目標(biāo)區(qū)域捕獲聯(lián)合新一代測(cè)序技術(shù)在遺傳性聾研究中的應(yīng)用及發(fā)展前景*

王洪陽(yáng) 綜述 王秋菊 審校

耳聾是最常見(jiàn)的遺傳異質(zhì)性疾病之一，大多數(shù)遺傳性聾是單基因病。自1988年第一個(gè)耳聾基因被定位，1995年第一個(gè)非綜合征型耳聾基因POU3F4被克隆以來(lái)，耳聾基因的定位及克隆研究取得了巨大進(jìn)展，目前已經(jīng)鑒定了76個(gè)非綜合征型耳聾相關(guān)基因，另外100多個(gè)已定位的耳聾基因座尚待相關(guān)基因的鑒定(截至2013年10月)[1]。在單基因病的致病基因定位和克隆研究中，通常采用的家系連鎖分析和定位克隆技術(shù)是最有效、最準(zhǔn)確的方法之一，但是，如果家系中患病人數(shù)有限或不外顯，或外顯不全，或是散發(fā)性病例，則連鎖分析多半失效。此外，以Sanger測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的測(cè)序技術(shù)因其高成本和長(zhǎng)耗時(shí)也限制了其應(yīng)用。新一代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing technology, NGS)為探索單基因病提供了新的途徑，因其無(wú)需收集大家系的樣本，且可對(duì)全外顯子組或全基因組的無(wú)偏倚測(cè)序，使得NGS在發(fā)現(xiàn)罕見(jiàn)遺傳病的病因方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，尤其是對(duì)遺傳性聾患者的全外顯子組或耳聾相關(guān)基因組(分別占全基因組的1%和0.01%)[2]進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域測(cè)序分析，捕獲的是疾病的大部分致病突變信息，具有所需樣本量少、費(fèi)用低、通量高的優(yōu)勢(shì)，能夠檢測(cè)更多的樣本，促進(jìn)了遺傳性聾新的致病變異的發(fā)現(xiàn)。本文聚焦于目標(biāo)區(qū)域捕獲聯(lián)合NGS在遺傳性聾基因研究中的應(yīng)用，尤其是該技術(shù)在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和新生兒聽(tīng)力篩查中的應(yīng)用前景，同時(shí)歸納了基因捕獲的主要方法和新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展及其特點(diǎn)。

1 新一代測(cè)序技術(shù)

基因組是研究人類疾病的核心和基礎(chǔ)，基因組技術(shù)的進(jìn)步徹底改變了鑒定人類基因突變的途徑。DNA測(cè)序技術(shù)發(fā)展的第一階段是以Sanger測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的第一代測(cè)序技術(shù)，2005年，Roche公司的454測(cè)序儀的出現(xiàn)標(biāo)志著NGS問(wèn)世，隨后，Illumina公司的Solexa測(cè)序儀和ABI公司的SOLiD測(cè)序儀相繼出現(xiàn)；不同的測(cè)序平臺(tái)在PCR模式、技術(shù)原理、測(cè)序模式及讀長(zhǎng)等方面各有特點(diǎn)(圖1)，NGS也稱大規(guī)模平行測(cè)序或深度測(cè)序，其低成本及高通量并行測(cè)序的優(yōu)勢(shì)，使疾病的研究模式發(fā)生了重大轉(zhuǎn)變，但同時(shí)也具有文庫(kù)構(gòu)建復(fù)雜、測(cè)序長(zhǎng)度短和錯(cuò)誤率偏高等缺點(diǎn)。為解決早期新一代測(cè)序技術(shù)的問(wèn)題，最近幾年出現(xiàn)了幾種新的高通量測(cè)序技術(shù)，通過(guò)改變測(cè)序原理或檢測(cè)手段，實(shí)現(xiàn)了更加簡(jiǎn)化的測(cè)序過(guò)程，更低的測(cè)序成本和更高的測(cè)序速度：如單分子測(cè)序，能夠直接觀察和測(cè)定DNA或RNA分子的數(shù)量和區(qū)域結(jié)構(gòu)，主要包括HeliScope公司的遺傳分析系統(tǒng)、VisiGen公司的單分子合成測(cè)序、Pacific Biosciences公司的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)以及Oxford納米孔測(cè)序技術(shù)等，這幾種新技術(shù)也被稱為第三代高通量測(cè)序技術(shù)(third-generation sequencing technology, TGS)[3]，三代測(cè)序技術(shù)各有其優(yōu)缺點(diǎn)，其特點(diǎn)比較見(jiàn)表1。

圖1 新一代測(cè)序平臺(tái)比較[3]

表1 第一～三代測(cè)序技術(shù)的特點(diǎn)比較

2 目標(biāo)區(qū)域捕獲技術(shù)

2.1DNA水平的測(cè)序策略 目標(biāo)區(qū)域捕獲聯(lián)合NGS是利用定制的探針與基因組DNA進(jìn)行雜交或PCR捕獲感興趣的基因組區(qū)域，然后應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序的策略，具有經(jīng)濟(jì)、精確、可行、周轉(zhuǎn)時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)，能夠檢測(cè)更多的樣本。有文獻(xiàn)報(bào)道85%的人類致病突變位于占全基因組序列1%的蛋白質(zhì)編碼序列，即外顯子序列上[7]。針對(duì)基因組蛋白質(zhì)編碼區(qū)的全外顯子組測(cè)序(whole exome sequencing, WES)是介于全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS)與全基因組測(cè)序(whole genome sequencing, WGS)之間的基因分析策略[8]，利用目標(biāo)區(qū)域捕獲將基因組的全部外顯子區(qū)域捕獲后進(jìn)行高通量測(cè)序，以發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)遺傳變異，其本質(zhì)上也是一種目標(biāo)區(qū)域測(cè)序技術(shù)，可以發(fā)現(xiàn)基因編碼區(qū)的低頻變異及對(duì)疾病具有不同效應(yīng)的稀有變異。與全基因組測(cè)序相比，在相同成本下，目標(biāo)區(qū)域測(cè)序技術(shù)可對(duì)更多個(gè)體的蛋白編碼信息進(jìn)行研究，可獲得覆蓋度更深、準(zhǔn)確性更高的數(shù)據(jù)。目標(biāo)區(qū)域捕獲技術(shù)具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、高效的優(yōu)勢(shì)，可用于單基因病、復(fù)雜疾病及癌癥等的致病基因或易感基因的研究[9,10]。過(guò)去兩年中，WES已鑒定了1 000多種罕見(jiàn)單基因病的基因[10]。

2.2不同目標(biāo)區(qū)域捕獲技術(shù)的比較 傳統(tǒng)的靶向富集技術(shù)是PCR和雜交，現(xiàn)今的靶向富集技術(shù)可以分為固相捕獲、液相捕獲、分子倒位探針(molecular inversion probes, MIP)和Spacer Multiplex Amplification Reac Tion(SMART)(表2)，其中固相捕獲及液相捕獲是以雜交為基礎(chǔ)的富集技術(shù)，而MIP和SMART是以PCR為基礎(chǔ)的非雜交富集技術(shù)，后兩者需要特殊的設(shè)備，不適用于高通量應(yīng)用，因此只應(yīng)用于特殊的基因測(cè)序；固相捕獲以芯片為載體，與設(shè)計(jì)的探針序列進(jìn)行耦聯(lián)，進(jìn)而對(duì)雜交后富集的DNA片段進(jìn)行測(cè)序分析；液相捕獲原理與固相芯片捕獲相似，只是同探針進(jìn)行耦聯(lián)的是微珠而非固相載體芯片。與固相芯片相比，液相捕獲具有成本低、操作簡(jiǎn)便、所需DNA量少等優(yōu)勢(shì)[12]。

表2 常用靶向富集技術(shù)比較[11]

注：*CTR(capture target region)為目標(biāo)捕獲區(qū)域

3 目標(biāo)區(qū)域捕獲聯(lián)合NGS在遺傳性聾研究中的應(yīng)用

眾所周知，不同民族的耳聾基因突變頻率不同，目前多數(shù)耳聾基因研究局限于人類最常見(jiàn)的突變基因，以中國(guó)大陸人群為例，30%左右的遺傳性聾患者與GJB2、SLC26A4和線粒體12SrRNA突變有關(guān)，可通過(guò)常見(jiàn)的耳聾基因篩查明確診斷，而另外的70%左右的遺傳性聾卻無(wú)法明確病因，需要進(jìn)行深度挖掘[13]。因?yàn)閷?dǎo)致耳聾的大量致病基因以及復(fù)雜突變譜的存在，以基因特異性的Sanger測(cè)序作為遺傳性聾的基因診斷策略成本高、耗時(shí)長(zhǎng)，且不同民族的常見(jiàn)基因突變不同也使其應(yīng)用受限[2]。目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序?yàn)槎@基因研究提供了新的路徑，可在一次檢測(cè)中包含所有已知耳聾基因，檢測(cè)所有類型的突變，并可檢測(cè)傳統(tǒng)方法難以檢測(cè)的大基因，同時(shí)可應(yīng)用于散發(fā)病例，是目前研究遺傳性聾的有效技術(shù)。2009年11月，Nature Genetics在線發(fā)表了首篇應(yīng)用WES研究單基因病的論文，在3個(gè)家庭的4個(gè)米勒綜合征患者中篩選出致病基因DHODH[14]，首次證明了WES是快速定位單基因病致病基因的有效工具；此后，WES在單基因病研究中發(fā)揮了越來(lái)越多的重要作用，據(jù)估計(jì)WES可發(fā)現(xiàn)約60%單基因病的致病基因[15]。

3.1目標(biāo)區(qū)域測(cè)序在遺傳性聾研究中的應(yīng)用實(shí)例 目標(biāo)區(qū)域捕獲聯(lián)合新一代測(cè)序途徑最近也鑒定出新的遺傳性聾基因，這些研究表明針對(duì)目標(biāo)區(qū)域或全外顯子組的NGS，結(jié)合在非同源家系中驗(yàn)證、功能和免疫標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)，可以在小家系中鑒定致病基因。最先應(yīng)用這一策略的是Rehman等[16]，利用NimbleGen固相捕獲芯片技術(shù)，結(jié)合Roche 454測(cè)序儀鑒定了導(dǎo)致非綜合征型聾的致病基因C9orf75(之后重命名為TPRN)；首先捕獲了DFNB79位于染色體9q34.3(包含108個(gè)候選基因)的目標(biāo)區(qū)域，然后對(duì)該2.9 Mbp的區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，在一個(gè)近親家系中患者的目標(biāo)區(qū)域檢測(cè)到8個(gè)尚未報(bào)道的純合變異，其中6個(gè)是多態(tài)性表現(xiàn)，1個(gè)位于非編碼區(qū)，另外1個(gè)是位于所預(yù)測(cè)基因C9orf75上的一個(gè)無(wú)義突變；此后在針對(duì)DFNB79患者的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)了該基因的3個(gè)移碼突變，免疫標(biāo)記也顯示小鼠耳蝸中TPRN編碼蛋白高表達(dá)。此后，特定區(qū)域捕獲或全外顯子組捕獲技術(shù)成功應(yīng)用于多型耳聾分子基礎(chǔ)的研究(表3)。近兩年，目標(biāo)區(qū)域捕獲聯(lián)合NGS開(kāi)始應(yīng)用于小規(guī)模人群研究，為建立耳聾分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及篩選熱點(diǎn)突變組合奠定了基礎(chǔ)；Shearer等[38]對(duì)100例非綜合征型遺傳性聾樣本進(jìn)行捕獲測(cè)序，涵蓋了67個(gè)已知耳聾基因990個(gè)基因變異，診斷率為42%；楊濤等[39]對(duì)125個(gè)排除了常見(jiàn)致病突變的耳聾樣本進(jìn)行捕獲測(cè)序，捕獲區(qū)域包括79個(gè)已知耳聾基因，最后在15個(gè)非常見(jiàn)基因上鑒定了28個(gè)致病突變，診斷率為17.4%。小規(guī)模人群研究一方面說(shuō)明已知耳聾基因捕獲測(cè)序與常見(jiàn)耳聾基因篩查相比，提高了耳聾基因診斷率，另一方面也說(shuō)明耳聾基因研究任重而道遠(yuǎn)，仍有一半以上的遺傳性聾病因不明，有待進(jìn)一步的研究。

表3 目標(biāo)區(qū)域捕獲聯(lián)合新一代測(cè)序技術(shù)在聽(tīng)力研究中的應(yīng)用

3.2目標(biāo)區(qū)域測(cè)序可行性的驗(yàn)證 最近的一些研究從多方面驗(yàn)證了NGS檢測(cè)遺傳性聾的可行性(表4)。Shearer等[12]評(píng)價(jià)了針對(duì)54個(gè)已知的非綜合征型耳聾基因進(jìn)行靶向富集聯(lián)合新一代測(cè)序技術(shù)的可行性，目標(biāo)基因的捕獲同時(shí)使用了固相捕獲和液相捕獲，并對(duì)Sureselect-Illumina和NimbleGen-454兩個(gè)平臺(tái)進(jìn)行了比較，結(jié)果在6個(gè)特發(fā)性聾樣本中鑒定了5個(gè)致病突變，對(duì)目標(biāo)區(qū)域測(cè)序在耳聾遺傳診斷方面的敏感度、特異度和可重復(fù)性給予了肯定。Brownstein等[25]應(yīng)用的是包含246個(gè)耳聾相關(guān)基因的cRNA寡核苷酸探針(82個(gè)人類蛋白編碼基因，2個(gè)人miRNA和162個(gè)小鼠耳聾基因中人的同源基因)，從11個(gè)先證者的外周血中獲得配對(duì)末端庫(kù)，應(yīng)用Illumina的NGS平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果在6例先證者中發(fā)現(xiàn)了致病突變，分別位于CDH23、MYO15A、TECTA、TMC1和WFS1，并在另外的20例先證者及其家系中鑒定了致病等位基因；同時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)了摩洛哥猶太人群中TMC1上的一個(gè)始祖等位基因突變，僅該隱性突變TMC1(p.S647P)就可解釋摩洛哥猶太人群中34%的遺傳性聾。在針對(duì)中國(guó)人的目標(biāo)區(qū)域測(cè)序中，Wei等[40]設(shè)計(jì)了包含69個(gè)耳聾相關(guān)基因的芯片，該芯片首次加入了線粒體基因，然后對(duì)攜帶有5個(gè)已知突變的10個(gè)患者進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域測(cè)序，驗(yàn)證了該方法的可行性及應(yīng)用價(jià)值，隨后在一個(gè)耳聾家系中鑒定了基因MYO7A上的復(fù)合雜合突變。盡管可行性多次得到驗(yàn)證且碩果累累，但捕獲目標(biāo)外顯子的高昂費(fèi)用仍是限制NGS在人群中大規(guī)模應(yīng)用的主要阻礙。新的捕獲測(cè)序策略不斷出現(xiàn)，例如Tang等[42]設(shè)計(jì)了一個(gè)cDNA探針來(lái)進(jìn)行目標(biāo)基因的富集以降低費(fèi)用，Keulenaer等應(yīng)用半自動(dòng)PCR擴(kuò)增聯(lián)合NGS，克服了以雜交為基礎(chǔ)的目標(biāo)區(qū)域捕獲敏感性差的缺點(diǎn)[32]。

表4 近3年驗(yàn)證NGS檢測(cè)耳聾基因診斷效用的文獻(xiàn)

3.3面臨的挑戰(zhàn) NGS途徑產(chǎn)生的突變結(jié)果仍需Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，數(shù)據(jù)質(zhì)控缺乏管理監(jiān)督，數(shù)據(jù)分析及數(shù)據(jù)報(bào)道的無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)均限制了它的快速發(fā)展[45]。如何使不同的NGS平臺(tái)的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化以便進(jìn)行比較仍然懸而未決[46]，而因其測(cè)序時(shí)重復(fù)區(qū)域的堿基延伸的不可靠性而導(dǎo)致的錯(cuò)誤率偏高問(wèn)題亦亟待解決[47]，樣品準(zhǔn)備和文庫(kù)構(gòu)建尚待簡(jiǎn)化，海量數(shù)據(jù)的分類、存檔、分析仍是難題。技術(shù)層面之外，倫理問(wèn)題不容小視，從NGS海量數(shù)據(jù)中可以推測(cè)出許多屬個(gè)人隱私信息，甚至是親屬及相關(guān)民族的信息，盡管各單位倫理委員會(huì)對(duì)患者信息和數(shù)據(jù)的使用和儲(chǔ)存有嚴(yán)格的規(guī)定，目前仍缺乏對(duì)NGS數(shù)據(jù)使用管理的專一規(guī)則。此外，外顯子組測(cè)序技術(shù)的固有缺陷使其只能捕獲外顯子區(qū)域內(nèi)部和邊界的變異信息，對(duì)大部分發(fā)生在非編碼區(qū)的變異無(wú)能為力，且不能檢測(cè)到基因組內(nèi)較大的結(jié)構(gòu)變異和基因拷貝數(shù)變化。

3.4應(yīng)用前景 NGS的應(yīng)用正在進(jìn)入臨床實(shí)踐，臨床醫(yī)生有必要掌握醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)的知識(shí)，以便更有效地進(jìn)行疾病的診斷、治療、咨詢和預(yù)防。然而對(duì)數(shù)據(jù)的解釋分析及將探索結(jié)果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用仍然充滿挑戰(zhàn)，目前最迫切的任務(wù)是從個(gè)人基因組上百萬(wàn)的變異中篩選出致病突變。另一個(gè)很重要的方面是需同時(shí)提高遺傳咨詢能力，以解釋NGS產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)。不久的將來(lái)，臨床醫(yī)生有可能通過(guò)綜合分析既往史、家族史和NGS數(shù)據(jù)，鑒定有疾病傾向的變異以及個(gè)體中影響藥物代謝的變異，遺傳性疾病攜帶者也可能成為患者既往史的一部分?；蚪M學(xué)的發(fā)展很有可能最終導(dǎo)致遺傳醫(yī)學(xué)的誕生，推進(jìn)人類健康的重大進(jìn)步和發(fā)展[48]。

另一可能的應(yīng)用方向是新生兒耳聾基因篩查。2000年我國(guó)開(kāi)始在全國(guó)范圍內(nèi)開(kāi)展新生兒聽(tīng)力篩查工作，新生兒聽(tīng)力篩查對(duì)耳聾的早期預(yù)防和干預(yù)意義重大，然而傳統(tǒng)的聽(tīng)力篩查有假陽(yáng)性率高、不能確定耳聾的潛在病因、不能發(fā)現(xiàn)遲發(fā)性聾以及隨訪率低等缺點(diǎn)。大多數(shù)先天性和兒童早期發(fā)病的耳聾是基因突變導(dǎo)致的，耳聾遺傳信息對(duì)于疾病的診斷、治療及遺傳咨詢有重大意義。新生兒聽(tīng)力與基因聯(lián)合篩查具有指導(dǎo)抗生素應(yīng)用、指導(dǎo)部分耳聾患者減緩耳聾的發(fā)展、預(yù)測(cè)人工耳蝸植入的效果以及進(jìn)行遺傳咨詢、評(píng)價(jià)再次生育子女出現(xiàn)耳聾的幾率等意義[49]。隨著目標(biāo)區(qū)域捕獲和NGS的發(fā)展，可以通過(guò)一次實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)所有已知和候選的耳聾基因[25]，從而使具有高度遺傳異質(zhì)性耳聾的DNA診斷取得重大進(jìn)展。

此外，隨著臨床轉(zhuǎn)化的逐步成熟，目標(biāo)區(qū)域NGS還有望應(yīng)用于高危人群的檢查、聾啞患者生育風(fēng)險(xiǎn)檢測(cè)及評(píng)估以利于優(yōu)生優(yōu)育。新一代測(cè)序平臺(tái)的高靈敏性，可對(duì)孕婦血漿中存在的微量胎兒DNA進(jìn)行檢測(cè)，可針對(duì)包括遺傳性聾在內(nèi)的100種常見(jiàn)疾病的常見(jiàn)基因進(jìn)行捕獲測(cè)序，實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前篩查及對(duì)遺傳性疾病的分析。

4 總結(jié)和展望

高通量及低成本的NGS極大地促進(jìn)了遺傳性聾基因組學(xué)的研究進(jìn)展，其中包括全外顯子組捕獲在內(nèi)的目標(biāo)區(qū)域捕獲聯(lián)合新一代測(cè)序技術(shù)在遺傳性聾研究中具有廣泛的應(yīng)用前景，作為全基因組測(cè)序的重要補(bǔ)充，研究者可以根據(jù)研究需要選擇合適的基因測(cè)序策略，從而更加經(jīng)濟(jì)高效地完成基因測(cè)序目的。然而，該技術(shù)的臨床應(yīng)用仍然充滿挑戰(zhàn)，數(shù)據(jù)的分析管理等諸多問(wèn)題有待解決，生物學(xué)信息的發(fā)展及管理制度的完善將有助于該技術(shù)更好地應(yīng)用。此外，基因組水平研究是整個(gè)疾病研究的基礎(chǔ)，為了全面深入揭示遺傳性疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律及遺傳特點(diǎn)，除基因組水平研究外，基于新一代測(cè)序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組、蛋白組及表觀組、宏基因組的系統(tǒng)研究是未來(lái)遺傳性疾病的研究趨勢(shì)，進(jìn)而更好地為臨床篩查以及診治遺傳性疾病提供思路。

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