大豆異黃酮對(duì)成骨細(xì)胞增殖活性的測(cè)定和BGP mRNA的表達(dá)

宋 梅 王淑芳 黃永凱 王紅梅

（武警內(nèi)蒙古總隊(duì)醫(yī)院腎內(nèi)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010）

大豆異黃酮對(duì)成骨細(xì)胞增殖活性的測(cè)定和BGP mRNA的表達(dá)

宋 梅 王淑芳 黃永凱 王紅梅

（武警內(nèi)蒙古總隊(duì)醫(yī)院腎內(nèi)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010）

目的研究不同濃度的大豆異黃酮對(duì)體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞增殖活性和骨鈣素（BGP）基因表達(dá)的影響。方法采用新生大鼠顱骨分離培養(yǎng)成骨細(xì)胞，加入不同濃度的大豆異黃酮（20、40、60、80 μg/μL），另設(shè)空白對(duì)照組。MTT法測(cè)成骨細(xì)胞增殖活性。提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR半定量分析細(xì)胞BGP mRNA表達(dá)。結(jié)果MTT結(jié)果顯示，60和80 μg/μL組成骨細(xì)胞增殖活性與對(duì)照組相比顯示增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。RT-PCR結(jié)果顯示：60和80 μg/μL組BGP mRNA表達(dá)增強(qiáng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論大豆異黃酮可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖活性和BGP基因上調(diào)，并呈明顯的劑量依賴關(guān)系。

大豆異黃酮；成骨細(xì)胞；骨鈣素

隨著老齡化時(shí)代的到來，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患病率逐年增高。雌激素治療雖能減少絕經(jīng)后婦女的骨丟失及骨折發(fā)生率[1]，但同時(shí)也增加了患乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)[2，3]。近年來，植物雌激素以其在女性健康中的潛在作用而成為研究的熱點(diǎn)，為防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松提供了一條新思路。

大豆異黃酮類（isoflavones）主要是糖苷結(jié)合形式的染料木苷和黃豆苷，在體內(nèi)細(xì)菌作用下，釋放出具有生物活性的物質(zhì)被吸收。近年研究表明，大豆異黃酮在動(dòng)物試驗(yàn)和人群調(diào)查中對(duì)骨骼代謝、預(yù)防骨質(zhì)疏松有重要作用，但在細(xì)胞水平，一直尚少有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合血清藥理學(xué)方法采用體外細(xì)胞培養(yǎng)，目的在于從胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)水平探索成骨細(xì)胞骨鈣素（BGP）的基因表達(dá)變化，研究大豆異黃酮防治骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑

低糖DMEM培養(yǎng)液、HEPES、胎牛血清（聯(lián)星生物有限公司）、MTT（南京建成生物有限公司）。RNA試劑盒（美國(guó)GIBCO），逆轉(zhuǎn)錄酶為Roche公司。大豆異黃酮購(gòu)自天津市康寧生物化學(xué)工程有限公司，總含量為50.27%。

1.2 原代成骨細(xì)胞的培養(yǎng)

將新生SD大鼠（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）放入75%酒精中浸泡消毒15 min，無菌操作下取出顱蓋骨。除去附著的血管及結(jié)締組織，用PBS溶液清洗3次。剪成l mm×l mm大小的碎塊。加入0.25%胰蛋白酶，于37 ℃消化30 min，棄去消化液，PBS溶液清洗干凈后，加入0.02%Ⅱ型膠原酶，于37 ℃消化5次，每次20 min，棄除前兩次消化液，取最后3次消化液，1000 r，離心10 min。棄上清液，所得白色沉淀物即為制得的成骨細(xì)胞樣細(xì)胞團(tuán)。用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞至2×104/mL的細(xì)胞懸液，吹打均勻后。接種到100 mL培養(yǎng)瓶。置入37 ℃，含5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，24 h換液。棄去懸浮細(xì)胞.每隔2 d換液1次。

1.3 細(xì)胞增殖MTT測(cè)定方法

取培養(yǎng)至第3代的成骨細(xì)胞以1×105個(gè)/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔300 μL，24 h細(xì)胞貼壁后，棄培養(yǎng)液，分別加入含有大豆異黃酮（20、40、60、80 μg/μL）濃度培養(yǎng)液，另設(shè)加DMEM培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照，每組8孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每組分別收集50 μL上清液。每孔加入MTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄上清；每孔加入DMSO溶液150 μL，振蕩10 min，立即測(cè)定吸光度值（波長(zhǎng)490 nm）。比較各組OD值的大小。

圖1 大豆異黃酮對(duì)成骨細(xì)胞增殖活性測(cè)定

1.4 大豆異黃酮對(duì)成骨細(xì)胞BGP基因表達(dá)的影響

1.4.1 細(xì)胞總RNA提取

培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)消化后，棄消化液，PBS洗滌2次；加入TRIZOL細(xì)胞裂解液。刮下細(xì)胞，連同裂解液一起轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL，Ep管中，室溫放置5 min。加氯仿0.2 mL，劇烈震蕩振蕩15 s，室溫靜置3 min，4 ℃離心，12000 r，15 min，小心吸取上層水相，移至另一1.5 mL Ep管中。加等體積異丙醇，室溫放置10 min，4 ℃離心，12000 r，10 min。棄上清，加預(yù)冷75%乙醇1 mL，旋渦振蕩充分洗滌總RNA沉淀，4 ℃離心，12000 r，5 min。棄上清，快速離心5 s，將管底殘余乙醇用移液器小心吸去，室溫下晾干沉淀20 min。加20 μL無RNA酶水，溶解總RNA沉淀，用分光光度計(jì)測(cè)定其在260、280 nm處OD值，以確定核酸的純度及濃度，并按照公式[mRNA]（μg/μL）=OD260×40×稀釋倍數(shù)/1000。

1.4.2 RT-PCR

取3μg總RNA用TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。再用9700型PCR擴(kuò)增儀（PE公司）進(jìn)行PCR。BGP引物利用primer3軟件設(shè)計(jì)，BGP上游：5'-GCA GGA GGG CAA TAA GGT-3'；BGP下游：5'-CGT AGA TGC GTT TGT AGGC-3'。用于擴(kuò)增BGP基因cDNA，片段大小為164 bp。擴(kuò)增條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 20 s，共30個(gè)循環(huán)。β-actin引物序列，上游：5'-CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA-3'；下游：5'-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AACA-3'，擴(kuò)增片段：300 bp。擴(kuò)增條件為94 ℃ 5 min，94 ℃ 15 s，55 ℃30 s，68 ℃ 20 s，共30個(gè)循環(huán)。

1.4.3 PCR產(chǎn)物半定量分析

取5 μLPCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/mL EB），120 V恒壓，40 min，紫外透射儀上觀察結(jié)果，凝膠分析軟件對(duì)電泳譜帶進(jìn)行半定量分析，用任意單位（AU）表示凝膠譜帶的面積×熒光強(qiáng)度值，BGP與β-actin的AU比值代表各自的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度的大豆異黃酮對(duì)成骨細(xì)胞增殖活性MTT結(jié)果顯示：隨大豆異黃酮濃度的上升，成骨細(xì)胞增殖活性呈上升趨勢(shì)。其中，60、80 μg/μL與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 大豆異黃酮對(duì)成骨細(xì)胞增殖活性測(cè)定

2.2 RT-PCR半定量結(jié)果顯示

與對(duì)照組（0.5386±0.028）相比，20 μg/μL（0.5620±0.020）和40 μg/μL（0.6228±0.012）組BGP mRNA表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）；60 μg/μL（0.7813±0.010）和80 μg/μL（0.8121±0.013）組BGP mRNA表達(dá)增強(qiáng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖1，圖2）。

圖2 大豆異黃酮對(duì)成骨細(xì)胞BGP mRNA表達(dá)

3 討 論

骨組織中存在的細(xì)胞主要有3種：骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞。其中成骨細(xì)胞是骨組織中最活躍的細(xì)胞。成骨細(xì)胞存在于骨的表面以及骨間隙的孔隙內(nèi)。其主要功能是合成、分泌骨基質(zhì)并促進(jìn)基質(zhì)礦化形成骨組織[4-6]。骨鈣素是成骨細(xì)胞合成分泌的一種非膠原蛋白，是反映成骨細(xì)胞分化成熟的指標(biāo)，能準(zhǔn)確表示成骨細(xì)胞的活性。當(dāng)骨形成和骨吸收耦聯(lián)時(shí)，骨鈣素的主要生理作用是反映骨轉(zhuǎn)換的指標(biāo)；當(dāng)骨形成和骨吸收解耦聯(lián)時(shí)，骨鈣素是反映骨形成的特異指標(biāo)；它能準(zhǔn)確反映成骨細(xì)胞的成骨功能[7，8]。

大豆異黃酮是植物雌激素的一種，主要包括大豆苷原、染料木黃酮和黃豆黃素，它們的結(jié)構(gòu)與雌激素相似。本實(shí)驗(yàn)通過不同濃度的大豆異黃酮對(duì)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞的增殖活性和BGP基因表達(dá)影響，結(jié)果表明，大豆異黃酮可以增加細(xì)胞水平的成骨細(xì)胞的增殖活性，并隨濃度的增大呈上升趨勢(shì)。在基因水平上，大豆異黃酮可促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞BGP基因的表達(dá)，亦表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系。由此可以推測(cè)，大豆異黃酮對(duì)骨骼代謝、預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用，可能是促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖活性和增加細(xì)胞中BGP基因表達(dá)而介導(dǎo)，并表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系。細(xì)胞培養(yǎng)研究表明，大豆異黃酮對(duì)成骨細(xì)胞增殖、大鼠骨代謝有促進(jìn)作用，但其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。成骨細(xì)胞增殖、分化的過程是一個(gè)受多種因素調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程，其可能受到多種因素的影響。

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Effect of Isoflavones on Cell Proliferation Activity and Gene Expression of BGP mRNA in Cultured Rat Osteoblasts

SONG Mei, WANG Shu-fang, HUANG Yong-kai, WANG Hong-mei
(Department of Nephrology, Inner Mongolia Armed Police Hospital, Hohhot 010010, China)

ObjectiveTo study the effect of different concentrations of isoflavones on gene expression of BGP mRNA and cell proliferation activity in cultured rat osteoblasts.MethodsNewborn rat calvarid osteoblastic cell were isolated and cultured. They were cultured in medium with various concentration isoflavones(20, 40, 60, 80 μg/μL), compared to control group. The proliferation activity by MTT method. The total RNA was extracted by TRIZOL and analyaed with semi-quantitative RT-PCR.ResultsCompared to control group, the cell proliferation activity of 60 and 80 μg/μLgroup was significantly promoted(P＜0.05), the cell BGP mRNA expression of 60 and 80 μg/μL group was significantly upregulated(P＜0.01).ConclusionThe isoflavones could increase cell proliferation activity and expression of BGP mRNA. The effect was similar to estrogen.

Isoflavones; Osteoblast; Bone morphogenetic protein

R318

B

1671-8194（2014）27-0071-02