類人膠原蛋白－微孔淀粉的制備及生物學(xué)評(píng)價(jià)

蒙俊樺，王琪凱，范代娣，段志廣，喬存存，王溢萍

(西北大學(xué) 化工學(xué)院，陜西 西安 710069)

各種突發(fā)性事故中人體大出血的現(xiàn)象較為常見(jiàn)，臟器等破裂的隱蔽性滲血更是手術(shù)中的難題，醫(yī)院對(duì)病人的手術(shù)過(guò)程中快速且有效的止血[1－3]是搶救生命中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。止血材料的應(yīng)用極為廣泛，如外科手術(shù)、戶外旅行、軍事任務(wù)及各種突發(fā)性事故造成的出血?jiǎng)?chuàng)傷急救等。其中，新型止血材料的研發(fā)對(duì)由戰(zhàn)爭(zhēng)原因引起的出血?jiǎng)?chuàng)傷具有重要戰(zhàn)略意義[2]。為了克服目前止血材料止血效果不確切、生物相容性差等缺陷，可快速止血的新型止血材料是現(xiàn)階段該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

微孔淀粉，也稱多孔淀粉，因其成本低廉，被視為當(dāng)今具有研究前景的止血材料。微孔淀粉屬于變性淀粉的一種，它通常按照如下工藝處理:將高純度天然淀粉不經(jīng)過(guò)糊化過(guò)程直接利用酸或酶處理以后，在其表面形成孔徑較為均勻的微孔，表面微孔直徑約1 μm，微孔容積約占顆粒體積的50%，具有較大的比表面積，且于適當(dāng)條件下分散在水等溶劑中亦能保持完整結(jié)構(gòu)，具有優(yōu)異的吸附性，作為藥物、香料、色素等功能性物質(zhì)的吸附載體或包埋劑，具有高效、安全、可降解等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各行業(yè)。

新型類人膠原蛋白[4－5]為基因工程產(chǎn)品，分子設(shè)計(jì)思路是將人源型膠原蛋白的mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再通過(guò)酶切和修飾后對(duì)特定序列進(jìn)行多次重復(fù)，再轉(zhuǎn)化于工程菌，經(jīng)高密度發(fā)酵、分離、純化等復(fù)雜過(guò)程而得到的一種水溶性高分子蛋白。類人膠原蛋白由于其優(yōu)異的促細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)及無(wú)病毒隱患而被作為一種新型的生物材料應(yīng)用于止血領(lǐng)域的研究[6]。

1 材料和方法

1.1 材 料

玉米淀粉(corn starch):國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)于吉林中糧生化能源銷售有限公司;十二水磷酸氫二鈉:天津市化學(xué)試劑六廠 AR;檸檬酸:西安化學(xué)試劑廠AR;α-淀粉酶:上海索來(lái)寶生物科技有限公司提供，酶活5.0×104U/g;糖化酶:上海索來(lái)寶生物科技有限公司，酶活1.0×105U/g;氫氧化鈉:西安富力化學(xué)廠AR;實(shí)驗(yàn)SD大鼠、大鼠血少量，均購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心;生理鹽水:實(shí)驗(yàn)室自配;類人膠原蛋白－微孔淀粉止血粉:本實(shí)驗(yàn)室自制;普通微孔淀粉:重慶泰威生物工程有限公司。

1.2 儀 器

超低溫冰箱 ULT1386-3-V34，美國(guó) REVCO;真空冷凍干燥機(jī) FREEZONE6，美國(guó)LABCONCO;靈敏pH計(jì)METTLER TOLEDO;水浴鍋;恒溫加熱攪拌機(jī);TGL-16C臺(tái)式離心機(jī):上海醫(yī)療器械廠;光學(xué)顯微鏡:日本Olympus公司;掃描電子顯微鏡SEM:日立 S-750(日本);恒溫水浴箱:江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;分光光度計(jì):美國(guó)MD公司;AG-245電子天平:瑞士Mettler Tolledo公司;高壓蒸汽滅菌器:日本TOMY XS-500;恒溫鼠兔解剖臺(tái):上?？瓶漆t(yī)學(xué)模型有限公司Cr-HTT;恒溫培養(yǎng)箱:上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司 ZGP-2270;超凈工作臺(tái):蘇州凈化設(shè)備有限公司;一次性培養(yǎng)皿(Φ100 mm):美國(guó)康寧公司;自動(dòng)移液器(吸管、帶吸頭):Eppendorf;玻璃器皿(250℃干熱除熱原);試管架或孵化反應(yīng)管:西安化玻站。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 微孔淀粉的制備 稱取一定量玉米淀粉于燒杯中，按比例加入去離子水配制成淀粉漿，再取5%的稀鹽酸100 mL，加入到淀粉漿中，于50℃恒溫水浴鍋中保溫半小時(shí)后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的NaOH溶液中和至pH為7.0，移去上清。加去離子水溶解，以3 000 r/min離心10 min，再移去上清。重復(fù)操作3次，直至pH基本穩(wěn)定。

取100 g經(jīng)酸處理后的玉米淀粉于燒杯中，按比例加入去離子水，調(diào)配成40%質(zhì)量濃度的淀粉漿，攪拌均勻，放入恒溫水浴鍋中保溫30 min。

稱取一定量的糖化酶、α-淀粉酶[7～9](酶配比按照糖化酶100 U/mg，α-淀粉酶50 U/mg為準(zhǔn))。再制備緩沖溶液，稱取1.42 g Na2HPO4溶于50 mL容量瓶中，準(zhǔn)確定容，得到0.2 mol/L的溶液;精確稱量1.47 g檸檬酸于50 mL容量瓶中，定容得到0.1 mol/L的溶液。先加Na2HPO4，再加檸檬酸，調(diào)整pH。最后加入酶的混合物配制成混合溶液，再次調(diào)整pH。

混合淀粉漿與酶體系，放于50℃的恒溫?cái)嚢铏C(jī)上加熱攪拌反應(yīng)數(shù)小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，向混合體系中加入6%的NaOH，調(diào)整pH至7.0。轉(zhuǎn)入離心管中進(jìn)行離心洗滌處理，并維持pH為7.0左右，重復(fù)試驗(yàn)5次。

將洗滌結(jié)束的淀粉[5]于恒溫烘干箱中進(jìn)行干燥，在55℃下進(jìn)行烘干48 h后，除去上層糖化酶固體，加入去離子水混合均勻，倒入培養(yǎng)皿中，凍干粉碎。

1.3.2 類人膠原蛋白－微孔淀粉復(fù)合材料的制備[2]取出一定量實(shí)驗(yàn)室自制微孔淀粉，在離心管中加去離子水溶解成濃溶液，加入一定量的類人膠原蛋白搖勻[10－11]。在5 000 r/min下離心10 min，取出倒棄上清，平行實(shí)驗(yàn)3次。用0.2%(V/V)戊二醛乙醇溶液交聯(lián)微孔淀粉與類人膠原蛋白混合物，交聯(lián)溫度為50℃，時(shí)間為20 h，結(jié)束后要洗滌、離心再凍干。將充分混合的溶液倒至一次性培養(yǎng)皿中，按每分鐘下降0.1℃的速度對(duì)蛋白溶液進(jìn)行程序冷凍;程序冷凍結(jié)束后迅速轉(zhuǎn)移至已經(jīng)預(yù)冷好的凍干機(jī)內(nèi)進(jìn)行真空冷凍干燥，冷阱溫度約－50℃，干燥36 h后取出。

1.3.3 復(fù)合酶解法正交實(shí)驗(yàn)分析[12－13]根據(jù)復(fù)合酶解單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)了L9因素水平如表1所示。

表1 復(fù)合酶解正交實(shí)驗(yàn)L9(43)因素水平表Tab.1 Composite enzyme solution orthogonal experiments L9(43)factors level table

1.3.4 掃描電鏡(SEM)分析 將淀粉樣品粉碎后，均勻地撒在貼有導(dǎo)電膠的樣品樣品臺(tái)上，用掃描電鏡觀察，觀測(cè)微孔淀粉的表面形態(tài)，由SEM圖片分析軟件得到淀粉的微觀圖。

1.3.5 吸水率的分析 以吸水率考量微孔淀粉的吸附性，吸附性直接影響了微孔淀粉止血效果。精確稱量一定量的樣品，記作M1，室溫下用去離子水?dāng)嚢?0 min后用真空抽濾機(jī)抽濾直至沒(méi)有水滴下，精確稱量吸附了水的淀粉的質(zhì)量，記作M2。按以下公式計(jì)算吸水率:

吸水率 =[(M2－M1)/M1]×100%

稱取一定量的類人膠原蛋白－微孔淀粉止血材料，分別加入20℃蒸餾水中，輕微攪拌，約30 min充分吸水后，分別用真空抽濾機(jī)抽濾，將水分排凈，稱重，精確至0.001 g，計(jì)算各組樣品吸收水分的質(zhì)量與樣品質(zhì)量的比值，求平均值后再乘以100%即為吸水率。

1.3.6 實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟止血實(shí)驗(yàn)[14－16]將實(shí)驗(yàn)用SD大鼠分為類人膠原蛋白－微孔淀粉組和普通微孔淀粉組，每組5只健康實(shí)驗(yàn)大鼠，均常規(guī)飼養(yǎng)，腹腔注射2.0%戊巴比妥鈉溶液對(duì)試驗(yàn)大鼠進(jìn)行麻醉后固定于恒溫臺(tái)上，所用手術(shù)器械均濕熱滅菌烘干，手術(shù)過(guò)程嚴(yán)格按照外科手術(shù)要求進(jìn)行操作，備皮處用碘伏消毒后75%酒精脫碘，逐層開(kāi)腹，待可見(jiàn)肝臟時(shí)用海綿鉗墊無(wú)菌紗布將肝臟緩慢拉出，用手術(shù)刀在肝葉劃大約l.0 cm×1.0 cm的切口，分別將準(zhǔn)備好的類人膠原蛋白—微孔淀粉止血材料、普通微孔淀粉止血材料撒上切口并使用無(wú)菌紗布敷壓切口，記錄止血時(shí)間，觀察兩種微孔淀粉在創(chuàng)面的粘附情況并對(duì)手術(shù)部位拍照保存。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合酶解法正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2給出了復(fù)合酶解制得的微孔淀粉的吸水率正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和極差分析。

表2 復(fù)合酶解正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和極差分析Tab.2 Composite enzyme solution orthogonal experimental results and range analysis

由表2可知，4個(gè)因素對(duì)微孔淀粉吸水率的影響依次為:B＞A＞D＞C，即酶解時(shí)間＞酶加入量＞pH值＞反應(yīng)溫度。而根據(jù)極差分析可以得到復(fù)合酶的最佳參數(shù)為:A2B2C1D1，即酶使用量為理論水解掉40%淀粉的量，酶解時(shí)間20小時(shí)，酶解溫度50℃，pH為4.8。

2.2 掃描電鏡結(jié)果與分析

由圖1分析可得，經(jīng)處理過(guò)后，淀粉表面分布有較多的微孔。從微觀角度上，微孔淀粉堆積密度和顆粒密度低，結(jié)構(gòu)疏松且具有較大的比孔容和比表面積。這使微孔淀粉具備良好的吸附性，表現(xiàn)出分子篩的作用。

圖1 微孔淀粉掃描電鏡(SEM)Fig.1 SEM of Microporous starch

2.3 類人膠原蛋白－微孔淀粉止血材料的吸水率測(cè)定結(jié)果

經(jīng)計(jì)算，試驗(yàn)中類人膠原蛋白－微孔淀粉的吸水率如表3所示。

表3 類人膠原蛋白－微孔淀粉止血材料吸水率的測(cè)定Tab.3 Human-like collagen-microporous starch hemostatic materials bibulous rate measurement

計(jì)算后求得類人膠原蛋白－微孔淀粉的平均吸水率為3 580%。

本工藝制備的微孔淀粉具有良好的吸水率，為獲得較出色的止血效果奠定了物理基礎(chǔ)。能否吸收創(chuàng)面的最初滲血在創(chuàng)面止血中極為關(guān)鍵，若不能及時(shí)吸收最初滲血，很可能対術(shù)區(qū)造成大面積污染或必須使用其他止血手段進(jìn)行二次輔助止血，增大手術(shù)難度，所以良好的吸水率反映了材料的預(yù)期止血效果，是止血材料性能優(yōu)劣的重要參考指標(biāo)，關(guān)注該指標(biāo)是我們?cè)诮窈笾苽涔に噧?yōu)化過(guò)程的一個(gè)重點(diǎn)。

2.4 大白鼠肝臟止血實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表4可得，相較于外購(gòu)來(lái)的止血?jiǎng)瑥?fù)合材料的止血時(shí)間更短而且誤差更小。說(shuō)明用戊二醛復(fù)合類人膠原蛋白與微孔淀粉所制成的產(chǎn)品兼具有兩者的優(yōu)勢(shì)。

表4 二種止血粉對(duì)大鼠創(chuàng)面的止血時(shí)間Tab.4 Two kinds of styptic powder to stop bleeding time in rats liver

3 結(jié)論

1)通過(guò)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)酸解、酶解反應(yīng)處理后，淀粉顆粒成孔明顯，表面孔隙分布密集均勻，經(jīng)材料吸水率測(cè)定顯示材料吸水率有明顯提高，符合制備止血材料所必須達(dá)到的條件基礎(chǔ)。

2)通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化后的工藝條件為:α-淀粉酶:糖化酶=1∶3，反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時(shí)間為20小時(shí)，pH值為4.8。

3)在實(shí)驗(yàn)大鼠體外肝臟實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，類人膠原蛋白－微孔淀粉止血?jiǎng)┫鄬?duì)于微孔淀粉可以更高效地吸收出血點(diǎn)所滲出的血液，并與材料形成復(fù)合物而達(dá)到止血效果。

[1]王建，葛寶豐，劉興炎，等.戰(zhàn)傷止血方法及材料研究進(jìn)展[J].人民軍醫(yī)，2008，51(1):5-6.

[2]席朝運(yùn)，莊遠(yuǎn)，汪德清.新型多孔結(jié)構(gòu)止血?jiǎng)┭芯窟M(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2013，21(2):526-529.

[3]何海燕，張連陽(yáng).戰(zhàn)傷急救技術(shù)研究進(jìn)展[J].解放軍醫(yī)藥雜志，2012，24(5):1-3.

[4]范代娣.一種類人膠原蛋白及其制備方法:中國(guó)專利[P].ZL 01106757.8.

[5]馬茂，范代娣.殼聚糖－類人膠原蛋白對(duì)兔肝創(chuàng)面的止血效果及組織相容性觀察[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28(12):1122-1124.

[6]KHEIRABADI B.Evaluation of topical hemostatic agents for combat wound treatment[J].US Army Med Dep J，2011，2(1):25-37.

[7]楊圣崠.微孔淀粉的酶法制備及其應(yīng)用研究[D].長(zhǎng)春:吉林大學(xué)，2013.

[8]楊圣崠，侯聚敏，張琳，等.酶法制備微孔淀粉的研究進(jìn)展[J].吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，37(4):77-80.

[9]劉成程，邊六交，陳超.用酸酶序解法制備高吸水性玉米多孔淀粉[J].化學(xué)與生物工程，2010，27(2):57-61.

[10]陳麗，譚亦成，張喻.多孔淀粉的酶法制備及在食品中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].糧油食品科技，2013，21(2):16-19.

[11]RAGAN G A.Innovative recycling options for biomedical research facilities[J].Journal of Chemical Health and Safety，2007，14(6):17-20.

[12]范步高.線性回歸分析法在正交試驗(yàn)中的應(yīng)用[J].中成藥，2013，35(1):178-182.

[13]劉瑞江，張業(yè)旺，聞崇煒，等.正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析方法研究[J].實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理，2010，27(9):52-55.

[14]MATTHEW J B，KELLY J S，ROBORT F D.Encyclopedia of bio-materials and bio-medical engineering[J].Marcel Dekker Inc.USA，2004:324-334.

[15]THOMAS J K.Encyclopedia of biomaterials and biomedical engineering Marcel Dekker.Inc.USA，2004:335-347.

[16]戴素良.手術(shù)室止血技術(shù)應(yīng)用的進(jìn)展[J].吉林醫(yī)學(xué)，2010，31(20):3363-3364.