SNPscan法用于新疆主要少數(shù)民族非綜合征型聾患者GJB2基因突變篩查的研究

陳興健 徐百成 陳遲 朱一鳴 劉曉雯 楊小龍 王艷莉 邊盼盼 郭玉芬,2

耳聾是臨床上最常見的遺傳性疾病之一 ，據(jù)統(tǒng)計每1 000名新生兒中有1～3 例為聽力障礙兒童，其中至少一半與遺傳因素有關[1, 2]。研究發(fā)現(xiàn)非綜合征型聾(nonsydromic hearing loss,NSHL)患者大多為常染色體隱性遺傳，而在被定位和克隆的耳聾相關基因位點中，縫隙連接蛋白B2(gap junction protein bate-2，GJB2)基因突變最為常見，約有50%的常染色體隱性遺傳非綜合征型聾患者存在該基因的突變[3]。既往針對耳聾相關基因的研究表明，GJB2 基因突變導致的非綜合征型聾具有明顯的種族差異性，且突變復雜多樣[4, 5]。新疆是一個多民族聚居的地方，地域背景民族特點獨特，為了解新疆各民族耳聾基因突變譜和熱點突變的特點，本研究應用多重單核苷酸多肽性(single nucleotide polymorphism，SNP)分型技術(SNPscan)對新疆四個主要少數(shù)民族非綜合征型聾患者進行了GJB2基因的突變檢測，報告如下。

1 資料與方法

1.1研究對象 從新疆地區(qū)12個地州市的殘聯(lián)、聾兒語訓中心、聾啞學校及特殊教育學校耳聾患者中篩選出非綜合征型聾患者(先證者)565例作為研究對象，其中，維吾爾族428例，男218例，女210例，年齡3～57歲，平均14.87±9.66歲；回族41例，男19例，女22例，年齡3～22歲，平均12.07±5.17歲；哈薩克族64例，男36例，女28例，年齡4～55歲，平均19.15±12.23歲；柯爾克孜族32例，男20例，女12例，年齡7～45歲，平均22.63±12.17歲。均排除外、中耳病變引起的聽力損失，聽力檢測均顯示為雙側中重度以上感音神經(jīng)性聽力損失；按照聽力損失的國際標準分級(WHO-1997)：維吾爾族患者中，重度聽力損失者16例，重度44例，極重度368例；回族患者中，重度聽力損失者5例，極重度36例；哈薩克族患者中，重度聽力損失者5例，極重度59例；柯爾克孜族患者中，重度聽力損失者6例，極重度26例。

1.2研究方法

1.2.1病史采集 采用問卷調查及當場詢問(家長或老師)為主的方式采集病史資料，并對患者進行全身體格檢查及耳鼻咽喉?？茩z查后填寫調查問卷，問卷內容包括一般情況、耳聾發(fā)病史、耳部外傷史、藥物史、新生兒期聽損傷高危因素、全身其他系統(tǒng)(心臟病、骨骼發(fā)育、視力)及智力發(fā)育狀況、母親分娩史、家族史、其他遺傳疾病史、外耳和中耳疾病史和聽力學檢查資料，并對有耳聾家族史的患者繪制家系圖譜，建立詳盡的病例資料檔案。

1.2.2聽力檢查及采血 ①純音聽閾、ABR及聲導抗檢查：對大齡及成年耳聾患者應用Madsen純音聽力計行純音聽閾檢查，對所有患者用美國智聽公司SmartEP聽覺誘發(fā)電位儀行聽性腦干反應測試，同時行聲導抗檢查以排除中耳病變。②在知情同意的情況下抽取所有患者外周靜脈血5～10 ml，ACD—EDTA抗凝，4 ℃運送，避免震蕩、溶血，-20 ℃冷柜保存。

1.2.3基因組DNA的提取與保存 所有標本采用磁珠法提取基因組DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳定性檢測，基因組DNA-80 ℃保存。

1.2.4SNPscan法GJB2基因突變篩查 SNPscan法是由上海天昊生物科技有限公司自主專利開發(fā)的多重SNP分型專利技術。根據(jù)美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)和人類基因突變數(shù)據(jù)庫(Human Gene Mutation Datolase,HGMD)報道的GJB2基因突變位點，結合亞洲人群該基因突變特點[4～6]，選取GJB2基因40個已知突變位點用SNPscan方法進行篩查。

1.3統(tǒng)計學方法 各民族間的致病突變位點的等位基因頻率運用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學檢驗，當四格表資料中樣本含量大于40且每個格子中的理論頻數(shù)≥5時，使用卡方檢驗；當樣本含量大于40但有1≤理論頻數(shù)<5時，卡方值進行校正，當樣本含量<40或理論頻數(shù)<1時用確切概率法計算概率。行×列資料中當 小于5的格子數(shù)的比例大≥20%的情況下使用確切概率法，余使用卡方檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1新疆四個主要少數(shù)民族NSHL患者中GJB2基因致病突變位點的等位基因頻率檢出結果 四個少數(shù)民族565例NSHL患者中，GJB2基因40個致病突變位點的等位基因頻率為10.09%(114/1 130)，共檢測到11種突變形式，其中7種為致病突變(表1)，其余c.1A>G、c.11G>A、c.23C>T、c.34_35insG、c.95G>T、c.5G>A、c.134G>A、c.139G>A、c.139G>T、c.157T>A、c.164C>A、c.167delT、c.187G>T、c.230G>A、c.232G>A、c.257C>G、c.283G>A、c.287C>G、c.358_360delGAG、c.382A>G、c.408C>A、c.416G>A、c.439G>A、c.493C>T、c.511_512insAACG c.571T>C、c.583A>G、c.598G>A和c.605ins46未檢出陽性結果。共明確48例NSHL患者耳聾病因為GJB2基因突變引起，其中33例為純合突變，15例為復合雜合突變。

表1 GJB2基因各核苷酸改變在四個少數(shù)民族NSHL患者中的等位基因數(shù)及頻率(例，%)

注：等位基因頻率=(2×純合子個數(shù)+雜合子個數(shù)) / 總人數(shù)×2；*為非致病突變，不做最后統(tǒng)計；#與漢族[10]比較，P<0.05

2.2維吾爾族NSHL患者GJB2 基因突變的檢測結果 428例維吾爾族NSHL患者中，共檢測到11種突變形式，其中7種為致病突變，分別為c.235delC、c.35delG、c.299_300delAT、c.313_326del14、c.9G>A、c.176_191del16、c.427C>T，等位基因頻率為10.16%(87/856)，其中c.235delC和c.35delG的等位基因頻率最高，分別為5.14%和3.15%，占所有GJB2致病等位基因數(shù)的81.61%(71/87)，是該民族NSHL患者GJB2基因的熱點突變(表1)。所有維吾爾族NSHL患者中，37例明確為GJB2基因突變所致(24例純合突變，13例復合雜合突變)，突變頻率為8.64%(37/428)；21例為單個GJB2雜合突變攜帶者，攜帶頻率為4.91%(21/428)(表2)。

2.3回族NSHL患者GJB2基因突變的檢測結果 41例回族NSHL患者中，共檢測到4種突變形式，其中3種為致病突變，分別為c.235delC、c.35delG、c.299_300delAT，等位基因頻率為15.85%(13/82)，其中c.235delC等位基因頻率最高，為13.41%，占所有GJB2致病等位基因數(shù)的84.62%(11/13)，是該民族NSHL患者GJB2基因的熱點突變(表1)。41例回族NSHL患者中，6例明確為GJB2基因突變所致(5例純合突變，1例復合雜合突變)，突變頻率為14.63%(6/41)(表2)。

表2 565例NSHL患者GJB2基因致病突變基因型在各民族中的分布(例)

2.4哈薩克族NSHL患者GJB2 基因突變的檢測結果 64例哈薩克族NSHL患者中，共檢測到3種突變形式，其中2種為致病突變，分別為c.35delG、c.313_326del14，等位基因頻率為10.16%(13/128)，其中c.35delG等位基因頻率最高，為8.59%，占所有GJB2致病等位基因數(shù)的84.62%(11/13)，是該民族NSHL患者GJB2基因的熱點突變(表1)。64例哈薩克族NSHL患者中，5例明確為GJB2基因突變所致(4例35delG/35delG純合突變，1例35delG/313_326del14復合雜合突變)，突變頻率為7.81%(5/64)(表2)。

2.5柯爾克孜族NSHL患者GJB2 基因突變的檢測結果 32例柯爾克孜族NSHL患者中，共檢測到2種突變形式，其中1種為致病突變，為c.35delG，等位基因頻率為1.56%(1/64)，c.35delG是該民族NSHL患者GJB2基因的熱點突變(表1)。

2.6統(tǒng)計學分析結果 維吾爾族、回族、哈薩克族和柯爾克孜族NSHL患者中GJB2基因的致病突變位點等位基因頻率分別為10.16%(87/856)、15.85%(13/82)、10.16%(13/128)、1.56%(1/64)，其中回族患者突變檢出率最高，維吾爾族和哈薩克族患者突變檢出率次之，均低于回族，柯爾克孜族患者突變檢出率最低，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.140，P=0.043)。

3 討論

不同國家、不同地區(qū)、不同民族耳聾基因突變頻率有很大的差異，GJB2基因突變最為常見且差異明顯[5, 6]。隨著人類后基因組時代的開始，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)作為第三代遺傳標記被越來越廣泛的應用于疾病遺傳學、藥物基因組學及生物多樣性分析中，同時，SNP基因分型技術也取得了令人矚目的進展[7]。

本研究中應用的SNPscan技術是一種多重SNP分型技術，該技術采用連接酶連接反應的高特異性實現(xiàn)對SNP位點等位基因的識別，然后通過在連接探針末段引入不同長度的非特異序列以及通過連接酶加接反應獲得位點對應的不同長度連接產(chǎn)物，利用標記熒光的通用引物對連接產(chǎn)物進行PCR擴增，通過熒光毛細管電泳對擴增產(chǎn)物進行電泳分離，最后通過對GeneMapper軟件分析獲取各個SNP位點的基因型。本研究結果顯示本組新疆維吾爾族、回族、哈薩克族和柯爾克孜族NSHL患者中GJB2基因的致病等位基因頻率分別為10.16%、15.85%、10.16%、1.56%，回族高于維吾爾族和哈薩克族，柯爾克孜族檢出率最低。從人種角度分析，c.235delC是新疆地區(qū)維吾爾族和回族耳聾患者的熱點突變，與蒙古利亞人種的熱點突變一致[8]；c.35delG是維吾爾族、哈薩克族和柯爾克孜族的熱點突變，與高加索人種的熱點突變一致[9]。

滿榮軍等[10]用直接測序法對維吾爾族NSHL患者GJB2第2外顯子進行檢測，檢出率為13.68%(29/212)；陳俞等[11]應用基因芯片法對維吾爾族GJB2基因c.235delC、c.35delG、c.299_300delAT、c.176_191del16進行檢測，檢出率為9.24%(17/184)；本研究用SNPscan方法對新疆維吾爾族NSHL患者進行GJB2基因2個外顯子40個已知突變位點的篩查，檢出率為11.45%(49/428)；上述結果差異均無統(tǒng)計學意義。GJB2只有2個外顯子，編碼區(qū)位于第2外顯子，雖然基因測序方法和檢測位點不同，但對GJB2常見致病突變位點的檢出率無明顯差異，提示通過對GJB2基因常見位點的篩查就可以得到較高的檢出率，可為新疆維吾爾族耳聾基因篩查在突變位點選擇上提供指導。

維吾爾族是一個多源民族，且地理位置靠近中亞，長期的遷移、婚配等原因使維吾爾族融合了約30%的高加索人種的血緣[12]。既往報道顯示GJB2在該民族中的突變頻率為9.24%，c.235delC和c.35delG是維吾爾族GJB2基因的突變熱點[10, 11]。本研究428例維吾爾族NSHL患者中c.235delC的等位基因頻率為5.14%，c.35delG等位基因頻率為3.15%，是該民族的突變熱點，與漢族[10]具有統(tǒng)計學差異，提示漢族與維吾爾族NSHL患者GJB2基因突變譜存在差異。研究顯示，在歐美國家高加索人種中，c.35delG為NSHL患者的主要突變形式，占總突變的60%～85%[13]，而在亞洲蒙古利亞人中，c.35delG很少發(fā)現(xiàn)，c.235delC突變是中國、日本、韓國最常見的突變形式[14, 15]。維吾爾族NSHL患者中GJB2基因的突變表現(xiàn)可能與該民族融合了約30%的高加索人種的血緣有關。

本研究中41例回族NSHL患者c.235delC和c.35delG的等位基因頻率分別為13.41%和1.21%，其中c.235delC等位基因頻率最高，是該民族NSHL患者GJB2基因的熱點突變，與漢族患者[10]比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，也與馬建鸝等[16]報道的中國西北地區(qū)回族NSHL患者GJB2基因突變的結果一致?；刈迳⒕尤珖瑥拿褡迤鹪磥碚f，是一個由眾多民族融合而成的融生性民族，本研究結果也符合回族融生性民族的特征。

新疆地區(qū)哈薩克民族屬于蒙古人種北亞類型和歐羅巴人種及印度地中海類型之間的混合類型，屬于混血民族；柯爾克孜族多數(shù)人屬于蒙古人種北亞類型，少數(shù)人兼有歐羅巴特征，大體屬于混合民族[12]。本研究中哈薩克族和柯爾克孜族NSHL患者c.35delG的等位基因頻率分別為8.59%和1.56%，c.235delC和c.299_300delAT是蒙古利亞人種GJB2基因最常見的突變位點[4,5]，在這個兩個民族中均沒有發(fā)現(xiàn)，可能與其民族起源和樣本量較少有關，還有待于進一步的研究。

綜上所述，本研究進一步證實新疆地區(qū)維吾爾族、回族、哈薩克族、柯爾克孜族NSHL患者GJB2基因的突變熱點不同，且具有民族特異性，可能與民族起源、長期人種間基因交流有關。SNPscan技術以SNP位點檢測為基礎，可以在一個檢測流程中同時實現(xiàn)對多個SNP位點進行分型，與直接測序法相比較，省去了實驗過程中較多繁瑣的操作，且能對多個樣本多個位點同時檢測，也降低了成本；與基因芯片法相比，目前國內僅針對GJB2四個常見位點的檢測[17]，而SNP檢測位點多，可針對已知目標基因突變位點靈活設計，真正實現(xiàn)高通量。此外，SNPscan已成功應用于冠狀動脈疾病相關基因和乳腺癌易感基因的研究中，同時證實了該方法的準確性和高成功率[18, 19]。因此，SNPscan是一種適合大規(guī)模的耳聾基因篩查的方法。

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