大腸桿菌全局調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子環(huán)腺苷酸受體蛋白質(zhì)在代謝工程中的應(yīng)用

王獻(xiàn)舉，呂靜，傅鵬程

1中國(guó)石油大學(xué)(北京)化學(xué)工程學(xué)院新能源研究院，北京102249 2北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100029

綜述

大腸桿菌全局調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子環(huán)腺苷酸受體蛋白質(zhì)在代謝工程中的應(yīng)用

王獻(xiàn)舉1，呂靜1，傅鵬程2

1中國(guó)石油大學(xué)(北京)化學(xué)工程學(xué)院新能源研究院，北京102249 2北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100029

環(huán)腺苷酸受體蛋白質(zhì)(Cyclic amp receptor protein,CRP)是原核生物共有的一類全局轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控原核生物大腸桿菌Escherichia coli中近一半基因的轉(zhuǎn)錄。通過(guò)易錯(cuò)PCR或DNA shuffling的方法可以獲得CRP突變體文庫(kù)，然后經(jīng)過(guò)篩選可以得到目的細(xì)胞表型——“抗逆性”增強(qiáng)。本研究綜述了突變CRP在細(xì)胞表型：耐氧化壓力、耐滲透脅迫、耐有機(jī)溶劑(甲苯)、發(fā)酵中耐醋酸鹽類和生物醇生產(chǎn)中耐生物醇中的應(yīng)用。推論出CRP同樣可以應(yīng)用于相似微生物的表型培育，并展望了CRP的巨大應(yīng)用潛力。

CRP，全局轉(zhuǎn)錄因子，細(xì)胞表型，代謝工程

細(xì)胞代謝表型的改變主要是通過(guò)基因的敲除、突變或過(guò)量表達(dá)完成[1]。但由于載體構(gòu)建困難、轉(zhuǎn)錄效率低下、篩選能力不強(qiáng)等限制條件，以上調(diào)控主要集中于單個(gè)基因上。而細(xì)胞表型優(yōu)化往往涉及多個(gè)基因表達(dá)的同時(shí)上調(diào)或是下降，使得單個(gè)基因?qū)用娴牟僮骷荣M(fèi)時(shí)又費(fèi)力。2007年，Stephanopoulos研究小組提出從改變細(xì)胞全局轉(zhuǎn)錄水平上提高細(xì)胞多基因控制表型即細(xì)胞全局轉(zhuǎn)錄機(jī)制工程(gTME)[2]。gTME通過(guò)易錯(cuò)PCR(Error-prone PCR)或DNA改組(DNA shuffling)的方法獲得結(jié)構(gòu)改變的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)錄因子與相關(guān)啟動(dòng)子(Promoter)序列的識(shí)別結(jié)合水平，最終從全局上調(diào)控多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄。作為一個(gè)實(shí)際應(yīng)用例子，Stephanopoulos研究小組通過(guò)調(diào)控全局轉(zhuǎn)錄因子SPT15獲得了耐高乙醇酵母突變株[3]。

環(huán)腺苷酸受體蛋白質(zhì)(Cyclic amp receptor protein，CRP)是原核生物共有的一類全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，直接調(diào)控基因總數(shù)超過(guò)400個(gè)，通過(guò)間接調(diào)控其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，CRP可以對(duì)占原核生物E.coli基因總數(shù)一半左右起到調(diào)控作用[4]。CRP由兩個(gè)完全相同的亞基組成，在有環(huán)狀A(yù)MP(Cyclic AMP，cAMP)存在時(shí)，CRP與 cAMP形成cAMP-CRP復(fù)合物，該復(fù)合物與所調(diào)控啟動(dòng)子上游相關(guān)序列和RNA聚合酶[5](RNAP)相結(jié)合，激活或是抑制轉(zhuǎn)錄。

最簡(jiǎn)單的模式原核生物E.coli中主要含有以下7種全局轉(zhuǎn)錄因子[6]：CRP(環(huán)AMP受體蛋白)、IHF(融合宿主因子)、FNR(延胡索酸和硝酸鹽還原蛋白)、FIS(反轉(zhuǎn)刺激因子)、ArcA(厭氧呼吸調(diào)控蛋白)、LrP(亮氨酸應(yīng)答調(diào)控蛋白)、NarL(硝酸鹽/亞硝酸鹽應(yīng)答調(diào)節(jié))。這7種全局轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)控E.coli中超過(guò)一半基因的轉(zhuǎn)錄，其調(diào)控的基因總數(shù)占到E.coli中受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因總數(shù)的2/3以上(圖1)。此外，以上全局轉(zhuǎn)錄因子可以通過(guò)調(diào)節(jié)其他轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)而間接調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄[7]。目前獲得工業(yè)應(yīng)用的主要有CRP(環(huán)AMP受體蛋白)和延胡索酸和硝酸鹽還原蛋白(Fumarate and nitrate reduction protein，F(xiàn)NR)兩大類全局轉(zhuǎn)錄因子。

1 CRP基本結(jié)構(gòu)特征

一般，CRP是二聚體結(jié)構(gòu)，每個(gè)亞基(209個(gè)氨基酸殘基)包含3個(gè)結(jié)構(gòu)[8]——cAMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域(1–134位氨基酸殘基)、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(140–209位氨基酸殘基)和連接兩結(jié)構(gòu)域的鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域(135–139位氨基酸殘基)。CRP調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程如下[9]：首先，cAMP結(jié)合到CRP上并改變CRP構(gòu)象；其次，形成的cAMP-CRP復(fù)合物結(jié)合到所調(diào)控基因啟動(dòng)子相應(yīng)序列，識(shí)別序列為22個(gè)堿基對(duì)的反向重復(fù)序列；再次，結(jié)合到DNA上的cAMP-CRP復(fù)合物改變自身蛋白和目標(biāo)DNA序列構(gòu)象；最后，改變的構(gòu)象與RANP結(jié)合調(diào)控相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。

CRP所結(jié)合啟動(dòng)子序列只有單一的cAMP-CRP復(fù)合物結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)此結(jié)合位點(diǎn)位置的不同，可以將CRP調(diào)控啟動(dòng)子分為兩種類型的啟動(dòng)子[10]：第一類啟動(dòng)子，CRP結(jié)合位點(diǎn)位于RNAP結(jié)合位點(diǎn)上游；第二類啟動(dòng)子，CRP結(jié)合位點(diǎn)與RNAP結(jié)合位點(diǎn)相重疊，大概位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游40個(gè)堿基對(duì)左右。

CRP表面與RNAP結(jié)合的有3個(gè)不同區(qū)域(圖1)，即區(qū)域一、區(qū)域二、區(qū)域三。區(qū)域一[11]位于CRP二聚體的上端部分，區(qū)域一上氨基酸的有效替代可能導(dǎo)致其與RNAP的最初結(jié)合受阻。區(qū)域二[12]位于CRP二聚體的下端，區(qū)域二上氨基酸的有效替代可能導(dǎo)致開放復(fù)合物cAMP-CRP-RNAP形成受阻而影響轉(zhuǎn)錄效果。區(qū)域三[10]緊挨區(qū)域二，通過(guò)與RNAP上σ因子結(jié)合而影響轉(zhuǎn)錄，由于區(qū)域三范圍比較狹窄并且只作用于少數(shù)啟動(dòng)子，所以目前對(duì)于區(qū)域三研究甚少。

圖1 大腸桿菌中7種全局轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因總數(shù)情況對(duì)比(數(shù)據(jù)來(lái)源于http://ecocyc.org)Fig.1 The histogram above shows the seven global transcriptional factors in E.coli cells.From the EcoCyc database(http://ecocyc.org).

2 CRP調(diào)控基因種類及其功能

CRP本身能直接調(diào)控近200個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄，為E.coli中調(diào)節(jié)基因總數(shù)最多的轉(zhuǎn)錄因子，再加上其能夠調(diào)控20多種轉(zhuǎn)錄因子而能進(jìn)一步間接調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，使得CRP是E.coli中功能最為強(qiáng)大的一類轉(zhuǎn)錄因子。

E.coli中受CRP調(diào)控(包括間接調(diào)控)的基因總數(shù)為650個(gè)，可以分為以下幾類：DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白、功能酶及其組分、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其組分、膜蛋白及其組分、保守蛋白、未定功能蛋白和其他功能蛋白。各個(gè)種類所占比例如圖3所示。

DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白包括各種與DNA序列相結(jié)合的蛋白質(zhì)因子以及與RNAP相結(jié)合的其他因子。通過(guò)調(diào)控DNA轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白，CRP可以極大地提高受其影響基因的數(shù)量。

CRP調(diào)控的基因中涉及編碼功能酶及其組分的為241個(gè)，占總數(shù)的37%。功能酶是指催化多種代謝路徑的酶類，對(duì)于細(xì)胞代謝維持至關(guān)重要。CRP調(diào)控多種復(fù)雜細(xì)胞表型即通過(guò)代謝酶活性的增強(qiáng)或是降低達(dá)到。

轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其組分是CRP調(diào)控另一大類基因編碼蛋白，相應(yīng)蛋白總數(shù)為108個(gè)，占CRP調(diào)控蛋白總和的17%。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在細(xì)胞耐滲透脅迫方面影響巨大，通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平可以控制相關(guān)物質(zhì)的輸入和輸出，進(jìn)而調(diào)整細(xì)胞中特定物質(zhì)含量，提高細(xì)胞耐滲透脅迫能力。

圖2 CRP基本結(jié)構(gòu)以及其與DNA序列、RNA聚合酶(RNAP)結(jié)合示意圖[10]Fig.2 The schematic structure of CRP and its combination w ith the specific DNA sequence and RNA Polymarase(RNAP)[10].

圖3 E.coli中全局轉(zhuǎn)錄因子CRP調(diào)控基因編碼蛋白分類Fig.3 The pie chart shows the classification of protein encoded by the corresponding genes under the manipulation of transcriptional factor CRP.

CRP調(diào)控的另一類基因是編碼膜蛋白及其相關(guān)組分的基因。膜蛋白相關(guān)組分在細(xì)胞的耐熱、耐酸以及抗?jié)B透脅迫方面意義重大。

除此之外，CRP調(diào)控的另兩類蛋白為“保守蛋白”和“未定功能蛋白”。此兩類蛋白極大的豐富了CRP調(diào)控的基因范圍，從而使得調(diào)控CRP可以獲得更多的目的細(xì)胞表型，為定向細(xì)胞進(jìn)化提供極其豐富的“篩選庫(kù)”。

3 調(diào)控CRP轉(zhuǎn)錄因子的應(yīng)用研究進(jìn)展

目前應(yīng)用CRP突變?nèi)カ@得目的細(xì)胞表型主要包括：生物加工過(guò)程中微生物宿主耐受氧化壓力的能力、生物處理過(guò)程中耐滲透脅迫、生物催化或生物修復(fù)過(guò)程中耐有機(jī)溶劑(甲苯)、發(fā)酵過(guò)程中耐醋酸鹽類和生物醇(乙醇、丁醇)生產(chǎn)過(guò)程中耐生物醇的能力。

3.1 調(diào)控CRP獲得耐H2O2氧化壓力的表型

在生物加工處理過(guò)程中，微生物宿主細(xì)胞經(jīng)常處于一種較高氧化壓力條件之下，在該條件下活性氧如O2·–、H2O2、OH·等含量較高，其對(duì)于細(xì)胞內(nèi)生物大分子(DNA、蛋白質(zhì))組分進(jìn)行氧化修飾會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞造成不可逆損傷[13]。宿主細(xì)胞通用的反應(yīng)是產(chǎn)生相應(yīng)的抗氧化酶清除活性氧自由基或是進(jìn)行DNA分子損傷修復(fù)[14]，但當(dāng)宿主細(xì)胞內(nèi)活性氧超過(guò)一定濃度時(shí)，細(xì)胞自身調(diào)節(jié)機(jī)制很難起到作用。

Jiang等[15]通過(guò)易錯(cuò)PCR的方法獲得容量達(dá)105的CRP突變庫(kù)，以H2O2作為氧化壓力條件進(jìn)行篩選得到耐氧化壓力提高的突變菌株，獲得的E.coli突變菌株在12 mmol/L H2O2中生長(zhǎng)速度為0.6 h–1(對(duì)照無(wú)生長(zhǎng))。最優(yōu)突變株共有3處氨基酸被替換，分別是69位的苯丙氨酸被替換為半胱氨酸、82位的精氨酸被替換為半胱氨酸和139位的纈氨酸被替換為甲硫氨酸。其中69位和82位均處于與cAMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，139位處于鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域。69位的替代改變CRP的構(gòu)象[16]，82位的替代改變CRP與cAMP結(jié)合能力的大小[17]，139位的氨基酸處于連接區(qū)域，其可能改變CRP與相應(yīng)啟動(dòng)子序列結(jié)合的能力大小[18]。氨基酸替代總的效用是增強(qiáng)抗氧化酶基因轉(zhuǎn)錄水平，從而清除細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基。最優(yōu)突變株除了表現(xiàn)出較高的耐氧化壓力之外，還表現(xiàn)出一定的耐熱能力[15]。如此，更加證明CRP調(diào)控基因數(shù)量龐大，應(yīng)用前景十分廣闊。

3.2 調(diào)控CRP耐NaCl滲透脅迫

在微生物發(fā)酵過(guò)程中，原料中經(jīng)常有較高含量的糖類和鹽類物質(zhì)，會(huì)對(duì)細(xì)胞造成較高的滲透脅迫[19]，加上生物發(fā)酵所得到的生物乙醇或乳酸類物質(zhì)[20]也會(huì)提高細(xì)胞外滲透壓力，同樣會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)造成一定程度的影響，進(jìn)而影響微生物發(fā)酵產(chǎn)量的高低[21]。如何獲取耐高滲透壓力的菌株是代謝工程中的一大難題。

Zhang等[22]通過(guò)隨機(jī)突變(易錯(cuò)PCR和DNA改組)方法獲得CRP突變體文庫(kù)，而后以NaCl為滲透壓力條件進(jìn)行篩選得到抗細(xì)胞外滲透壓力的突變菌株，突變菌株在0.9 mol/L NaCl中生長(zhǎng)速度為0.113 h–1(對(duì)照為0.077 h–1)。最優(yōu)突變菌株共有2處氨基酸被替換，分別是第52位的賴氨酸被替換為異亮氨酸和第130位的賴氨酸被替換為谷氨酸。第52位和第130位的氨基酸均是位于CRP中與cAMP結(jié)合區(qū)域。第52位的帶正電氨基酸被替換為中性氨基酸更有利于第二類CRP所調(diào)控啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄[23]，第130位的替代氨基酸改變了CRP構(gòu)象，影響CRP與cAMP所形成復(fù)合物結(jié)構(gòu)，從而影響其與RNAP的結(jié)合而最終影響目的基因的轉(zhuǎn)錄[24]。最優(yōu)突變株表現(xiàn)出較低轉(zhuǎn)錄水平的轉(zhuǎn)運(yùn)子，從而阻止細(xì)胞外物質(zhì)的對(duì)內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，使細(xì)胞表現(xiàn)出較高的耐滲透脅迫能力。

3.3 調(diào)控CRP耐有機(jī)溶劑甲苯

有機(jī)溶劑在兩相生物催化里親油基生物轉(zhuǎn)化中經(jīng)常使用，其被用作增加目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量或萃取出對(duì)細(xì)胞有毒的副產(chǎn)物的目的[25]。另外，在生物修復(fù)中受“污染”的位置通常也有有機(jī)溶劑如甲苯的存在[26]。甲苯對(duì)于細(xì)胞毒害作用相對(duì)較大，較低的量即致使細(xì)胞生長(zhǎng)停滯甚至死亡。如何獲得對(duì)有機(jī)溶劑甲苯耐性較高的菌種是擺在微生物工業(yè)應(yīng)用界的一個(gè)復(fù)雜難題。

Basak等[27]采用易錯(cuò)PCR的方法構(gòu)建CRP突變體文庫(kù)，接著用含甲苯的“逆性環(huán)境”進(jìn)行篩選，獲得了甲苯抗性提高的CRP突變菌株，突變菌株在體積分?jǐn)?shù)為0.23%甲苯中，生長(zhǎng)速度為0.51 h–1(對(duì)照無(wú)生長(zhǎng))。對(duì)突變株CRP編碼基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)突變CRP只有1處氨基酸被替換，即第136位的苯丙氨酸被替換為異亮氨酸。該替換發(fā)生在CRP的鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域，并且靠近與cAMP結(jié)合區(qū)。第136位的氨基酸主要是參與形成β發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)起著連接CRP中C端與N端區(qū)域即cAMP結(jié)合區(qū)與DNA結(jié)合區(qū)的功能[28]。從苯丙氨酸突變?yōu)楫惲涟彼嶂饕歉淖兩鲜靓掳l(fā)夾結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變整個(gè)CRP構(gòu)象[29]，最終影響CRP調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平。同時(shí)，對(duì)突變株轉(zhuǎn)錄水平分析，發(fā)現(xiàn)與耐有機(jī)溶劑相關(guān)基因arcAB轉(zhuǎn)錄水平提高，arcAB編碼所得轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要功能是將細(xì)胞內(nèi)毒性有機(jī)溶劑如甲苯轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞[30]。

3.4 調(diào)控CRP耐醋酸鹽

醋酸鹽類是一種來(lái)源于木質(zhì)纖維素的發(fā)酵副產(chǎn)物，在過(guò)量葡萄糖存在的情況下，會(huì)嚴(yán)重影響微生物生物加工過(guò)程[31-32]。一般在E.coli發(fā)酵過(guò)程中，醋酸鹽濃度超過(guò)5 g/L時(shí)，即抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，限制發(fā)酵罐中細(xì)胞的濃度，進(jìn)而影響發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量提高[33-34]。如何通過(guò)代謝工程的方法獲得醋酸鹽耐性提高的突變菌株是可持續(xù)微生物發(fā)酵工程中所面臨的一大難題。

Chong等[35]利用易錯(cuò)PCR突變獲得CRP突變體文庫(kù)，接著用醋酸鹽壓力進(jìn)行“進(jìn)化篩選”獲得醋酸鹽耐性增強(qiáng)的CRP突變株。獲得的最優(yōu)E.coli突變菌株在濃度為15 g/L的醋酸鹽中，生長(zhǎng)速度為0.083 h–1(對(duì)照為0.016 h–1)。最優(yōu)突變株中CRP氨基酸僅有1處發(fā)生替換，即第138位的天冬氨酸被替換為酪氨酸。替換位置發(fā)生在鉸鏈結(jié)構(gòu)域，并且靠近與DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。通過(guò)此次替換，可能改變CRP與相應(yīng)DNA結(jié)合能力的大小[36]，從而影響突變株的轉(zhuǎn)錄水平。同時(shí)通過(guò)DNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)與耐醋酸鹽相關(guān)基因如yfiD、pflB、gadA、gadB等表達(dá)水平上升，這類基因編碼蛋白主要是抑制細(xì)胞內(nèi)酸化，從而抵消醋酸鹽酸化帶來(lái)的不良影響[37]。

3.5 調(diào)控CRP耐乙醇

生物乙醇作為一種可替代能源正受到越來(lái)越多的關(guān)注[38]，生物乙醇主要是通過(guò)微生物發(fā)酵獲得。在發(fā)酵過(guò)程中，隨著“毒性”終產(chǎn)物乙醇的積累，微生物生長(zhǎng)受阻，代謝放緩，導(dǎo)致終產(chǎn)物產(chǎn)量降低[39-40]。目前，通過(guò)微生物發(fā)酵獲得的最高乙醇濃度為60 g/L[41]。如此，大規(guī)模生產(chǎn)生物乙醇必然要解決乙醇耐性不高的難題。

Chong等[42]通過(guò)易錯(cuò)PCR獲得CRP突變體文庫(kù)，接著用乙醇抗性進(jìn)行篩選獲得耐乙醇能力提高的突變菌株。獲得的E.coli突變菌株在濃度為62 g/L乙醇中生長(zhǎng)速度為0.08 h–1(對(duì)照為0.06 h–1)。通過(guò)對(duì)獲得的突變株進(jìn)行DNA測(cè)序，表明其只有1處氨基酸發(fā)生替換，即第59位的甲硫氨酸被替換為蘇氨酸。替換位置位于CRP上與cAMP結(jié)合區(qū)域。突變結(jié)果可能影響CRP與cAMP的結(jié)合狀況[43]，進(jìn)而通過(guò)RNAP影響目的基因轉(zhuǎn)錄水平。另外，對(duì)突變株進(jìn)行DNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)，除通用壓力誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄水平提高之外，乙醇耐性相關(guān)基因如marA轉(zhuǎn)錄水平也提高。但進(jìn)行綜合分析發(fā)現(xiàn)，乙醇耐性需要多種誘導(dǎo)途徑的參與，其耐性提高是多種基因共同調(diào)節(jié)的結(jié)果。

3.6 本實(shí)驗(yàn)室有關(guān)調(diào)控CRP研究進(jìn)展

第三代生物乙醇是利用基因工程的方法改造光合生物藍(lán)藻而生產(chǎn)獲得的乙醇。目前，第三代生物乙醇正成為全球研究熱點(diǎn)。如今主要有兩大瓶頸有待克服：藍(lán)藻本身產(chǎn)乙醇量不高，目前實(shí)驗(yàn)獲得的最高乙醇產(chǎn)量是690 mg/L；藍(lán)藻耐受乙醇能力偏低，2%的乙醇即能嚴(yán)重抑制藍(lán)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。利用gTME的方法調(diào)控藍(lán)藻(以Synechococcus 7942為研究對(duì)象)全局轉(zhuǎn)錄因子CRP基因家族FNR基因獲得FNR突變體文庫(kù)，接著通過(guò)高通量篩選的方法獲得FNR突變體文庫(kù)。以乙醇抗性作為篩選條件篩選出乙醇耐性提高的菌株。以乙醇產(chǎn)量提高作為實(shí)驗(yàn)?zāi)康模@得乙醇產(chǎn)量提高菌株。另外通過(guò)分析突變FNR結(jié)構(gòu)特征可以揭示出FNR結(jié)構(gòu)和其功能之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。目前實(shí)驗(yàn)室正在構(gòu)建FNR突變體文庫(kù)，已初步篩選出能夠耐受2%乙醇含量的藍(lán)藻。

本實(shí)驗(yàn)的開展既能提高藍(lán)藻乙醇產(chǎn)量和耐受能力，闡明乙醇耐受機(jī)制，亦能解決藍(lán)藻生物乙醇規(guī)模化生產(chǎn)的瓶頸問(wèn)題，推動(dòng)第三代生物乙醇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，為藻類綠色燃料的可持續(xù)發(fā)展提供藻種原料和技術(shù)儲(chǔ)備。

4 結(jié)論與展望

利用易錯(cuò)PCR或DNA shuffling的方法對(duì)全局轉(zhuǎn)錄因子CRP進(jìn)行突變可以獲得期望的目的細(xì)胞表型：耐受乙醇、有機(jī)溶劑、鹽類等各種抗逆性能力增強(qiáng)以及乙醇、丁醇等目標(biāo)產(chǎn)物生產(chǎn)量增加。調(diào)控CRP可以從全局水平上調(diào)控多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平的上升或是下降，正好和細(xì)胞表型與多個(gè)基因表達(dá)的同時(shí)上升或是下降的特點(diǎn)相符合。如此，可以通過(guò)從突變庫(kù)里用相應(yīng)“逆性”環(huán)境進(jìn)行篩選而獲得目的細(xì)胞表型。

CRP是原核生物共有的一類全局轉(zhuǎn)錄因子，其位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的最頂端。Wang等[44]2012年提出全局轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控方法即GRE，該方法的內(nèi)涵包括利用宿主細(xì)胞本身或是外源細(xì)胞全局轉(zhuǎn)錄因子突變建立相應(yīng)的庫(kù)供選擇性篩選獲得目的細(xì)胞表型。同樣，也可以將特定細(xì)胞中所獲特定表型的相應(yīng)CRP突變體轉(zhuǎn)接到另一宿主細(xì)胞中，有望獲得相同的細(xì)胞表型。因此，則可以極大地提高CRP突變的應(yīng)用范圍，也省去突變和篩選的重復(fù)步驟。如果將CRP突變應(yīng)用于合成生物學(xué)的研究，將CRP突變體作為一種“元件”用于構(gòu)建細(xì)胞代謝庫(kù)，也可能會(huì)獲得意想不到的收獲。

轉(zhuǎn)錄因子CRP結(jié)構(gòu)與其功能目前還沒(méi)有建立確切的關(guān)系，對(duì)其突變雖比傳統(tǒng)整個(gè)基因組突變省時(shí)、省力，但同樣其突變帶有一定的盲目性，篩選工作量巨大。下一步的工作應(yīng)是結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)的基本方法建立起其結(jié)構(gòu)與其相應(yīng)功能的聯(lián)系。如此不僅可以增強(qiáng)相應(yīng)工作的目的性從而獲得更優(yōu)的細(xì)胞表型，也為解析細(xì)胞功能與代謝提供參考。

REFERENCES

[1]Zhang F,Rodriguez S,Keasling JD.Metabolic engineering of m icrobial pathways for advanced biofuels production.Curr Opin Biotechnol,2011, 22:775–783.

[2]A lper H,Stephanopoulos G.Global transcription machinery engineering:A new approach for improving cellular phenotype.M etab Eng,2007,9: 258–267.

[3]A lper H,M oxley J,Nevoigt E,et al. Engineering yeast transcription machinery for improved ethanol tolerance and production. Science,2006,314,1565–1568.

[4]Ma HW,Kumar B,Ditges U,et al.An extended transcriptional regulatory network of Escherichia coli and analysis of its hierarchical structure and network motifs.Nucleic Acids Res,2004,32: 6643–6649.

[5]Busby S,Ebright R.Transcription activation by Catabolite Activator Protein(CAP).J M ol Biol, 1999,293,199–213.

[6]M artinez-Antonio A,Collado-Vides J.Identifying global regulators in transcriptional regulatory networks in bacteria.Cur Opi M ic,2003,6: 482–489.

[7]Riley M.Functions of the gene products of Escherichia coli.M ic Rev,1993,57:862–952.

[8]Passner JM,Schultz SC,Steitz TA.Modeling the cAMP induced allosteric transition using the crystal structure of CAP-cAMP at 2.1 angstrom resolution.J M ol Biol,2000,304(5):847–859.

[9]Baker CH,Tom linson SR,Garcia AE,et al.Am ino acid substitution at position 99 affects the rate of CRP subunit exchange.Biochem,2001,40(41): 12329–12338.

[10]Virgil A,Rhodius,Stephen JW,Busby. Transcription activation by the Escherichia coli c yclic AMP receptor protein:determ inants w ithin activating region 3.J Mol Biol,2000,299: 295–310.

[11]Ebright R.Transcription activation at ClassⅠCAP-dependent promoters.Mol M ic,1993,8: 797–802.

[12]Niu W,Kim Y,Tau G,et al.Transcription

activation at ClassⅡCAP-dependent promoters: two interactions between CAP and RNA polymerase.Cell,1996,87:1123–1134.

[13]Storz G,Im lay JA.Oxidative stress.Curr Opin M ic,1999,l2:188–194.

[14]Greenberg JT,Demple B Overproduction of peroxide-scavanging enxzymes in Escherichia coli suppresses spontaneous mutagenesis and sensitivity to redox-cycling agents in oxyR-mutants.EMBO,1988,J 7:2611–2617.

[15]Basak S,Jiang R.Enhancing E.coli Tolerance towards oxidative stress via engineering its global regulator cAMP Receptor Protein(CRP).PLoS ONE 7(12):e51179.

[16]Kumar P,Joshi DC,Akif M,et al.Mapping conformational transitions in cyclic AMP receptor protein crystal structure and normal-mode analysis of Mycobacterium tuberculosis apo-cAMP receptor protein.Biophys,2010,J 98:305–314.

[17]M oore J,Kantorow M,Vanderzwaag D,et al. Escherichia coli cyclic AMP receptor protein mutants provide evidence for ligand contacts important in activation.J Bacteriol,1992,174: 8030–8035.

[18]Passner JM,Schultz SC,Steitz TA.Modeling the cAMP-induced allosteric transition using the crystal structure of CAP-cAMP at 2.1? resolution. J M ol Biol,2000,304:847–859.

[19]Ge XY,Yuan JA,Qin H,et al.Improvement of L-lactic acid production by osmotic-tolerant mutant of Lactobacillus casei at high temperature. Appl M icrobiol Biotechnol,2011,89(1):73–78.

[20]Yang J,Bae JY,Lee YM,et al.Construction of Saccharomyces cerevisiae strains w ith enhanced ethanol tolerance by mutagenesis of the TATA-binding protein gene and identification of novel genes associated w ith ethanol tolerance. Biotechnol Bioeng,2011,108(8):1776–1787.

[21]Ionescu M,Belkin S.Overproduction of exopolysaccharides by an Escherichia coli K-12 rpoS mutant in response to osmotic stress.Appl Environ M icrobiol,2009,75(2):483–492.

[22]Zhang HF,Chong HQ,Ching CB,et al.Random mutagenesis of global transcription factor cAMP receptor protein for improved osmotolerance. Biotechnol Bioeng,2012,109(5):1165–1172.

[23]W illiams R,Bell A,Sims G,et al.The role of two surface exposed loops in transcription activation by the Escherichia coli CRP and FNR proteins.Nucleic Acids Res,1991,19(24):6705–6712.

[24]Popovych N,Tzeng SR,Tonelli M,et al. Structural basis for cAMP-mediated allosteric control of the catabolite activator protein.Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(17):6927–6932.

[25]Sardessai YN,Bhosle S.Industrial potential of organic solvent tolerant bacteria.Biotechnol Prog, 2004,20:655–660.

[26]Prenafeta-Boldu FX,Balleratedt H,Gerritese J,et al.Bioremediation of BTEX hydrocarbons:effect of soil inoculation w ith the toluene-grow ing fungus Cladophiacarbons sp.strain T1. Biodegration,2004,15:59–65.

[27]Basak S,Song H,Jiang RR.Error-prone PCR of global transcription factor cyclic AMP receptor protein for enhanced organic solvent(toluene) tolerance.Process Biochem,2012,47:2152–2158. [28]Won HS,Lee YS,Lee SH,et al.Structural overview on the allosteric activation of cyclic AMP receptor protein.Biochim Biophys Acta, 2009,1794:1299–308.

[29]Passner JW,Ghosh.D,Cirino PC.Transcriotional effects of CRP expression in Escherichia coli.J Biol Eng,2009,3:13.

[30]Nikaido H.M ultidrug efux pumps of gram-negative bacteria.J Bacteriol,1996,178: 5853–9.

[31]Geddes CC,Nieves IU,Ingram LO.Advances in ethanol production.Curr Biotechnol,2011,22: 312–319.

[32]Wang L,Ching H,Ching CB,et al.Nanotube supported bioproduction of 4-hydroxy-2-butanone via in situ cofactor regeneration.Appl M icrobiol Biotechnol,2012,94:1233–1241.

[33]M ills TY,Sandoval NR,Gill RT.Cellulosic hydrolysate toxicity and tolerance mechanisms in Escherichia coli.Biotechnol Biofuels,2009,2: 26.

[34]Kirkpatrick C,Maurer LM,Oyelakin NE,et al. Acetate and formate stress:opposite responses in the proteome of Escherichia coli.J Bacteriol, 2011,183:6466–6477.

[35]Chong H,Yenow J,Wang I,et al.Improving acetate tolerance of Escherichia coli by rew iring its global regulator cAMP Receptor Protein(CRP). PLoS ONE,2013,8(10):e77422.

[36]Sharma H,Yu SN,Kong JL,et al.Structure of apo-CAP reveals that large conformational changes are necessary for DNA binding.Proc Natl Acad Sci USA,2009,106:16604–16609.

[37]Arnold CN,M cElhanon J,Lee A,et al.Global analysis of Escherichia coli gene expression during the acetate-induced acid tolerance response. J Bacteriol,2001,183:2178–2186.

[38]Hahn-Hagerdal B,Galbe M,Gorwa-Grauslund MF,et al.Bio-ethanol-the fuel of tomorrow from the residues of today.Trends Biotechnol,2006,24: 549–556.

[39]Wackett LP.Biomass to fuels via m icrobial transformations.Curr Opin Chem Biol,2008,12: 187–193.

[40]Fischer CR,K lein,M arcuschamer D,et al. Selection and optimization of m icrobial hosts for biofuels production.M etab Eng,2008,10:295–304.

[41]Yomano LP,York SW,Ingram LO.Isolation and characterization of ethanol-tolerant mutants of Escherichia coli KO11 for fuel ethanol production. J Ind M icrobiol Biotechnol,1998,20:132–13.

[42]Chong H,Huang L,Yeow J,et al.Improving ethanol tolerance of Escherichia coli by rew iring its global regulator cAMP receptor protein(CRP). PLoS ONE,2013,8(2):e57628.

[43]Won HS,Seo MD,Ko HS,et al.Interdomain interaction of cyclic AMP receptor protein in the absence of cyclic AMP.J Biochem,2008,143: 163–167.

[44]Wang JQ,Zhang Y,Chen YL,et al.Global regulator engineering significantly improved Escherichia coli tolerances toward inhibitors of lignocellulosic hydrolysates.Biotechnol Bioeng, 2012,109(12):3133–3142.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Regulationofglobaltranscriptionalfactor cyclicamp receptor protein and its metabolic engineering application in Escherichia coli

Xianju Wang1,Jing Lü1,and Pengcheng Fu2

1 College of Chemical Engineering&Institute of New Energy,China University of Petroleum(Beijing),Beijing 102249,China 2 College of Life Science and Technology,Beijing University of Chemical Technology,Beijing 100029,China

Cyclic amp receptor protein(CRP)is a global transcriptional factor in many prokaryotes,capable of governing nearly half of the total genes in Escherichia coli.Through the method of error-prone PCR or DNA shuffling,we can first obtain CRP mutant library and then get the expected cell phenotype w ith enhanced resistance.In this article,we reviewed the follow ing desired phenotype:enhanced tolerance towards oxidative stress,improved osmotolerance,enhanced organic solvent(toluene)tolerance,improved acetate tolerance of E.coli fermentation and improved ethanol tolerance during bio-ethanol production.We then concluded that CRP can also be applied in other host cells to get desired phenotypes.Last, we predicted potential applications of mutant CRP transcriptional factor.

cyclic amp receptor protein(CRP),global transcriptional factor,cell phenotype,metabolic engineering

February 27,2014;Accepted:April 28,2014

Pengcheng Fu.Tel:+86-10-89731091;Fax:+86-10-89731283;E-mail:fupc@mail.buct.edu.cn

王獻(xiàn)舉,呂靜,傅鵬程.大腸桿菌全局調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子環(huán)腺苷酸受體蛋白質(zhì)在代謝工程中的應(yīng)用.生物工程學(xué)報(bào),2014, 30(11):1651–1659.

Wang XJ,Lü J,Fu PC.Regulation of global transcriptional factor cyclic amp receptor protein and its metabolic engineering application in Escherichia coli.Chin J Biotech,2014,30(11):1651–1659.

Supported by:National Basic Research Program of China(973 Program)(Nos.2013CB734002,2003CB734003,2011CB200902), National Natural Science Foundation of China(Nos.31270886,31300049).

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(Nos.2003CB734002,2003CB734003)，國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos.31270886,31300049)資助。