內(nèi)耳注入攜帶IL-4基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對豚鼠免疫性內(nèi)耳病基因治療的研究△

郭浪 譚長強(qiáng) 劉樹森 江萍 衡偉偉

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone-marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有多向分化潛能及在體內(nèi)可向急性損傷部位遷移的特性，已成為干細(xì)胞治療研究的熱點，也逐漸成為基因治療的主要靶細(xì)胞之一。體外實驗顯示基因轉(zhuǎn)染的BMSCs能較長時間表達(dá)外源基因，這使得基因修飾的BMSCs治療疾病成為可能。利用慢病毒載體能高效感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，使其成為基因治療的載體再植入內(nèi)耳的方法，與重組慢病毒載體直接注入轉(zhuǎn)染內(nèi)耳組織相比較，可準(zhǔn)確了解和調(diào)控導(dǎo)入基因的量；通過體內(nèi)該載體干細(xì)胞移植，使治療基因更集中在病變部位，減少病毒載體的使用量從而減少不良事件的發(fā)生；而且已有研究證實BMSCs對許多自身免疫性疾病的免疫炎性病理損傷有較好的調(diào)節(jié)和治療效果[1]。

白細(xì)胞介素4(IL-4)是Ⅱ型輔助T細(xì)胞(Th2細(xì)胞)分泌的細(xì)胞因子，它在調(diào)節(jié)體液免疫和適應(yīng)性免疫中起關(guān)鍵作用。IL-4質(zhì)粒或腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的IL-4基因，經(jīng)肌肉注射或關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射可使類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病變得到緩解[2]。研究發(fā)現(xiàn)IL-4與凋亡蛋白FasL聯(lián)合作為免疫性損傷治療均可達(dá)到抗炎目的[3]。因此，本研究選擇BMSCs作為IL-4基因的細(xì)胞載體，注入免疫性內(nèi)耳病豚鼠之內(nèi)耳，探討其對免疫性內(nèi)耳病的炎性損傷及由此所造成的聽覺功能障礙的影響和治療作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康6～8周齡白毛紅目豚鼠65只，雌雄不拘，體重250～300 g，耳廓反射正常，耳鏡檢查排除中耳疾患，所有動物均由南京青龍山動物養(yǎng)殖場提供。

1.2抗原 鑰孔嘁血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyani, KLH)：為一種深海的軟體動物體內(nèi)提取的純化蛋白(購自美國sigma公司)。

1.3免疫性內(nèi)耳病動物模型制備 500 μg KLH溶解于250 μl PBS中，與等量完全弗氏佐劑混勻后，注射于豚鼠右后足墊。2周后，500 μg KLH溶解于250 μl PBS中，與等量不完全弗氏佐劑混勻，背部多點皮下注射，加強(qiáng)免疫。2周后，再在圓窗龕局部免疫。最后一次加強(qiáng)免疫兩周后，依據(jù)聽覺誘發(fā)電位波Ⅲ的閾值升高(超過免疫前全部動物均值2倍標(biāo)準(zhǔn)差)和血清中抗KLH特異性抗體水平升高(ELISA法，波長490 nm，A值超過免疫前全部動物均值加2倍標(biāo)準(zhǔn)差)，判斷為免疫性內(nèi)耳病模型動物[4]。共有55只動物造模成功。

1.4BMSCs的獲取、培養(yǎng)與標(biāo)記

1.4.1取股骨 取3～4周、體重250 g左右白毛紅目豚鼠，乙醚麻醉后，斷頸處死，剪開大腿部皮膚，肌肉，暴露股骨，注意勿損傷血管，分離出兩側(cè)股骨，置于培養(yǎng)皿中的滅菌PBS液中，浸泡5分鐘。

1.4.2分離、培養(yǎng)BMSCs 含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基5 ml置于培養(yǎng)皿中，剪斷股骨兩端，用5 ml注射器反復(fù)吹出股骨中的骨髓組織，均勻后離心，棄上清及脂肪層，加入培養(yǎng)基，細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度接種在培養(yǎng)瓶中(以上操作均在超凈臺中進(jìn)行)。

1.4.3培養(yǎng)與傳代 待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%基本融合后，用0.25%的胰蛋白酶消化，1:2的比例繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.4.4BMSCs獲取 利用改良直接貼壁法[5，6]獲得豚鼠BMSCs，置于DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)、傳代。傳代3次后，獲得純度較高的BMSCs(圖1)，備慢病毒感染使用。

1.5慢病毒載體的包裝和重組慢病毒載體的鑒定

1.5.1慢病毒載體的包裝和標(biāo)記 慢病毒載體包膜質(zhì)粒pVSG，包裝質(zhì)粒pHELPER、載體質(zhì)粒pNL-IRES2.EGFP按1:1:1的比例混勻，總量8 mg，加入高糖DMEM培養(yǎng)基至0.5 ml，混合均勻。經(jīng)過室溫孵育、更換培養(yǎng)液等流程，24 h后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況。轉(zhuǎn)染后48、72 h收集含病毒上清，4 500 r/min離心20 min收集上清，保存于-70 ℃?zhèn)溆?上海迪奧生物科研所提供)。

圖1 倒置顯微鏡下見到的第三代BMSCs(×100)呈均勻一致的紡錘形，融合成旋渦狀

5.2重組慢病毒pll3.7-IL-4鑒定 將pll3.7-IL-4慢病毒液2ml感染80%融合的293細(xì)胞，待單層細(xì)胞大部分變圓但尚未脫落時收集細(xì)胞，反復(fù)凍融3次，取少許提取慢病毒DNA，進(jìn)行PCR鑒定(圖2)。

1.6慢病毒載體感染BMSCs 體外培養(yǎng)的BMSCs擴(kuò)增至第3代，細(xì)胞達(dá)80%融合，吸棄培養(yǎng)基，每個25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶加入1×108/ml重組IL-4慢病毒15 μl，同時加入聚凝胺至終濃度為8 mg/L，8 h后更換為低糖DMEM完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后熒光顯微鏡觀察，并復(fù)染；48 h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，陽性呈明亮的黃綠色(圖3，A、B、C、D組均可見綠色熒光)；當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)90%，可進(jìn)行傳代。以慢病毒感染BMSCs的cDNA為模板進(jìn)行PCR檢測慢病毒載體基因(圖4)?？蛰dBMSCs制取步驟同上，但感染BMSCs的慢病毒為未重組IL-4基因的空載體。感染成功的BMSCs備用于內(nèi)耳植入。

圖3 慢病毒感染BMSCs 48 h后熒光顯微鏡下圖像(×200) a、b示A、B組均可見綠色熒光，c示E組未見熒光顯示

圖4 RT-PCR分析結(jié)果

1.7實驗分組和BMSCs的內(nèi)耳移植(重組基因載體鼓階內(nèi)注射)

1.7.1分組 將造模成功的55只模型動物按配對設(shè)計分為A、B、C、D、E五組(每組11只)： BMSCs載體組(A組)：內(nèi)耳注入重組慢病毒感染成功的IL-4基因修飾BMSCs懸液；BMSCs空載體對照組(B組)：內(nèi)耳注入未攜帶IL-4基因慢病毒空載體感染成功的BMSCs懸液；重組慢病毒IL-4基因組(C組)：內(nèi)耳注入重組慢病毒IL-4基因稀釋液；慢病毒空載體對照組(D組)：內(nèi)耳注入慢病毒空載體稀釋液；模擬手術(shù)對照組(E組)：內(nèi)耳注入PBS溶液。其中A、B為細(xì)胞植入組，C、D為慢病毒組。注入的液體量均為20 μl[(BMSCs懸液中約含BMSCs(1.5～2.0)×106，慢病毒濃縮液濃度為0.5×108pfu]。

1.7.2BMSCs及重組慢病毒內(nèi)耳的注入 將上述感染成功的BMSCs(G3)用胰酶消化、離心并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)后，制備成(1.0～2.0)×1010/L的細(xì)胞懸液；將重組慢病毒濃縮液用PBS液稀釋為濃度為0.5×108pfu的液體；圓窗龕局部免疫后2周，豚鼠麻醉后，在耳廓后方作一切口，分離皮下肌肉與筋膜，顯露聽泡，用微型電鉆打開聽泡，暴露耳蝸底回，在鼓階側(cè)壁的骨壁鉆一針尖大小的孔(不穿透內(nèi)骨膜)，用微推進(jìn)器將小兒頭皮針的針尖插入鼓階，深度不超過1 mm，先抽掉等量的外淋巴液，依據(jù)分組，用微量注射機(jī)將BMSC細(xì)胞懸液、重組慢病毒液或PBS(1 μl/min)注入鼓階，骨蠟封閉耳蝸底回的骨孔。抗生素沖洗中耳腔三次，骨蠟封閉聽泡骨孔，逐層縫合傷口。所有操作均在無菌條件下進(jìn)行。

1.8觀察指標(biāo)

1.8.1特異性免疫反應(yīng)測試 分別于免疫前、圓窗龕局部免疫后2周、鼓階內(nèi)植入術(shù)后1周(即末次聽覺功能測試后)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測特異性血清中抗KLH抗體水平。心臟采血(每組各取2只動物)，分離血清,經(jīng)包被、封閉、孵育、洗版五次后加入3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺(3,3,5,5-tetramethyl benzidine, TMB)底物溶液，顯色10 min后，用H2SO4終止顯色，在酶標(biāo)儀下測定波長為490 nm的吸光度A值。

1.8.2ABR測試 分別于免疫前、圓窗龕局部免疫后2周、鼓階內(nèi)植入術(shù)后1周，采用BioSig SystemⅢ聽覺研究系統(tǒng)(TDT system 3)(美國TDT公司)測試ABR。

1.8.3內(nèi)耳光鏡觀察 各組分別于圓窗龕局部免疫后2周、鼓階內(nèi)植入術(shù)后1周，ABR測試后，每次各取2只豚鼠，麻醉后斷頭，立即取出顳骨，打開聽泡，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、定向包埋。耳蝸中軸切片，片厚5 μm，漂片、撈片、粘片，常規(guī)HE染色，封片，光鏡觀察和照相。

1.8.4免疫組織化學(xué)染色

1.8.4.1內(nèi)耳石蠟包埋和切片制備 各組于鼓階內(nèi)植入術(shù)后1周，聽覺測試后，將剩余豚鼠麻醉、斷頭，取出聽泡，挑開圓窗，在蝸尖鉆一小孔，快速灌注數(shù)次，固定12小時，采用EDTA脫鈣一周，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、定向包埋。

1.8.4.2免疫熒光染色 每組4只(8耳)的蠟塊行耳蝸中軸切片，片厚4 μm，漂片、撈片、粘片后常規(guī)脫蠟至水，在熒光顯微鏡下行染色顯影觀察和照相。

1.8.4.3酶免疫組織化學(xué)染色 每組3只(6耳)按上述方法獲得耳蝸石蠟切片，用胰酶修復(fù)抗原，血清封閉、孵育、DAB染色， 樹脂封片， 光學(xué)顯微鏡觀察照相。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 用t檢驗對各組實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)比較。

2 結(jié)果

2.1特異性免疫反應(yīng)試驗結(jié)果 與免疫前相比，各實驗組和對照組免疫后血清中抗KLH抗體水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；免疫前、免疫后的各組間對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；細(xì)胞植入內(nèi)耳后與免疫后結(jié)果相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 各組免疫前后和鼓階注射后血清中針對KLH抗體水平(A值，

注：*與同組免疫前比較，P<0.05

2.2ABR檢測結(jié)果 各組ABR波Ⅲ反應(yīng)閾見表2，與免疫前相比，免疫后各組ABR閾值升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與KLH抗原免疫后相比， A、B和C組鼓階植入IL-4基因的重組慢血毒載體后ABR平均閾值降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，A組平均閾值降低更為明顯， D、E組鼓階植入前后對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。各組分別以其免疫后的ABR平均閾值減2倍標(biāo)準(zhǔn)差作為判斷治療后聽功能改善標(biāo)準(zhǔn)，A組有9只(16耳)、B組有8只(15耳)、C組有7只(12耳)局部基因治療后聽功能改善，治療有效率分別為72.73%(16/22)、68.18%(15/22)和54.55%(12/22)，各組分別有1或2耳并發(fā)中耳腔感染不計。D、E兩組內(nèi)耳局部給藥后聽功能無明顯改善。

表2 各組免疫前后及鼓階植入重組基因載體后ABR反應(yīng)閾

注：*與免疫前同側(cè)耳比較，P<0.05;△與免疫后同側(cè)耳比較，P<0.05

2.3內(nèi)耳光鏡觀察結(jié)果(圖5) E組免疫后耳蝸縱軸切片見鼓階內(nèi)出現(xiàn)積(出)血，B組內(nèi)耳細(xì)胞植入1周后耳蝸縱軸切片可見鼓階內(nèi)有絮狀物，D組內(nèi)耳空載慢病毒注入后1周耳蝸縱軸切片見螺旋神經(jīng)節(jié)內(nèi)出現(xiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤，A組內(nèi)耳局部轉(zhuǎn)染細(xì)胞植入后1周耳蝸縱軸切片見螺旋神經(jīng)節(jié)結(jié)構(gòu)基本正常，C組內(nèi)耳慢病毒IL-4注入后耳蝸縱軸切片可見除鼓階漂浮樣絮狀物外，其余未見明顯異常。

2.4免疫熒光組織化學(xué)試驗結(jié)果

2.4.1細(xì)胞免疫熒光自顯影觀察 鼓階內(nèi)局部注射一周后，A組(圖6a)和B組(圖6b)鼓階內(nèi)有顯著熒光反應(yīng)的細(xì)胞團(tuán)塊，A組血管紋亦有熒光顯色，B組前庭膜下、骨螺旋板唇部、Corti器等部位亦有熒光顯示。A、B組見細(xì)胞有向前庭階及基底膜等處遷移的改變(圖6c、d)，而E組(圖6e)則未見明顯熒光顯色。

圖5 各組內(nèi)耳光鏡觀察結(jié)果 a～d分別為E、B、D、A組(×400)；e為C組(×100)

圖6 A、B兩組細(xì)胞免疫熒光染色觀察結(jié)果(×200)

圖7 C、D兩組耳蝸縱軸切片慢病毒免疫熒光染色觀察結(jié)果

圖8 各組耳蝸縱軸切片酶免疫組織化學(xué)染色觀察結(jié)果

2.4.2慢病毒免疫熒光觀察結(jié)果 見圖7。

2.5各組酶免疫組織化學(xué)試驗結(jié)果 見圖8。

3 討論

免疫損傷相關(guān)內(nèi)耳病的病因和發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，臨床缺乏特異性診斷方法，其治療主要是應(yīng)用皮質(zhì)激素或免疫抑制劑，雖然在早期有一定的療效，但毒副作用多、且停藥后易復(fù)發(fā)。而內(nèi)耳局部注入藥物與全身給藥相比，有四大優(yōu)點[7～9]：① 目的性強(qiáng)，藥物-靶定位性好；②可避開血-迷路屏障，直接進(jìn)入內(nèi)耳；③ 淋巴液中藥物濃度最高；④無全身副作用。本實驗的前期實驗已發(fā)現(xiàn)內(nèi)耳局部注射比全身及中耳腔注射給藥更能達(dá)到局部高濃度；而基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞移植是一種傳遞基因到內(nèi)耳的有效治療策略。

本研究采用深海軟體動物提取的純化鑰孔嘁血藍(lán)蛋白(KLH)抗原加弗氏佐劑免疫豚鼠，成功制成了免疫源性內(nèi)耳病動物模型，成功構(gòu)建了IL-4基因的重組慢病毒載體(以下簡稱重組慢病毒載體)，并將該重組載體感染從豚鼠股骨干提取并培養(yǎng)的BMSCs，使其感染成功，并經(jīng)鼓階注射的方法導(dǎo)入豚鼠內(nèi)耳，結(jié)果顯示，植入內(nèi)耳后1周，重組慢病毒載體修飾的BMSCs可以成功轉(zhuǎn)染內(nèi)耳，主要分布于鼓階，而且發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在植入內(nèi)耳1周時向前庭階、Corti器、血管紋、骨螺旋板的蝸管內(nèi)唇部有遷移現(xiàn)象；可見實驗組鼓階和前庭階內(nèi)有干細(xì)胞團(tuán)塊，另外在骨螺旋板的唇部、Corti器、螺旋神經(jīng)節(jié)等部位亦有弱陽性酶反應(yīng)顯色；實驗細(xì)胞空載體對照組鼓階內(nèi)有漂浮的細(xì)胞樣團(tuán)，而對照組無明顯酶反應(yīng)陽性顯色；另外，結(jié)果還顯示，重組慢病毒可以成功轉(zhuǎn)染豚鼠內(nèi)耳，綠色熒光分布廣泛，主要集中于耳蝸骨壁、骨螺旋板的蝸管內(nèi)唇部、螺旋韌帶和血管紋、基底膜等處等部位，IL-4基因表達(dá)產(chǎn)物主要布于螺旋神經(jīng)節(jié)、Corti器、血管紋、耳蝸骨壁以及骨螺旋板的蝸管內(nèi)唇部等部位。

文中結(jié)果顯示經(jīng)鼓階注入IL-4基因的重組慢病毒載體后，BMSCs載體組、BMSCs空載對照組、重組慢病毒IL-4基因組ABR反應(yīng)閾平均值較免疫后有不同程度降低，且以BMSCs載體組明顯，表明IL-4因子對免疫性內(nèi)耳病的免疫炎性損傷有一定程度的調(diào)節(jié)和治療作用，BMSCs具有低免疫原性免疫抑制功能，可作為一種載體將重組IL-4基因遷移至組織病變部位，有向病變部位遷移、聚集的作用，產(chǎn)生的IL-4基因產(chǎn)物可增強(qiáng)這一作用并在該部位緩慢并且持續(xù)產(chǎn)生基因產(chǎn)物IL-4，起到一定的治療作用。另外，慢病毒基因組雖在一定程度上可以感染內(nèi)耳，并表達(dá)一定的基因產(chǎn)物，但其對聽損傷和內(nèi)耳病理炎性損傷治療效果不及BMSCs載體組，且其對內(nèi)耳是否有毒性還存在一定的爭議。

另外，本研究表明單一鼓階內(nèi)的一點注射可以使BMSCs較為廣泛地分布于內(nèi)耳各部位組織中，依據(jù)內(nèi)耳解剖學(xué)和組織學(xué)特點，推測除了BMSCs有向病變部位遷移的可能外，可能還有三個途徑使植入細(xì)胞從鼓階分布到蝸管：①通過骨螺旋板下層中的小孔與鼓階的外淋巴液相交通；②通過蝸神經(jīng)纖維穿過的細(xì)孔與鼓階的外淋巴液相交通；③鼓階和前庭階在頂回以蝸孔相交通，蝸管中的內(nèi)淋巴液通過前庭膜與外淋巴液相交通。尚有待進(jìn)一步研究證實。

近來有報道基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞移植是一種傳遞基因到內(nèi)耳的有效治療策略，Sharifa等[10]通過研究BMSCs細(xì)胞移植入正常C57BL/6小鼠耳蝸的分布特點和形態(tài)，評估BMSCs作為在耳蝸的細(xì)胞移植的替代治療的潛能；他還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)BMSCs移植入病理損傷的內(nèi)耳后，BMSCs源性細(xì)胞向有損傷部位遷移的現(xiàn)象，表明BMSCs不僅可以參與免疫炎性病理損傷的調(diào)節(jié)和治療，還可以作為種子細(xì)胞載體把攜帶目的基因的治療因子遷移到損傷部位而發(fā)揮治療作用；因此，使BMSCs安全有效的應(yīng)用于自身免疫性內(nèi)耳病還有許多工作要做。相信隨著這些難題的解決，可以用它為自身免疫性疾病患者減輕藥物副作用帶來的痛苦，并達(dá)到有針對性和特異性的治療目的，為BMSCS在免疫性內(nèi)耳病的研究與治療提供廣闊前景。

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