15N穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)在草地生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)中的研究進(jìn)展

，，

(1.中國(guó)科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130102；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.中國(guó)大安堿地生態(tài)試驗(yàn)站，吉林 大安 131317)

0 引 言

穩(wěn)定同位素技術(shù)(Stable Isotope Techniques,SIT)是生態(tài)學(xué)領(lǐng)域中逐漸興起的新型應(yīng)用技術(shù)，在生態(tài)學(xué)諸多研究領(lǐng)域中發(fā)揮了重要作用[1]。穩(wěn)定同位素作為一種非放射性、無(wú)破壞性的示蹤劑，廣泛應(yīng)用于生態(tài)循環(huán)和大氣循環(huán)的相關(guān)研究中。通過(guò)測(cè)量空氣、植物和土壤中的穩(wěn)定性同位素組成，進(jìn)而研究傳統(tǒng)生態(tài)學(xué)無(wú)法解釋的復(fù)雜生態(tài)學(xué)過(guò)程，具有示蹤、整合和指示等多項(xiàng)功能，以及檢測(cè)快速、結(jié)果準(zhǔn)確、沒有干擾等特點(diǎn)，已逐漸成為生態(tài)學(xué)研究中最有效的手段之一[2]。例如：N同位素用于分析植物及生態(tài)系統(tǒng)的N素循環(huán)，通過(guò)反硝化細(xì)菌轉(zhuǎn)化成N2O，根據(jù)15N在N2O分子的不同位置，可以示蹤N素循環(huán)的不同化學(xué)反應(yīng)過(guò)程。

氮(N)是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中最重要的營(yíng)養(yǎng)元素之一，是限制陸地生態(tài)系統(tǒng)初級(jí)生產(chǎn)力、物種組成的重要因子[3-5]。N循環(huán)是草地生態(tài)系統(tǒng)中重要的物質(zhì)循環(huán)之一，它關(guān)系著能量轉(zhuǎn)化和生態(tài)演替，能夠?yàn)橹参锷L(zhǎng)發(fā)育提供物質(zhì)基礎(chǔ)[6]，是植物體內(nèi)最主要的代謝之一[7]。國(guó)際地圈與生物圈計(jì)劃(IGBP)和政府間氣候變化委員會(huì)(IPCC)的許多核心項(xiàng)目都把N循環(huán)作為主要研究?jī)?nèi)容[8]。由于不同草地所處的生態(tài)環(huán)境不同，因而不同形態(tài)和數(shù)量的N對(duì)草地初級(jí)生產(chǎn)力的影響有很大的差異，因此，充分了解草地生態(tài)系統(tǒng)中N循環(huán)過(guò)程、保持N平衡是十分必要的。15N標(biāo)記技術(shù)在研究草地生態(tài)系統(tǒng)牧草生物固N(yùn)、N肥去向及N素轉(zhuǎn)化方面發(fā)揮了重要作用，對(duì)15N穩(wěn)定同位素技術(shù)在草地生態(tài)系統(tǒng)中的研究進(jìn)展加以綜述，旨在為更好的利用N肥、充分發(fā)揮草地生產(chǎn)潛力提供理論依據(jù)。

1 草地生態(tài)系統(tǒng)N循環(huán)

草地生態(tài)系統(tǒng)N循環(huán)大致分為3個(gè)過(guò)程，即N的輸入、N素在生態(tài)系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)化、N的輸出，見圖1。N輸入途徑包括生物固N(yùn)、大氣沉降和施肥。轉(zhuǎn)化過(guò)程主要包括礦化作用和硝化作用以及在食物網(wǎng)中的轉(zhuǎn)化。輸出的途徑主要有反硝化作用、N的揮發(fā)、淋溶及徑流[9-10]。

目前，草地生態(tài)系統(tǒng)N循環(huán)研究中常用的15N標(biāo)記技術(shù)有15N同位素稀釋法、15N同位素示蹤法、15N2富集法等。15N同位素稀釋法在生物固N(yùn)、N的礦化作用和硝化作用應(yīng)用廣泛；15N同位素示蹤法主要應(yīng)用于N去向的研究中；15N2富集法在生物固N(yùn)研究中有所應(yīng)用，但由于只能在實(shí)驗(yàn)室中操作，使得此法應(yīng)用受限[11]。15N標(biāo)記技術(shù)在草地生態(tài)系統(tǒng)N循環(huán)的研究中發(fā)揮了重要作用。與傳統(tǒng)研究N循環(huán)的方法相比，15N標(biāo)記技術(shù)能夠揭示N素循環(huán)的動(dòng)態(tài)特征，準(zhǔn)確反應(yīng)土壤N素的有效性，讓我們了解到N素從生物固定、轉(zhuǎn)化吸收、殘留及損失的真實(shí)情況，推斷土壤-植物系統(tǒng)中N素的平衡狀況，對(duì)提高肥料利用率，減少N素污染有科學(xué)的指導(dǎo)作用。

圖1 土壤N循環(huán)(根據(jù)Schimel and Bennet改寫)Fig.1 The nitrogen cycle of soil (Schimel and Bennet)注：圖中a-降解作用；b-總礦化率；c-氨的揮發(fā)；d-硝化作用；e-反硝化作用；f-微生物固定；g-土壤微生物死亡

2 15N標(biāo)記技術(shù)在植物生物固N(yùn)研究方面的應(yīng)用

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)豆科牧草與禾本科牧草混播時(shí)固N(yùn)量通常大于單播[13-14]。禾-豆牧草混播模式不僅會(huì)增加草地生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，還會(huì)促進(jìn)草地生產(chǎn)力的提高[15-17]。McNeill等[18]研究了白三葉草(TrifoliumrepensL.)單播與混播時(shí)的固N(yùn)比例，結(jié)果表明，單播時(shí)每年的固N(yùn)量為155 kg·hm-2，與黑麥草(LoliumperenneL.)混播時(shí)，固N(yùn)量為171 kg·hm-2，高于Cowling[19]測(cè)定的133 kg·hm-2。Hardarson等[20]研究結(jié)果表明，單播苜蓿(MedicagosativaL.)時(shí)，2 a有80%的N素來(lái)源于生物固N(yùn)，相當(dāng)于415 kg·hm-2，而與黑麥草混播時(shí)這一比例超過(guò)了90%。李玉中等[21]用15N 同位素稀釋法測(cè)定豆科牧草的N素固定比例，并結(jié)合生物量測(cè)定結(jié)果計(jì)算羊草草原豆科牧草的年際生物固N(yùn)量為1.5 kg·hm-2。

固N(yùn)植物固定的N素除了滿足自身的需要外，還會(huì)向周圍的非固N(yùn)植物轉(zhuǎn)運(yùn)。地下N素的轉(zhuǎn)運(yùn)主要是通過(guò)根部及周圍的微生物來(lái)完成的，根的類型、活動(dòng)(分泌、凋落等)和影響微生物活動(dòng)的環(huán)境因子都會(huì)對(duì)N素的轉(zhuǎn)運(yùn)量產(chǎn)生影響，通常豆科牧草須根系吸收的N素大于直根系[22]。Karin等[22]的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白三葉草、紅三葉草(TrifoliumpratenseL.)和苜蓿向周圍牧草的N素轉(zhuǎn)移量分別為48 kg·hm-2、22 kg·hm-2、11 kg·hm-2。同時(shí)也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，N素也可以從非固N(yùn)植物向固N(yùn)植物中轉(zhuǎn)運(yùn)[23-25]，這表明地下N素的轉(zhuǎn)運(yùn)是一個(gè)雙向的動(dòng)態(tài)過(guò)程。

當(dāng)有固N(yùn)植物存在時(shí)，應(yīng)結(jié)合固N(yùn)植物的固N(yùn)量，合理施加N肥，既能節(jié)約成本，又能充分利用固N(yùn)植物固定的N素。Dasso等[26]用同位素稀釋法研究了N肥對(duì)固N(yùn)能力的抑制作用，結(jié)果表明在白三葉和羊茅(FestucaovinaL.)混播草地上，當(dāng)尿素施用量為40 kg N·hm-2時(shí)，白三葉的固N(yùn)能力受到顯著抑制，而10 kg N·hm-2和20 kg N·hm-2施用量的影響不明顯。H?gh-Jensen等[27]用15N自然豐度法和同位素稀釋法比較了不同施N量對(duì)三葉草和黑麥草混播草地生物固N(yùn)的影響，結(jié)果表明，400 kg·hm-2的N施加量明顯抑制了植物的固N(yùn)能力?？梢?，固N(yùn)植物對(duì)草地N素的輸入是不能忽略的，這就要求對(duì)不同植物的固N(yùn)量、向周圍非固N(yùn)植物的轉(zhuǎn)運(yùn)量進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)定，實(shí)現(xiàn)草地生態(tài)系統(tǒng)的科學(xué)施肥。

3 15N標(biāo)記技術(shù)在N肥的去向方面的應(yīng)用

土壤中N的去向主要包括：土壤固定、植物吸收、反硝化導(dǎo)致的氣體(N2O、N2)揮發(fā)、NH3揮發(fā)、徑流等[11]。目前，測(cè)定N素去向應(yīng)用較為廣泛的是15N同位素示蹤技術(shù)。其主要原理是將一定豐度、形態(tài)和數(shù)量的標(biāo)記N肥施加到一定面積的隔離小區(qū)內(nèi)，通過(guò)測(cè)定不同N庫(kù)中15N豐度來(lái)確定N素去向。

3.1 15N標(biāo)記技術(shù)在植物N素吸收、利用和分配方面的應(yīng)用

植物從土壤中吸收N素，并通過(guò)殘落物形式歸還給土壤一部分。土壤與植物之間存在著N素的循環(huán)與遷移，這在土壤學(xué)中概括為生物小循環(huán)。15N同位素稀釋法能夠?qū)?biāo)記的15N跟其它來(lái)源的N素明顯區(qū)別開來(lái)，可準(zhǔn)確確定植物對(duì)N素的吸收和分配，以及土壤N素供應(yīng)的有效性，是研究N肥在土壤-植物系統(tǒng)中轉(zhuǎn)化、遷移和流失的有效方法。

植物對(duì)不同形式N肥的吸收利用率及土壤殘留率不同。Stevens[28]測(cè)定了黑麥草對(duì)15N標(biāo)記的硝酸銨和尿素的平均利用率分別為的為73.9%和82.0%。添加不同標(biāo)記部位的硝酸銨肥料(15NH4NO3，NH415NO3和15NH415NO3)的利用率分別為76.7%，69.4%和75.7%，說(shuō)明對(duì)硝酸根部分的利用率低于銨根部分。而Chaney等[29]研究發(fā)現(xiàn)，尿素的利用率低于硝酸銨?？赡苡捎谀蛩氐奶砑臃绞讲煌瑢?dǎo)致其不同的揮發(fā)量。Jenkinson等[30]研究了添加標(biāo)記N素19 a后的N去向時(shí)也發(fā)現(xiàn)，銨態(tài)N的利用率(69.6%)要高于硝態(tài)N(64.3%)，而損失率低于硝態(tài)N。李玉中等[31]研究了銨態(tài)N、硝態(tài)N在羊草中的去向，發(fā)現(xiàn)銨態(tài)N和硝態(tài)N的利用率分別為11.2%和20.13%，且銨態(tài)N的損失率高達(dá)61.9%，而硝態(tài)N的損失率僅為10.7%。

不同類型的植物及植物的不同部位對(duì)N肥的吸收利用率也不同。Epstein 等[32]研究表明，C3植物群落對(duì)15N的吸收利用率高于C4、C3-C4混合群落的利用率，三者利用率分別為41%、27%和32%；植物吸收的15N，C3植物中平均有77%的15N分配到莖中，而C4植物只有56%，C4植物將更多的N分配到根部和頂部。

不同植物對(duì)不同形式N肥的吸收利用率和分配是不同的，這不僅與植物本身對(duì)不同形式N素的偏好、土壤理化性質(zhì)及季節(jié)性變化相關(guān)，跟肥料添加時(shí)間、添加方式也有密不可分的聯(lián)系。因此，對(duì)不同類型的草地系統(tǒng)及草地系統(tǒng)中特定的植物群落要有針對(duì)性的研究，以最低的成本、最有效的辦法實(shí)現(xiàn)草地生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展。

3.2 15N標(biāo)記技術(shù)在N素?fù)p失方面的應(yīng)用

N素?fù)p失比例高是N素利用率低的重要原因之一。草地生態(tài)系統(tǒng)中N素?fù)p失的主要途徑包括：氨的揮發(fā)、反硝化作用、淋溶、動(dòng)物體和動(dòng)物產(chǎn)品對(duì)N素的固持，動(dòng)植物殘?bào)w和動(dòng)物排泄物的燃燒，動(dòng)物以排泄物形式將N素從生產(chǎn)區(qū)轉(zhuǎn)移到非生產(chǎn)區(qū)；土壤侵蝕而損失、放牧等[10,33]。由于同位素具有示蹤的特點(diǎn)，因此，利用15N標(biāo)記技術(shù)可準(zhǔn)確測(cè)定植物不同部位、不同時(shí)期N素?fù)p失的總量。

N2是反硝化作用的最終產(chǎn)物，但在某些條件下，N2O會(huì)變成硝化作用的主要產(chǎn)物。土壤產(chǎn)生的N2O主要來(lái)自硝化和反硝化兩個(gè)過(guò)程[38]。N2O釋放速率以及來(lái)源于硝化、反硝化作用的比例受環(huán)境因子及土壤管理方式的影響[39]。李平等[38]運(yùn)用15N標(biāo)記技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，反硝化、硝化過(guò)程對(duì)草地土壤N2O排放的貢獻(xiàn)分別為28.9%和71.1%，說(shuō)明草地土壤中N2O的排放主要來(lái)源于硝化作用。

草地生態(tài)系統(tǒng)中N素?fù)p失的主要途徑和損失量因環(huán)境條件不同而差異很大。Aldana等[40]研究發(fā)現(xiàn)，黑麥草的N損失有70%是通過(guò)地上凋落物流失的，而銀邊草(ArrhenatherumElatiusvar.bulbosum)、紫羊茅(FestucarubraL.)、羊茅(FestucaovinaL.)、酸沼草(MoliniacaeruleaL.)中超過(guò)50%的N素是由于根系的凋落更新而損失的。Williams等[41]研究發(fā)現(xiàn)，添加標(biāo)記15N的羊尿和牛尿的土壤中，有60%的15N被植物吸收、殘留在土壤和淋溶掉，其余40%通過(guò)氣體揮發(fā)損失。Catchpoole[42]研究了薩姆福德羅德草草地標(biāo)記N肥的損失路徑，結(jié)果表明，標(biāo)記肥料的損失主要發(fā)生在施肥后的前四周，有7.6%的標(biāo)記N肥是通過(guò)地表徑流損失的，而淋溶損失比較小。

研究表明提高植物生物多樣性不僅會(huì)提高草地生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力，還會(huì)促進(jìn)N素的利用，減少N素淋溶損失[43]。但因不同植物類型和環(huán)境下N素?fù)p失途徑多種多樣，且需要野外定位測(cè)定，為測(cè)定工作帶來(lái)了一定困難，也使測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性受到了一定影響，因此發(fā)展和研制野外定位自動(dòng)分析儀器對(duì)研究N素?fù)p失途徑與機(jī)制有重要意義。

4 15N標(biāo)記技術(shù)在N轉(zhuǎn)化方面的應(yīng)用

礦化作用和硝化作用受環(huán)境的影響較大，例如溫度、濕度、pH、通氣性等，這些環(huán)境因子通過(guò)影響土壤微生物的活性來(lái)影響兩者的作用。李玉中等[45]利用15N同位素稀釋技術(shù)研究了東北羊草草地土壤N總礦化、硝化速率的季節(jié)動(dòng)態(tài)發(fā)現(xiàn)，羊草草地土壤總礦化速率在4月-7月呈增加的趨勢(shì)，7月份達(dá)到最高，總硝化速率季節(jié)波動(dòng)性很大，最高值出現(xiàn)在8月份，N總礦化作用和硝化作用與當(dāng)月土壤溫度、土壤濕度和降水量呈正相關(guān)。Sparling等[46]研究發(fā)現(xiàn)，0～5 cm土壤中N的礦化速率是5 cm～10 cm土壤中的3倍多，隨著土壤濕度降低而降低。Mazzarino 等[47]也發(fā)現(xiàn)，N的礦化速率與土壤溫度和濕度成正相關(guān)(p<0.05)。土壤中大量的微生物和植物根系構(gòu)成了復(fù)雜的土壤體系，對(duì)土壤中的物質(zhì)轉(zhuǎn)化起著催化作用[48]，因此應(yīng)加強(qiáng)微生物活動(dòng)與礦化、硝化作用關(guān)系的研究。

草地生態(tài)系統(tǒng)中植物的群落組成會(huì)影響到生態(tài)系統(tǒng)中的N素循環(huán)。Epstein[32]研究發(fā)現(xiàn)，C3植物群落的N凈礦化速率明顯高于C4植物群落的，兩者的凈礦化速率分別為2.15 g N·m-2和1.4 g N·m-2，Wedin 等[49]也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。Mazzarino等[47]研究了四種不同植被類型(喬木、灌木、喬木與灌木間的空隙以及草地)區(qū)域的N礦化速率，結(jié)果表明，喬木區(qū)的N礦化速率(150 mg N·kg-1·yr-1，非豆科115 mg N·kg-1·yr-1)明顯高于灌木區(qū)(95 mg N·kg-1·yr-1)、喬木和灌木間的空隙(66 mg N·kg-1·yr-1)和草地(68 mg N·kg-1·yr-1)。李玉中等[45]研究發(fā)現(xiàn)，保護(hù)區(qū)的總礦化速率高于其它利用類型草地，與銨態(tài)N的消耗速率有類似的趨勢(shì)。

15N標(biāo)記技術(shù)在研究草地礦化和硝化速率中發(fā)揮了重要作用，但由于不同的草地類型中環(huán)境因子、物種構(gòu)成和土壤基質(zhì)各不相同，以及目前研究方法和技術(shù)不夠完善，導(dǎo)致研究結(jié)果之間的差異性較大。

5 15N標(biāo)記技術(shù)在微生物生態(tài)中的應(yīng)用

微生物是土壤中各種代謝過(guò)程的主導(dǎo)因子，然而相比微生物對(duì)生態(tài)環(huán)境的重大貢獻(xiàn)，人們對(duì)土壤微生物群落組成和相關(guān)功能卻了解很少[50]。由于土壤微生物數(shù)量較大，難以實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室的大規(guī)模培養(yǎng)，即使進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，室內(nèi)條件下微生物所表現(xiàn)出的特性并不代表其自然條件下的特性。穩(wěn)定性同位素探測(cè)技術(shù)(stable isotope probing，SIP)是穩(wěn)定性同位素標(biāo)記技術(shù)同分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合而發(fā)展起來(lái)一門新技術(shù)，在微生物物種鑒定、群落功能以及代謝過(guò)程的研究中發(fā)揮重要作用[51]。15N-SIP技術(shù)在研究微生物參與的代謝過(guò)程，如N循環(huán)、含N化合物的生物降解中具有廣闊的應(yīng)用前景[52]。其基本原理是將15N標(biāo)記的底物添加到土壤中，土壤中的微生物能夠以底物中15N為N源來(lái)滿足自身生長(zhǎng)需要并進(jìn)行各種物質(zhì)代謝[50]，如參與核酸(DNA和RNA)及磷脂肪酸(PLFA)等的生物合成，通過(guò)提取、分析穩(wěn)定同位素15N的生物標(biāo)志物來(lái)獲得相關(guān)信息。

但是，由于核酸中的含N量比較低，降低了檢測(cè)的靈敏度，導(dǎo)致15N-SIP技術(shù)應(yīng)用受限[53]。相比14C-SIP技術(shù)的廣泛應(yīng)用，15N-SIP技術(shù)還處于起步階段，在草地生態(tài)系統(tǒng)N循環(huán)的研究中還尚屬空白，如實(shí)現(xiàn)兩者的結(jié)合，無(wú)疑會(huì)進(jìn)一步加深對(duì)草地生態(tài)系統(tǒng)N循環(huán)的了解。

6 結(jié)語(yǔ)與展望

N循環(huán)是草地生態(tài)系統(tǒng)中重要的物質(zhì)循環(huán)之一，它關(guān)系著能量轉(zhuǎn)化和生態(tài)演替。因此，今后應(yīng)著力加強(qiáng)N循環(huán)，尤其是牧草生物固N(yùn)、N肥利用率、N素轉(zhuǎn)化以及N素?fù)p失方面的研究。15N標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用為草地生態(tài)系統(tǒng)中N素循環(huán)的研究提供了有力支持，但目前國(guó)內(nèi)對(duì)該技術(shù)的應(yīng)用主要集中在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，草地生態(tài)系統(tǒng)中的應(yīng)用相對(duì)較少。盡管15N標(biāo)記技術(shù)在生態(tài)學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用，但仍處于初級(jí)階段，很多技術(shù)和分析計(jì)算模型還不夠成熟，一定程度上影響了準(zhǔn)確度，加上測(cè)定15N同位素的儀器價(jià)格比較昂貴，使同位素的應(yīng)用受到限制，因此在實(shí)際應(yīng)用中還有待于進(jìn)一步發(fā)展和完善。微生物過(guò)程在土壤N素循環(huán)中具有重要作用，微生物活動(dòng)對(duì)環(huán)境條件的變化很敏感，所以應(yīng)強(qiáng)調(diào)微生物活動(dòng)及與其密切相關(guān)的N轉(zhuǎn)化過(guò)程研究，對(duì)植物-土壤-微生物系統(tǒng)進(jìn)行綜合分析。植物根部、形態(tài)及活性也是影響N素循環(huán)的重要因素，但目前15N標(biāo)記技術(shù)在研究植物根部與生物固N(yùn)、N素吸收、礦化作用、硝化作用及N素?fù)p失的關(guān)系方面較少，在以后的研究中也亟需加強(qiáng)。綜上所述，利用15N標(biāo)記技術(shù)研究草地生態(tài)系統(tǒng)中N素的動(dòng)態(tài)過(guò)程，對(duì)充分揭示草地生態(tài)系統(tǒng)N循環(huán)過(guò)程與機(jī)制、實(shí)現(xiàn)草地生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)發(fā)展具有重要的科學(xué)意義。

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