV-ITR雙鏈DNA和質(zhì)粒載體在小鼠骨骼肌中一個(gè)月的GFP表達(dá)Fig.3 The GFP expression of AAV-ITR ssDNA m ini vector,AAV-ITR dsDNA and pUC57-m inivector-EGFP in m ice skeletal muscle one month after injection.(A)Fluorescence m icroscope pictures，50×.a1?3:GFP expression of AAV-ITR ssDNA m ini vector w ith 2×1012copies,5×1012copies,1×1013copies respectively;b1?3:GFP expression of AAV-ITR dsDNA m ini vector w ith 2×1012copies,5×1012copies,1×1013copies respectively;c1?3:GFP expression of pUC57-m inivector-EGFP plasm id w ith 2×1012copies,5×1012copies,1×1013copies respectively.(B)The average green GFP fluorescence strength of ssDNA m ini vector,AAV-ITR dsDNA m ini vector and pUC57-m inivector-EGFP in ICR m ice skeletal muscle.

2.3 各表達(dá)載體注射小鼠3個(gè)月表達(dá)結(jié)果

為了檢測(cè)AAV-ITR單鏈DNA微載體能否像AAV病毒載體那樣能在體內(nèi)較長(zhǎng)時(shí)期地表達(dá)，實(shí)驗(yàn)比較分析了高拷貝數(shù)1×1013copies的AAV-ITR單鏈DNA微載體在小鼠骨骼肌中3個(gè)月的表達(dá)。骨骼肌切片的熒光顯微鏡分析和熒光灰度值分析結(jié)果顯示(圖4)，在高拷貝數(shù)1×1013copies下，AAV-ITR單鏈DNA微載體(圖4A,a)熒光強(qiáng)度在3個(gè)月后仍保持很強(qiáng)，與相同分子摩爾數(shù)質(zhì)粒和雙鏈AAV-ITR DNA載體比較，其表達(dá)效率最高，質(zhì)粒最低(圖4A,c)?；叶确治?圖4B)也表明，AAV-ITR單鏈DNA微載體的GFP表達(dá)水平最高，質(zhì)粒的表達(dá)水平接近空白對(duì)照，而雙鏈DNA表達(dá)水平也很低，略高于質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AAV-ITR單鏈DNA微載體在體內(nèi)也能長(zhǎng)久穩(wěn)定地表達(dá)。

2.4 不同注射量的各表達(dá)載體的表達(dá)效率綜合比較分析

1月與1周各載體表達(dá)的熒光圖對(duì)比(如圖5A)所示，在最高拷貝數(shù)1×1013copies用量下，質(zhì)粒(圖5A,c3-c3′)熒光下降最明顯，AAV-ITR雙鏈DNA的熒光(圖5A,b3-b3′)反而有所增強(qiáng)，而AAV-ITR單鏈DNA微載體的熒光(圖5A,a3-a3′)略有下降，但仍是三者中最強(qiáng)的。正如熒光灰度分析比較(圖5B)所反映的，AAV-ITR單鏈DNA和質(zhì)粒的熒光表達(dá)均有不同程度的下降。其中，單鏈DNA微載體的熒光強(qiáng)度下降不明顯，而質(zhì)粒下降較明顯。唯一不同的是，1個(gè)月后雙鏈DNA的熒光表達(dá)反而上升。

圖4 AAV-ITR單鏈DNA微載體、AAV-ITR雙鏈DNA和質(zhì)粒載體在小鼠骨骼肌中三月的GFP表達(dá)Fig.4 The GFP expression of AAV-ITR ssDNA m ini vector,AAV-ITR dsDNA and pUC57-m inivector-EGFP in m ice skeletal muscle three months after injection.(A)Fluorescence m icroscope pictures，50×.Nc:negative control;a: GFP expression of AAV-ITR ssDNA m ini vector w ith 1×1013copies;b:GFP expression of AAV-ITR dsDNA m ini vector w ith 1×1013copies;c:GFP expression of pUC57-m inivector-EGFP plasm id w ith1×1013copies.(B)The average green GFP fluorescence strength of ssDNA m ini vector,AAV-ITR dsDNA m ini vector and pUC57-m inivector-EGFP in ICR m ice skeletal muscle.

圖5 AAV-ITR單鏈DNA微載體、AAV-ITR雙鏈DNA和質(zhì)粒載體在1周和1個(gè)月的GFP表達(dá)比較分析Fig.5 The difference of GFP expression of AAV-ITR ssDNA m ini vector,AAV-ITR dsDNA and pUC57-m inivector-EGFP in m ice skeletal muscle between one week and one month after injection.(A)Fluorescence m icroscope pictures,50×.a1?3:GFP expression of AAV-ITR ssDNA m ini vector w ith 2×1012copies,5×1012copies, 1×1013copies respectively;b1?3:GFP expression of AAV-ITR dsDNA m ini vector w ith 2×1012copies,5×1012copies, 1×1013copies respectively;c1?3:GFP expression of pUC57-m inivector-EGFP plasm id w ith 2×1012copies,5×1012copies,1×1013copies respectively;a′1?3:GFP expression of AAV-ITR ssDNA m ini vector w ith 2×1012copies,5×1012copies,1×1013copies respectively;b′1?3:GFP expression of AAV-ITR dsDNA m ini vector w ith 2×1012copies, 5×1012copies,1×1013copies respectively;c′1?3:GFP expression of pUC57-m inivector-EGFP plasm id w ith 2×1012copies,5×1012copies,1×1013copies respectively.(B)The comparison of average green GFP fluorescence strength of ssDNA m ini vector,AAV-ITR dsDNA m ini vector and pUC57-m inivector-EGFP between one week and one month in ICR m ice skeletal muscle.

3種載體在最高拷貝數(shù)1×1013copies時(shí)1周、1月和3月的熒光顯微分析和熒光灰度分析差異顯示(圖6A)，從1月到3月，1×1013copies的各載體都有一定程度的下降。其中，質(zhì)粒(圖6A，c2?c3)下降最顯著，AAV-ITR雙鏈DNA(圖6A，b2?b3)也下降許多，而AAV-ITR單鏈DNA微載體(圖6A，a2?a3)雖有所下降，但仍是表達(dá)最強(qiáng)的。熒光灰度差異結(jié)果顯示(圖6B)，從1周到3個(gè)月，質(zhì)粒的表達(dá)逐漸下降，到第3個(gè)月時(shí)幾乎與空白對(duì)照相當(dāng)。而1個(gè)月表達(dá)有所上升的雙鏈DNA在第3個(gè)月時(shí)也下降到很低。只有AAV-ITR單鏈DNA微載體的表達(dá)稍穩(wěn)定，1個(gè)月時(shí)下降不明顯，到第3個(gè)月時(shí)雖有下降但仍是表達(dá)最高的。這說(shuō)明AAV-ITR單鏈DNA微載體相對(duì)而言具有高表達(dá)效率和長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)的特點(diǎn)。

2.5 Real-tim e PCR比較分析注射3個(gè)月后各載體的存留分子數(shù)

三種載體RT-PCR的結(jié)果如圖7所示，從擴(kuò)增曲線(圖7A)中可以看出，空白對(duì)照組中因?yàn)闆](méi)有目的GFP基因的存在而圖線雜亂。而其他載體均能正常擴(kuò)出。各載體的CT值如表1所示，未注射載體的空白樣品的CT值因?yàn)闆](méi)有GFP基因而無(wú)法測(cè)定。注射了1×1013copies的AAV-ITR單鏈DNA微載體的樣品CT值最小，為25.28。而AAV-ITR雙鏈DNA和pUC57-minivector-EGFP的載體殘余量較少，CT值為28.86和32.15，即質(zhì)粒最后剩余的含量最低。說(shuō)明AAV-ITR單鏈DNA微載體在小鼠骨骼肌中最穩(wěn)定，在細(xì)胞中能長(zhǎng)期穩(wěn)定存在。上述RT-PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳的結(jié)果如圖7B所示，AAV-ITR單鏈DNA微載體的PCR產(chǎn)物條帶最亮(圖7B，泳道2)。pUC57-m inivector-EGFP.(B)The electrophoresis of products from RT-PCR of AAV-ITR ssDNA m ini vector, AAV-ITR dsDNA and pUC57-m inivector-EGFP.M:marker;1:control;2:the product from Real-time PCR of AAV-ITR ssDNA m ini vector;3:the product from Real-time PCR of pUC57-m inivector-EGFP;4:the product from Real-time PCR of AAV-ITR dsDNA.

圖6 AAV-ITR單鏈DNA微載體、AAV-ITR雙鏈DNA和質(zhì)粒載體在1周、1個(gè)月和3個(gè)月的GFP表達(dá)比較分析Fig.6 The difference of GFP expression of AAV-ITR ssDNA m ini vector,AAV-ITR dsDNA and pUC57-m inivector-EGFP in m ice skeletal muscle among one week,one month and three months after injection.(A) Fluorescence m icroscope pictures,50×.a1?3:GFP expression of AAV-ITR ssDNA m ini vector w ith 1×1013copies in one week,one month and three months;b1?3:GFP expression of AAV-ITR dsDNA m ini vector w ith 1×1013copies in one week,one month and three months;c1?3:GFP expression of pUC57-m inivector-EGFP plasm id w ith 1×1013copies in one week,one month and three months.(B)The comparison of average green GFP fluorescence strength of ssDNA m ini vector,AAV-ITR dsDNA m ini vector and pUC57-m inivector-EGFP among one week,one month and three months in ICR m ice skeletal muscle.

圖7 AAV-ITR單鏈DNA微載體、AAV-ITR雙鏈DNA和pUC57-m inivector-EGFP三個(gè)月后存留分子數(shù)的RT-PCR分析Fig.7 Comparison of the residue of AAV-ITR ssDNA m ini vector,AAV-ITR dsDNA and pUC57-m inivector-EGFP three months after injection by RT-PCR.(A)The amplification plot of AAV-ITR ssDNA m ini vector,AAV-ITR dsDNA and pUC57-m inivector-EGFP by RT-PCR.a:AAV-ITR ssDNA m ini vector;b:AAV-ITR dsDNA;c:

S a m p l e C T ( C y c l e ) 1 2 3 x s ± C o n t r o l U n d e t e r m i n e d U n d e t e r m i n e d U n d e t e r m i n e d U n d e t e r m i n e d s s -1 0 2 4 . 5 6 2 5 . 5 2 2 5 . 7 8 2 5 . 2 8 ± 0 . 6 4 d s -2 0 2 9 . 2 5 2 9 . 3 0 2 8 . 8 6 2 9 . 1 4 ± 0 . 2 4 p s -5 0 3 1 . 0 7 3 0 . 3 1 3 2 . 1 5 3 1 . 1 8 ± 0 . 9 2

3 討論

我們利用腺相關(guān)病毒(AAV)ITR的結(jié)構(gòu)優(yōu)越性[10,21-22]和微環(huán)狀DNA[16-18]載體構(gòu)造特性，構(gòu)建出AAV-ITR單鏈DNA微載體[20]。類似微環(huán)狀DNA的載體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單且安全[19]。AAV的ITR結(jié)構(gòu)可以自動(dòng)形成T形發(fā)卡結(jié)構(gòu)，末端的穩(wěn)定環(huán)狀結(jié)構(gòu)也增加了整個(gè)微載體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[22]。另外ITR之間可以形成多聚體，一種類似染色體的結(jié)構(gòu)，這樣使單鏈DNA微載體在細(xì)胞中可以長(zhǎng)期表達(dá)，所以ITR結(jié)構(gòu)又賦予這種載體較高的穩(wěn)定性和表達(dá)效率[23]。

在小鼠骨骼肌表達(dá)結(jié)果中，從低拷貝數(shù)2×1012copies到高拷貝數(shù)1×1013copies(按1∶5∶10增加)，AAV-ITR單鏈DNA微載體、AAV-ITR雙鏈DNA和質(zhì)粒的熒光表達(dá)都逐漸增強(qiáng)。在1×1013copies時(shí)都得到了很好的表達(dá)。1×1013copies的AAV-ITR單鏈DNA微載體在所有時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)都是最高的。在第1周時(shí)，質(zhì)粒的表達(dá)與其相差不大，雙鏈DNA表達(dá)較弱，單鏈DNA載體的突變體表達(dá)最弱。到第1個(gè)月時(shí)，AAV-ITR單鏈DNA微載體的表達(dá)下降不顯著，質(zhì)粒的熒光強(qiáng)度下降顯著，而雙鏈DNA表達(dá)有所提升。到第3個(gè)月時(shí)，單鏈DNA微載體表達(dá)也有所下降，但仍較高。質(zhì)粒下降最顯著，而且大部分已經(jīng)被降解；雙鏈DNA的表達(dá)也下降許多。并且，3個(gè)月后各載體的RT-PCR結(jié)果也顯示，AAV-ITR單鏈DNA微載體的剩余量是3種載體最高的，AAV-ITR單鏈DNA微載體在骨骼肌中的穩(wěn)定存在可能是其在骨骼肌中穩(wěn)定表達(dá)的分子基礎(chǔ)。總而言之，AAV-ITR單鏈DNA微載體是一種具有較高的穩(wěn)定性和表達(dá)效率的新型載體。

AAV-ITR單鏈DNA微載體之所以具有較高的穩(wěn)定性和表達(dá)效率，主要因素在于ITR結(jié)構(gòu)。AAV-ITR單鏈DNA微載體在動(dòng)物體內(nèi)以ITR3?末端作為引物合成第二條鏈，形成一個(gè)穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并且還有可能通過(guò)ITR進(jìn)一步形成環(huán)狀多聚體。在一周表達(dá)的對(duì)照組中，ITR末端錯(cuò)配的AAV-ITR單鏈DNA微載體正是由于ITR末端發(fā)生突變，無(wú)法形成完整的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，無(wú)法進(jìn)行第二條鏈的合成，更加無(wú)法形成多聚體結(jié)構(gòu)。在其進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后容易發(fā)生降解而無(wú)法穩(wěn)定存在于細(xì)胞中，從而無(wú)法得到較高的表達(dá)。而ITR末端錯(cuò)配的AAV-ITR單鏈DNA微載體的少量表達(dá)可能是由于單鏈DNA的配對(duì)形成雙鏈DNA。

AAV-ITR雙鏈DNA的GFP表達(dá)水平也低于AAV-ITR單鏈DNA微載體，可能是因?yàn)殡p鏈DNA兩端ITR處于線性狀態(tài)，沒(méi)有形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。在雙鏈DNA進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，游離線性的狀態(tài)使其不穩(wěn)定，逐漸發(fā)生降解，所以一周檢測(cè)時(shí)表達(dá)不高。有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)游離的AAV-ITR雙鏈DNA在小鼠肝臟細(xì)胞也能形成多聚體[24]。因此，在降解的過(guò)程中有部分雙鏈DNA可能通過(guò)ITR結(jié)構(gòu)形成了多聚體結(jié)構(gòu)。所以，在1個(gè)月的表達(dá)檢測(cè)中有所上升。但是剩余的穩(wěn)定AAV-ITR雙鏈DNA多聚體拷貝數(shù)已經(jīng)不多，因此其表達(dá)還是不及單鏈DNA微載體。這點(diǎn)從RT-PCR結(jié)果中可以得到驗(yàn)證，AAV-ITR雙鏈DNA的剩余拷貝數(shù)低于AAV-ITR單鏈DNA微載體，但高于質(zhì)粒。到第3個(gè)月時(shí)，AAV-ITR雙鏈DNA表達(dá)也有所下降，但仍比質(zhì)粒高。由此可以看出ITR結(jié)構(gòu)對(duì)整個(gè)單鏈DNA微載體的穩(wěn)定性和高效表達(dá)具有重要作用。

AAV-ITR單鏈DNA微載體與質(zhì)粒載體相比有顯著的優(yōu)越性。首先，在DNA的注射量上，相同拷貝數(shù)1×1013copies的質(zhì)粒用量50 μg，而AAV-ITR單鏈DNA微載體因分子量小只需要10 μg。其次，在結(jié)構(gòu)上，質(zhì)粒上有復(fù)制序列，抗菌素抗性選擇基因等大量細(xì)菌DNA，特別是細(xì)菌DNA序列中CpG序列的含量是哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA的4倍，會(huì)引發(fā)機(jī)體組織免疫反應(yīng)，細(xì)胞炎癥和表達(dá)基因的沉默化[13-14]。而AAV-ITR單鏈DNA微載體中除了ITR只剩下基本的真核基因表達(dá)原件，使得其在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)，免疫原性小。最后，在表達(dá)穩(wěn)定性方面，AAV-ITR單鏈DNA微載體在1個(gè)月和3個(gè)月時(shí)表達(dá)就明顯高于相同摩爾數(shù)的質(zhì)粒。隨著表達(dá)時(shí)間的延長(zhǎng)，AAV-ITR單鏈DNA微載體表達(dá)變化不大，但質(zhì)?；虻谋磉_(dá)卻迅速下降，到第3個(gè)月時(shí)幾乎下降到空白水平。所以無(wú)論從安全性還是表達(dá)效率上考慮，AAV-ITR單鏈DNA微載體都具有較大的優(yōu)越性。

AAV-ITR單鏈DNA微載體的實(shí)驗(yàn)室制備需要酶切后回收，得率不高且花費(fèi)高。但是目前已經(jīng)有人在酵母和昆蟲(chóng)細(xì)胞中成功表達(dá)制備這種AAV-ITR單鏈DNA[25-26]，從而有望實(shí)現(xiàn)AAV-ITR單鏈DNA微載體能像質(zhì)粒一樣在細(xì)胞中大量制備?？偠灾?，AAV-ITR單鏈DNA微載體具有免疫原性小，基因表達(dá)穩(wěn)定等優(yōu)越性，有可能開(kāi)發(fā)成為基因治療的一種高效、穩(wěn)定的新型載體。

REFERENCES

[1]Verma IM,Weitzman MD.Gene therapy: twenty-first century medicine.Ann Rev Biochem, 2005,74(1):711–738.

[2]Hedman M,Hartikainen J,Y l?-Herttuala S. Progress and prospects:hurdles to cardiovascular gene therapy clinical trials.Gene therapy,2011, 18(8):743–749.

[3]Aiuti A,Biasco L,Scaramuzza S,et al.Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients w ith W iskott-A ldrich syndrome.Science,2013, 341(6148):1233151.

[4]Breitbach CJ,Burke J,Jonker D,et al.Intravenousdelivery of a multi-mechanistic cancer-targeted oncolytic poxvirus in humans.Nature,2011, 477(7362):99–102.

[5]M ueller C,Flotte TR.Clinical gene therapy using recombinant adeno-associated virus vectors.Gene Therapy,2008,15(11):858–863.

[6]Taniyama Y,Tachibana K,Hiraoka K,et al. Development of safe and efficient novel nonviral gene transfer using ultrasound:enhancement of transfection efficiency of naked plasm id DNA in skeletal muscle.Gene Therapy,2002,9(6): 372–380.

[7]Hacein-Bey-Abina S,von kalle C,Schm idt M,et al.A serious adverse event after successful gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency.N Engl J M ed,2003,348(3): 255–256.

[8]Bigger BW,Tolmachov O,Collombet JM,et al. An araC-controlled bacterialcre expression system to produce DNA m inicircle vectors for nuclear and m itochondrial gene therapy.J Biol Chem,2001, 276(25):23018–23027.

[9]Doenecke A,Kr?mer A,Scherer MN,et al.AAV plasm id DNA simplifies liver-directed in vivo gene therapy:comparison of expression levels after plasm id DNA-,adeno-associated virus-and adenovirus-mediated liver transfection.J Gene M ed,2010,12(10):810–817.

[10]Henckaerts E,Linden RM.Adeno-associated virus: a key to the human genome?Future Virol,2010, 5(5):555–574.

[11]Schleef M,Schm idt T.Animal-free production of ccc‐supercoiled plasm ids for research and clinical applications.J Gene M ed,2004,6(S1): S45–S53.

[12]Walther W,Stein U.Viral vectors for gene transfer. Drugs,2000,60(2):249–271.

[13]Hyde SC,Pringle IA,Abdullah S,et al.CpG-free plasm ids confer reduced inflammation and sustained pulmonary gene expression.Nat Biotechnol,2008,26(5):549–551.

[14]Tolmachov O.Gene Therapy of Cancer.Methods in Molecular Biology?.2009:117–129.

[15]Choi VW,Samulski RJ,M cCarty DM.Effects of adeno-associated virus DNA hairpin structure on recombination.J Virol,2005,79(11):6801–6807.

[16]Kobelt D,Schleef M,Schmeer M,et al. Performance of high quality m inicircle DNA for in vitro and in vivo gene transfer.Mol Biotechnol, 2013,53(1):80–89.

[17]M ayrhofer P,Iro M.Gene Vaccines.Thalhamer J, Weiss R,Scheiblhofer S,Editors.Springer Vienna, 2012:297–310.

[18]M aniar LEG,M aniar JM,Chen ZY,et al. M inicircle DNA vectors achieve sustained expression reflected by active chromatin and transcriptional level.M ol Ther,2013,21(1): 131–138.

[19]Mayrhofer P,Schleef M,Jechlinger W.Gene Therapy of Cancer.M ethods in M olecular Biology?.2009:87–104.

[20]Li TM,Ping H,Zhang C.Construction of a new gene delivering m ini vector based on AAV-ITR. Pharm Biotech,2013,20(4):318–321(in Chinese).李泰明,平菡,張春.基于AAV-ITR的基因表達(dá)微載體.藥物生物技術(shù),2013,20(4):318–321.

[21]Coura Rdos S,Nardi NB,The state of the art of adeno-associated virus-based vectors in gene therapy.Virol J,2007,4:99.

[22]Grieger JC,Samulski RJ.Adeno-associated virus as a gene therapy vector:vector development, production and clinical applications.Adv Biochem Eng Biotechnol,2005,99:119–145.

[23]Duan D,Yan Z,Yue Y,et al.Structural analysis of adeno-associated virus transduction circular intermediates.Virology,1999,261(1):8–14.

[24]Nakai H.Free DNA ends are essential for concatemerization of synthetic double-stranded adeno-associated virus vector genomes transfected into mouse hepatocytes in vivo.Mol Ther,2003, 7(1):112–121.

[25]Cervelli T,Backovic A,Galli A.Formation of AAV single stranded DNA genome from a circular plasm id in Saccharomyces cerevisiae.PLoS ONE,2011,6(8):e23474.

[26]Li L,Dim itriadis EK,Yang Y,et al.Production and characterization of novel recombinant adeno-associated virus replicative-form genomes: a eukaryotic source of DNA for gene transfer. PLoS ONE,2013,8(8):e69879.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

Gene expression ofAAV-ITR ssDNAm ini vector in skeletal muscle of m ice

Dongqin Zhu,Yun Zhang,Xiaomei Liu,and Chun Zhang

AAV-ITR single strand DNA m ini vector(AAV-ITR ssDNA m ini vector)is a novel gene expression vector based on AAV-ITR.We have shown efficient gene expression of AAV-ITR ssDNA m ini vector in HEK 293T.Here,we studied the efficacy of gene expression of AAV-ITR ssDNA m ini vector in vivo.We injected the skeletal muscle of ICR m ice separately w ith equal molars of AAV-ITR ssDNA m ini vector,ITR mutated AAV-ITR single strand DNA m ini vector (AAV-ITRmm ssDNA mutant vector),AAV-ITR dsDNA and pUC57-m inivector-GFP,combined w ith TurboFect. Florescence m icroscope analysis of skeletal muscle section show s that AAV-ITR ssDNA m ini vector had higher expression efficiency and longer expression period.We extracted DNA from the muscle three months after injection and quantified three vectors by Real-time PCR.RT-PCR analysis show s that there were highest copy numbers of AAV-ITR ssDNA m ini vector existing in muscle.Stable existing of AAV-ITR ssDNA m ini vector in muscle could be the molecular basis of long term gene expression of the vector.The results suggest that AAV-ITR ssDNA m ini vector m ight be a prom ising vector for gene therapy.

Adeno-associated virus(AAV),Inverted term inal repeats(ITR),single strand DNA m ini vector,in vivo gene expression,RT-PCR,gene therapy

February 28,2014;Accep ted:May 5,2014

Chun Zhang.Tel:+86-512-69588327;E-mail:chunzhangspring@gmail.com Xiaomei Liu.Tel:+86-512-69588318;E-mail:lxmdou@126.com

朱冬琴,張?jiān)?劉曉玫,等.AAV-ITR單鏈DNA微載體在小鼠骨骼肌中的表達(dá).生物工程學(xué)報(bào),2014,30(11):1720?1732.

Zhu DQ,Zhang Y,Liu XM,et al.Gene expression of AAV-ITR ssDNA m ini vector in skeletal muscle of m ice.Chin J Biotech, 2014,30(11):1720?1732.

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