維A酸微球的制備及性能考察

趙美玲，王俊峰，蘇琳琳，李亞璟，楊 震，丁平田*

（1.沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽110016；2.山東威高藥業(yè)股份有限公司，山東 威海 264200）

維A酸微球的制備及性能考察

趙美玲1，王俊峰2，蘇琳琳1，李亞璟1，楊 震1，丁平田1*

（1.沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽110016；2.山東威高藥業(yè)股份有限公司，山東 威海 264200）

目的以乙基纖維素為材料制備維A酸微球，并對其粒徑和載藥量等性質(zhì)進(jìn)行考察。方法 采用O/W型乳化-溶劑揮發(fā)法制備維A酸微球?？疾烊榛瘎┚垡蚁┐技拜d體材料乙基纖維素的濃度等處方因素對微球粒徑及形態(tài)的影響，通過HPLC測定載藥微球的載藥量及包封率；利用透析法測定載藥微球的釋放度；通過正交試驗(yàn)優(yōu)化處方。結(jié)果 最優(yōu)處方下制備的微球外觀圓整，粒徑較均勻，平均粒徑為80 μm，載藥量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0 %。 結(jié)論 該法具有耗時(shí)短、制備工藝簡單、重現(xiàn)性好，制備的微球粒徑小、粒度分布窄等特點(diǎn)。

藥劑學(xué)；微球；乳化溶劑揮發(fā)法；維A酸；正交試驗(yàn)；制備

維A酸是維生素A的代謝活性產(chǎn)物，它可以調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞的增殖和分化，抑制皮脂分泌和皮脂腺的分化，影響黑色素的形成，對皮膚光老化也有抑制作用[1-2]；具有抗炎的作用，被廣泛應(yīng)用于治療銀屑病、毛發(fā)紅糠疹、毛囊角質(zhì)化、扁平疣、尋常疣、魚鱗病、色素沉著等疾病[3-4]，尤其在治療尋常痤瘡取得較好的效果。現(xiàn)市售多為口服和外用制劑，而外用制劑因其化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，極易受光、高溫、氧氣、pH等的影響變質(zhì)[5]，溶解度很低，難以找到良溶劑而增加了制劑的制備難度；維A酸的有效劑量雖然很小，但是外用容易引起皮膚刺激癥狀。作者為了克服這些問題和不足，制備了維A酸微球。

1 儀器與材料

CL-200型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），QE-3恒溫氣浴振蕩器（天津市歐諾儀器儀表有限公司），KQ-50B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）， JJ-1定時(shí)電動(dòng)攪拌器（江蘇省金壇市中大儀器廠），S3400N電子掃描顯微鏡（日本Hitachi公司），高效液相色譜儀（L-7420檢測器，L-7110 泵，日本Hitachi公司），HW2000 色譜工作站（上海千譜軟件有限公司）。

維A酸（江蘇東邦醫(yī)藥化工有限公司），乙基纖維素（ethyecellulose，EC，批號：PD332732，上?？房蛋录夹g(shù)有限公司），聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA，批號：A014168701，美國Acros Organic公司 ），交聯(lián)聚維酮（polyvinylpolypyrrolidone cross-linked，PVPP，批號：03900012296，上海森君化工制劑輔料有限公司），其他試劑（國產(chǎn)分析純或生化試劑，市售）。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC色譜條件

色譜柱：ODS-C18色譜柱（200 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇-水-冰醋酸（體積比為92:7:1），檢測波長：350 nm，流速：1.0 mL·min-1，柱溫：25℃，進(jìn)樣量：20 μL。

微球載藥量及包封率的方法學(xué)項(xiàng)下的線性范圍為6～14 mg·L-1、方法專屬性強(qiáng)、10 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，低、中、高3個(gè)濃度的藥物溶液回收率均在98%與102%之間，符合方法學(xué)要求；微球體外釋放方法學(xué)項(xiàng)下樣品質(zhì)量濃度在0.1～10.0 mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好、專屬性強(qiáng)，低、中、高3個(gè)濃度的藥物溶液回收率均在98%與102%之間，符合方法學(xué)要求。

2.2 微球的制備方法

采用乳化溶劑揮發(fā)法制備維A酸微球。稱取適量促釋劑交聯(lián)聚維酮（PVPP）超聲均勻分散在二氯甲烷中，再將適量乙基纖維素（EC）和維A酸超聲攪拌溶解在其中作為分散相；將適量的乳化劑聚乙烯醇（PVA）加入水中，加熱溶解作為連續(xù)相；用酸式滴定管將分散相溶液以一定的速度加入到連續(xù)相中，采用機(jī)械攪拌形成O/W型乳滴；持續(xù)攪拌數(shù)小時(shí)，使溶劑揮盡；將所得微球的混懸液，進(jìn)行減液抽慮，收集上層產(chǎn)品，重蒸水洗滌并干燥至恒重，制得維A酸微球。

2.3 微球的粒徑及形態(tài)

2.3.1 微球的粒徑測定及分布

隨機(jī)取微球少許，在帶標(biāo)尺的光學(xué)顯微鏡下選擇具有代表性的區(qū)域拍照，利用Nanomeasure 2.1軟件測定不少400個(gè)微球的粒徑。計(jì)算算術(shù)平均粒徑。以跨距表示粒徑的分布，以粒徑為橫坐標(biāo)，以頻率為縱坐標(biāo)作粒徑分布直方圖。

2.3.2 微球的形態(tài)

微球均勻分散在樣品平臺上，用導(dǎo)電膠固定后噴金，電壓加至5 kV，用掃面電鏡觀察微球的表面形態(tài)。

2.4 載藥量及包封率的測定

精密稱取 30 mg 載藥微球于 100 mL 量瓶中，加入 10 mL異丙醇進(jìn)行超聲溶解，以甲醇稀釋并定容，充分振搖，過濾，HPLC 測定藥物含量。載藥量（drug loading，DL）和包封率（entrapment efficiency，EE）計(jì)算公式如下：

w（DL /%）=（微球中藥物的量/微球總量）×100%；

w（EE /%）=（實(shí)際載藥量/投藥量）×100%。

2.5 體外釋放試驗(yàn)

精密稱取10 mg維A酸載藥微球，裝入含2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的SDS透析袋中，以50 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的SDS溶液為介質(zhì)，置于氣浴搖床中，振蕩轉(zhuǎn)速為50 r·min-1，溫度為（37±1）℃。定時(shí)取樣2 mL并補(bǔ)充新鮮介質(zhì)，HPLC 測定維A酸濃度，計(jì)算維A酸的累計(jì)釋放百分?jǐn)?shù)。

2.6 處方單因素考察

2.6.1 EC的質(zhì)量濃度對微球制備的影響

為考察EC的用量對微球的影響， 固定其他條件不變，分別選定EC的質(zhì)量濃度為40、60、100 g·L-1制備微球。EC的質(zhì)量濃度主要影響微球的平均粒徑和釋藥速度，隨著增加EC的質(zhì)量濃度，微球的平均粒徑增加，但是載藥量和包封率也隨之呈現(xiàn)遞減的趨勢，藥物的釋放速度反而越來越慢，綜合上述因素考慮，EC的質(zhì)量濃度選擇在40～60 g·L-1之間。具體結(jié)果見圖1。

圖1 乙基纖維素濃度對微球粒徑的影響Fig 1. Effect of EC concentration on the size of microspheres

2.6.2 乳化劑種類對微球制備的影響

固定其他條件不變，分別以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的SDS、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的PVA、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的Tween-80 、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的F-68為乳化劑制備維A酸微球。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的SDS、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的Tween-80和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的F-68作為乳化劑制備的微球圓整光滑，但是收率較低。此外，用 SDS做乳化劑容易產(chǎn)生泡沫，抽濾困難。綜合考慮選擇PVA為乳化劑。

2.6.3 PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)對微球制備的影響

固定其他條件不變，改變?nèi)榛瘎㏄VA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.0 %、1.0 %、0.5 %，結(jié)果表明乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)主要影響微球的成形性，隨著乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，微球的形態(tài)越來越圓整，但是質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高時(shí)，微球的產(chǎn)率及包封率減少，另外難以洗凈。

2.6.4 油水體積比對微球制備的影響

固定其他條件不變，改變油-水體積比分別為1:5、1:10、1:15，單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：相比在1:5到1:15之間，隨著相比增加，載藥微球的平均粒徑有減小的趨勢，但是對載藥量、包封率及藥物釋放速度影響不大。油相比例過大時(shí)，微球表面易黏連，但是水相比例過大時(shí)，微球的形態(tài)不夠圓整。

2.6.5 維A酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對微球制備的影響

固定其他條件不變，改變藥物與EC的質(zhì)量比例分別為1:10、1:20、1:30，隨著藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，微球平均粒徑變化不大，但對微球的載藥量、包封率及釋藥速度影響很大。在一定范圍內(nèi)，增加投藥量，微球的載藥量增加，但是包封率卻降低，釋藥速度也增加。

2.6.6 促釋劑質(zhì)量濃度對微球制備的影響

固定其他條件，改變促釋劑PVPP質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行考察，PVPP質(zhì)量分?jǐn)?shù)在5%～15%之間，隨著促釋劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，微球粒徑有減小的趨勢，但是影響并不明顯，其主要對微球的釋藥速度有影響，見圖2。

圖2 促釋劑質(zhì)量濃度對微球體外藥物釋放速度的影響Fig. 2 Effect of release promotion agents concentration on in vitro release of tretinoin from microspheres

2.7 正交試驗(yàn)優(yōu)化處方

根據(jù)單因素考察結(jié)果，選擇對制備微球影響較顯著的4個(gè)因素作為考察對象，即EC質(zhì)量濃度（A，ρ/（g·L-1））、m（tretinoin）: m（EC）（B）、PVA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C，w / %）、PVPP的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（D，w / %），每個(gè)因素選取3個(gè)水平，考察不同因素的不同水平對微球性質(zhì)的影響。各因素水平見表1。

按 L9(34)正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，分別以收率、載藥量為綜合考察指標(biāo)，采用綜合評分法 ：X=載藥量+ 收率；本實(shí)驗(yàn)2個(gè)指標(biāo)同等重要，互補(bǔ)相容，X值越高 ，實(shí)驗(yàn)條件越好。實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果見表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levers of orthogonal design

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal design

綜合上述考察結(jié)果，選定微球的最佳處方為A2B3C2D2，即EC質(zhì)量濃度為 60 g·L-1，藥物與載體質(zhì)量比為1:30，PVPP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %，PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8 %。

2.8 最優(yōu)處方

通過對微球制備過程的各因素的考察，最終確定形成微球的最佳處方為：EC的二氯甲烷溶液的質(zhì)量濃度為60 g·L-1，連續(xù)相為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8 %的PVA水溶液，連續(xù)相、分散相體積比為1:8，藥物與載體質(zhì)量比為1:30，促釋劑PVPP的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %。

2.9 最優(yōu)處方的驗(yàn)證

按最優(yōu)處方制備3批樣品，對處方進(jìn)行驗(yàn)證。測定結(jié)果如下。

2.9.1 微球的形態(tài)

取適量最優(yōu)處方重復(fù)3批實(shí)驗(yàn)制備微球在掃描電子顯微鏡下觀察其外觀形態(tài)、大小，可見微球外觀圓整，表面帶有孔洞，大小較均勻，無粘連現(xiàn)象。如圖3所示。

2.9.2 微球的粒徑分布、載藥量及包封率

最優(yōu)處方重復(fù)3批實(shí)驗(yàn)制備微球的平均粒徑為80.03 μm，載藥量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0 %，包封率為（83.27±6.12）%，粒徑分布圖見圖4。

圖3 維A酸微球掃描電鏡圖Fig.3 SEM images of tretinoin microspheres

圖4 維A酸微球粒徑累積分布圖Fig. 4 The size distribution of tretinoin loaded microspheres

2.9.3體外釋放度的測定

以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的SDS為釋放介質(zhì)，最優(yōu)處方重復(fù)3批實(shí)驗(yàn)制備的微球的累計(jì)釋放曲線如圖5所示。

圖5 微A酸微球釋放曲線Fig.5 The release curve of tretinoin from microspheres

2.9.4 體外釋藥曲線擬合

對釋藥曲線進(jìn)行零級、一級、Higuchi方程以及Riter-Peppas方程擬合，各方程擬合結(jié)果見表3。

表3 微球釋放曲線擬合Tabale3 Coefficients of different mathematical models for in vitro tretinoin release from microspheres

由表3可知，微球體外釋放曲線按Ritger-Peppas方程擬合效果最好。

3 討論

a. 乳化-溶劑揮發(fā)法是制備微球的經(jīng)典方法，目前采用該方法研究最深入的材料主要是PLGA和PLA類，作者選擇的載體材料為來源豐富，價(jià)格低廉的乙基纖維素，拓展了該方法材料的適用范圍。

b. 投藥比是影響微球載藥量及包封率的主要關(guān)鍵因素，投藥比越高，微球的載藥量越高但包封率有所下降。乳化劑的能力、載體的濃度對載藥量也有影響，但不顯著。

c. 微球粒徑主要由攪拌速率、乳化劑強(qiáng)度等因素決定。攪拌速率越大，剪切力越大，微球粒徑越?。蝗榛瘎┎坏梢越档腿榈蔚谋砻鎻埩?，而且可以增加空間排斥力，同時(shí)能增加水相的粘度，起到助懸穩(wěn)定的作用，所以在一定范圍內(nèi)乳化劑濃度與微球的粒徑呈負(fù)相關(guān)。

d. 藥物的釋放曲線按Ritger-Peppas方程擬合效果最好。對于圓球制劑，當(dāng)k≤0.45時(shí)，藥物的釋放機(jī)制為Fick’s擴(kuò)散；當(dāng)0.45＜k＜0.85時(shí)，藥物的釋放機(jī)制為非Fick’s擴(kuò)散；當(dāng)k≥0.85時(shí)，藥物的釋放機(jī)制為骨架溶蝕[6]。而本文中的k=0.453，藥物的釋放主要是以非Fick’s擴(kuò)散為主，即擴(kuò)散與骨架溶蝕共同控制的機(jī)制。通過掃描電鏡圖可以看出作者制備的微球表面分布著很多孔洞，釋放介質(zhì)可經(jīng)微球表面的孔洞進(jìn)入微球內(nèi)部，維A酸溶解形成溶液，藥物從骨架內(nèi)擴(kuò)散進(jìn)入外部溶液，此時(shí)微球主要以擴(kuò)散機(jī)制釋藥；本文作者制備的微球中含有PVPP，具有強(qiáng)吸水膨脹性，使得微球的骨架逐漸溶蝕使藥物釋放出來，所以作者制備微球體外釋放是由擴(kuò)散與骨架溶蝕共同控制。

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Preparation and characterization of tretinoin microspheres

ZHAO Mei-ling1, WANG Jun-feng2,SU Lin-lin1,LI Ya-jing1, YANG Zhen1，DING Ping-tian1*
(1. School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China; 2. Shandong Weigao Pharmaceutical Co.,Ltd., Weihai 264200, China )

ObjectiveTo prepare ethyl cellulose (EC) microspheres of tretinoin. Methods The EC microspheres were prepared by solvent diffusion –evaporation method using ethyl cellulose as polymer. Formulation and process factors such as the concentration of polyvinyl alcohol(PVA) , ethyl cellulose, etc. were investigated with respect to the size and morphology of microspheres. The drug-loading,encapsulation efficiency and release rate of microspheres were tested by HPLC. Preparation parameters were optimized by orthogonal experiments and microspheres having good dispersion were obtained. Results The prepared microspheres were spherical and smooth in appearance, the particle size was uniform with average size of 80 μm. The drug loading were found to be 3.0%(w). Conclusion This preparation method of microspheres is simple and reproducible. These microspheres show narrow particle size distribution.

pharmaceutics; microspheres; solvent diffusion–evaporation method; tretinoin; orthogonal experiments; preparation

R94

A

（2014）01–0001–09

(本篇責(zé)任編輯：呂向一)

2014–1–9

趙美玲（1987-）,女（漢族）,山東臨沂人,碩士研究生, E-mail zml_sysph@163.com; ＊通訊作者：丁平田（1969-）,男（漢族），山東濰坊人,教授, 博士, 碩士生導(dǎo)師, 主要從事藥劑學(xué)研究, Tel. 024- 23986305 , E-mail dingpingtian@qq.com