一株裂解奶牛源致病性大腸埃希菌噬菌體的分離與鑒定

楊亞東，王禮偉，屈勇剛，李 飛，楊一鳴，楊 蓓

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832000）

奶牛乳房炎是奶牛的常見多發(fā)病，直接給我國(guó)的奶產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［1］。目前在臨床防治中大多采用抗菌藥物來(lái)治療，普遍存在耐藥性和用藥成本增加等問題。同時(shí)，由于長(zhǎng)期使用抗生素，使畜產(chǎn)品存在嚴(yán)重藥物殘留，導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)下降，很難滿足人們對(duì)綠色健康養(yǎng)殖的要求。噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的生物病毒的總稱。自1917年人們發(fā)現(xiàn)噬菌體以來(lái)，如何利用噬菌體預(yù)防和治療細(xì)菌性疾病引起了人們的關(guān)注［2］。早在20世紀(jì)初噬菌體治療就已經(jīng)取得過可喜的成果，國(guó)外第一次公開報(bào)道的噬菌體治療是在1921年，Richard B等利用噬菌體制劑治療葡萄球菌皮膚感染，24h～48h之內(nèi)，感染消退［3］。現(xiàn)今，噬菌體的應(yīng)用越來(lái)越廣泛［4］。利用噬菌體治療細(xì)菌感染具有一些抗菌藥物無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，如噬菌體超強(qiáng)的繁殖能力、裂解細(xì)菌的特異性、無(wú)耐藥性、無(wú)殘留等。本研究從牛糞便中分離到1株裂解致奶牛乳房炎大腸埃希菌的噬菌體，對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行分析，為開展奶牛乳房炎噬菌體治療研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和糞便 21株奶牛源致病性大腸埃希菌（Eco1～Eco21）由石河子大學(xué)獸醫(yī)傳染病實(shí)驗(yàn)室分離鑒定所得，用甘油在-40℃保存。26份牛糞便采自石河子周邊奶牛場(chǎng)。

1.1.2 主要試劑 LB培養(yǎng)液配方按文獻(xiàn)［5］配制；普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 宿主菌的準(zhǔn)備 將21株牛源致病性大腸埃希菌分別接種到裝有3mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，于37℃條件下，180r／min搖床培養(yǎng)6h，置4℃冰箱保存。

1.2.2 噬菌體的富集與分離 參照文獻(xiàn)［6］將牛糞便樣品放入1 000mL自來(lái)水中充分混勻，自然沉降10min后，取上清液用16層紗布粗過濾，所得濾液4℃冰箱過夜，后將上清以10 000r／min離心10 min。取上清液，放置4℃冰箱過夜。將所得上清液20mL，以及21株菌懸液各3mL，分別加入100mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)24h，10 000r／min離心10min，取上清液備用。取21支試管，每管分別加大腸埃希菌菌懸液0.1mL和處理后的噬菌體液0.1mL，振蕩使其充分混勻，靜置15min，使噬菌體和宿主菌充分吸附。將7g／L半固體LB培養(yǎng)基融化后自然降溫到50℃左右，取10mL加入試管，搖晃，充分混勻，再倒入LB平板，37℃培養(yǎng)6h，觀察結(jié)果。

1.2.3 噬菌體的純化 當(dāng)有噬菌斑出現(xiàn)時(shí)，用滅菌牙簽挑取單個(gè)噬菌斑接種于相應(yīng)的宿主菌菌懸液中，37℃、180r／min搖床培養(yǎng)8h，10 000r／min離心處理10min，重復(fù)此挑斑步驟2次～3次即可得到較純的噬菌體。

1.2.4 噬菌體的保存 取最終純化的噬菌體加入甘油分6管凍存。

1.2.5 滴度測(cè)定 參照文獻(xiàn)［6］，以LB液體培養(yǎng)基為稀釋液，將純化后的噬菌體作連續(xù)10倍稀釋。分別取100μL稀釋后的各個(gè)梯度噬菌體與100μL對(duì)應(yīng)宿主菌菌懸液充分作用后，采用雙層平板法進(jìn)行培養(yǎng)，觀察結(jié)果。上述每個(gè)稀釋度分別做三個(gè)平行重復(fù)。計(jì)數(shù)時(shí)，選取噬菌斑數(shù)在30～300之間的平板，采用平均數(shù)計(jì)算滴度。噬菌體的滴度（PFU／mL）＝稀釋倍數(shù)×噬菌斑個(gè)數(shù)的平均數(shù)×10。

1.2.6 裂解譜的測(cè)定 取純化后的噬菌體原液0.1mL，分別加入到21株奶牛乳房炎大腸埃希菌菌懸液（0.1mL）中，室溫靜置15min，采用雙層瓊脂平板法觀察分離株噬菌體對(duì)不同大腸埃希菌的裂解情況。

1.2.7 最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定 感染復(fù)數(shù)是指感染發(fā)生之前，噬菌體與宿主菌數(shù)量的比值。最佳感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of infection，MOI）表示子代最高產(chǎn)出率。參照文獻(xiàn)［7］，取分離株噬菌體對(duì)應(yīng)的對(duì)數(shù)期菌懸液，按感染復(fù)數(shù)分別為0.1、1、10、100加入噬菌體。37℃搖床培養(yǎng)8h，采用雙層瓊脂平板法測(cè)定最佳感染復(fù)數(shù)。

1.2.8 pH 穩(wěn)定性的測(cè)定 制備pH 為4、5、6、7、8、9的LB液體培養(yǎng)基。取6個(gè)試管，分別加入9 mL不同pH的LB液體培養(yǎng)基，再分別加入1mL純化后的噬菌體原液，于37℃條件下作用2h。采用雙層瓊脂平板法分析不同pH對(duì)噬菌體滴度的影響。

1.2.9 溫度穩(wěn)定性的測(cè)定 將噬菌體分別在30℃、40℃、50℃、60℃溫度條件下處理1h，采用雙層瓊脂平板法分析不同溫度對(duì)噬菌體滴度的影響。

1.2.10 紫外線穩(wěn)定性的測(cè)定 將1mL噬菌體稀釋液（1.98×102PFU／mL）加入平板中，直接暴露在超凈工作臺(tái)中，紫外線燈照射。在0、2、4、6、8、10、12min時(shí)，取0.1mL噬菌體處理液加入0.1mL相應(yīng)宿主菌，震蕩使其充分混勻，室溫靜置15min，倒板，測(cè)定不同照射時(shí)間條件下噬菌體的滴度。

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希菌噬菌體的分離及噬菌斑觀察結(jié)果

采用雙層瓊脂平板法培養(yǎng)6h后，肉眼可見直徑相差不大，邊緣整齊，無(wú)暈環(huán)、透明清晰的噬菌斑（圖1），將其命名為EcP1。

2.2 噬菌體EcP1滴度測(cè)定結(jié)果

通過雙層瓊脂平板法測(cè)定計(jì)數(shù)可知，噬菌體EcP1的滴度為7.75×1010PFU／mL。

2.3 噬菌體EcP1裂解譜測(cè)定結(jié)果

通過裂解譜的測(cè)定，可知EcP1的裂解率為33.3%（表1）。

2.4 噬菌體EcP1的最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定結(jié)果

經(jīng)過4h的培養(yǎng)，通過滴度的測(cè)定，在MOI為0.1、1、10、100時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)，當(dāng) MOI＝10時(shí)，噬菌體EcP1產(chǎn)生子代的滴度為1.65×109PFU／mL，是4種感染中最高的（表2）。

圖1 噬菌體EcP1形成的噬菌斑Fig.1 The plaque of bacteriophage EcP1

表1 噬菌體EcP1的裂解譜Table 1 The lysis spectrum of bacteriophage EcP1

表2 最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定Table 2 Determination of optimal multiplicity of infection（MOI）

2.5 噬菌體EcP1的pH穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

噬菌體EcP1經(jīng)過不同的pH處理2h后，pH為6時(shí)滴度最高，滴度維持在1011左右。當(dāng)pH為4、10時(shí)，滴度為零。這種趨勢(shì)說(shuō)明強(qiáng)酸、強(qiáng)堿都會(huì)嚴(yán)重影響噬菌體的活性（圖2）。

2.6 噬菌體EcP1熱穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

噬菌體EcP1經(jīng)過不同溫度處理1h后，溫度為30℃時(shí)滴度最高，達(dá)到1.00×1011PFU／mL，同時(shí)，40℃～50℃時(shí)滴度均維持在1010，當(dāng)60℃的時(shí)候，滴度明顯下降，這種趨勢(shì)說(shuō)明高溫也嚴(yán)重影響噬菌體的活性（圖3）。

2.7 噬菌體EcP1紫外線穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

隨著紫外線照射時(shí)間的持續(xù)，噬菌體EcP1的活性逐漸降低。紫外線持續(xù)照射12min時(shí)僅產(chǎn)生2個(gè)噬菌斑，紫外線的照射直接導(dǎo)致噬菌體的快速失活（圖4）。

2.8 噬菌體EcP1在-20℃保存

經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室在-20℃冰箱中保存1個(gè)月后，可重新分離到噬菌體，其滴度沒有發(fā)生明顯的變化，維持在105。保存10個(gè)月后依然可以分離到噬菌體，滴度維持在104。

圖2 噬菌體EcP1對(duì)pH的耐受能力Fig.2 The resistance of bacteriophage EcP1to different pH

圖3 噬菌體EcP1對(duì)溫度的耐受能力Fig.3 The resistance of bacteriophage EcP1 to different temperatures

圖4 噬菌體EcP1對(duì)紫外線的耐受能力Fig.4 The resistance of bacteriophage EcP1to ultraviolet rays

3 討論

奶牛乳房炎是奶牛的常見多發(fā)病，在奶牛養(yǎng)殖中危害最大，是投入藥費(fèi)最多、防治最難的奶牛主要疾病之一。目前，全世界約有2.2億頭奶牛，其中1／3患有各種類型的乳房炎。我國(guó)奶牛乳房炎發(fā)病率在20%～70%之間，有的甚至更高［8-10］?，F(xiàn)已證實(shí)大腸埃希菌是引致奶牛乳房炎的主要病原菌之一，檢出率為7.22%［11-12］。傳統(tǒng)的抗生素治療方法因其在臨床上容易出現(xiàn)耐藥和藥物殘留等問題受到廣泛爭(zhēng)議。所以，探索新型的治療方案迫在眉睫。以中草藥制劑、疫苗等為代表的生物制劑因具有較多的優(yōu)點(diǎn)而被人們廣泛關(guān)注［13］。近年來(lái)，噬菌體作為一種微生態(tài)制劑已經(jīng)廣泛的在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)、食品行業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、環(huán)境等相關(guān)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用［14-15］。作為一種微生態(tài)制劑，噬菌體治療具有取材廣泛、較強(qiáng)的復(fù)制能力、宿主特異性、無(wú)耐藥性、無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越多受到人們的重視。本研究在前期病原分離的基礎(chǔ)上，以致奶牛乳房炎的大腸埃希菌為宿主菌分離到1株裂解性噬菌體，該分離株噬菌體滴度為1010PFU／mL，與國(guó)內(nèi)有關(guān)研究的結(jié)果相似［16］。該株噬菌體對(duì)試驗(yàn)中21株大腸埃希菌的裂解率為33.3%，最佳感染復(fù)數(shù)為10，在pH 5～9范圍內(nèi)作用2h、30℃～40℃時(shí)作用1h其滴度變化不顯著，紫外線照射14min可被全部滅活，在-20℃條件下保存10個(gè)月仍保持活性。

根據(jù)本試驗(yàn)對(duì)于最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定結(jié)果表明，噬菌體的分離與最佳感染復(fù)數(shù)有關(guān)，本試驗(yàn)中在最佳感染復(fù)數(shù)為0.1時(shí)，沒有出現(xiàn)相應(yīng)的噬菌斑，可能是由于噬菌體數(shù)量的過少導(dǎo)致噬菌體增殖速度跟不上細(xì)菌的增殖速度，被菌苔覆蓋，無(wú)法獲得明顯的噬菌斑。所以，調(diào)節(jié)菌懸液的濃度可以提高噬菌體的分離率。

噬菌體與細(xì)菌作用的過程中，只有完全充分的吸附后才有可能使噬菌體依附細(xì)菌大量繁殖，在噬菌體富集的時(shí)候，保證噬菌體與宿主菌混合后靜置15min～20min是很有必要的；搖床培養(yǎng)的時(shí)候轉(zhuǎn)速過高也會(huì)對(duì)噬菌體與細(xì)菌的吸附過程造成影響，選擇180r／min是本試驗(yàn)采用的方法。

噬菌體的常規(guī)保存方法是甘油凍存，本試驗(yàn)將所得噬菌體甘油凍存的同時(shí)，取一部分于-20℃冰箱冷凍，經(jīng)10個(gè)月后，測(cè)定其滴度，發(fā)現(xiàn)該噬菌體依舊保持較高生物活性，證實(shí)了該保存方法的可行性。

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