自擬跌創(chuàng)膏治療家兔急性軟組織損傷的實(shí)驗(yàn)研究

趙智敏，王志義

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001;2.遼寧省錦州市錦州石化醫(yī)院，遼寧錦州 121001)

軟組織損傷是骨傷科常見疾病類型，一般是在外力作用下，直接或間接作用于人體引起組織的局部腫脹、疼痛、功能障礙和青紫瘀斑等，中醫(yī)認(rèn)為此病為氣滯血瘀證。自擬跌創(chuàng)膏是結(jié)合中醫(yī)學(xué)的辨證情況，選取大黃、黃柏等藥物組成的具有行氣消腫、舒筋活絡(luò)、抗炎鎮(zhèn)痛的方劑。本次研究在家兔急性軟組織損傷模型中觀察自擬跌創(chuàng)膏在抗炎、消腫等方面的作用，并探討其作用機(jī)制，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 儀器與試藥

SP-3430氣相色譜儀(安捷倫公司);HFX-II型顯微鏡(日本尼康公司);FE20型PH計(jì)(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);三口玻璃反應(yīng)瓶、水浴鍋等。

中藥大黃、黃柏、紅花、血竭、乳香、沒藥、冰片、獨(dú)活、當(dāng)歸、姜黃、川芎、郁金、樟腦、薄荷油、白芷(國藥集團(tuán))、紅花油(福建太平洋制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z35020457)、甘油、三乙醇胺、液體石蠟、尼泊金乙酯(天津科密歐)、生理鹽水(青島日水生物技術(shù)有限公司)。家兔體質(zhì)量2.14±0.67 kg，全部雄性，上海市西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(許可證號SCXK(滬)2008-0016)。

2 方法與結(jié)果

2.1 自擬跌創(chuàng)膏的制備

自擬跌創(chuàng)膏組成:大黃50 g，黃柏20 g，紅花23 g，血竭15 g，乳香10 g，沒藥20 g，冰片15 g，獨(dú)活30 g，當(dāng)歸30 g，姜黃40 g，川芎40 g，郁金25 g，樟腦20 g，薄荷油 15 g，白芷 20 g，甘油 300 g，三乙醇胺 50 g，液體石蠟200 g，尼泊金乙酯醇溶液(5%)適量，蒸餾水適量。制備方法:取樟腦處方量研末備用，乳香10 g、沒藥20 g、川芎40 g、郁金25 g加70%乙醇200 ml加熱至50℃攪拌4 h過濾，濾渣以同樣的方法再提取1次，合并提取液濃縮至原來的1/3，濃縮液備用;大黃50 g，黃柏20 g，紅花23 g，血竭15 g，冰片15 g，獨(dú)活30 g，當(dāng)歸30 g，姜黃40 g，白芷20 g，9味中藥進(jìn)行微粉，過200目篩混勻備用;將提取液、藥粉、樟腦粉及薄荷油15 g、甘油300 g、三乙醇胺50 g、液體石蠟200 g加入到三口反應(yīng)瓶中，50℃攪拌1 h制成油相，然后在順時(shí)針攪拌下滴入純化水中，加入尼泊金乙酯醇溶液(5%)，攪拌至凝即得自擬跌創(chuàng)膏。

2.2 家兔軟組織損傷模型的建立

先準(zhǔn)備好相關(guān)造成家兔軟組織損傷的材料，由自制的打擊棒、套筒、支架、固定架等組成，打擊棒頭部面積為2.0 cm2，撞擊沖量為2 kg/s。所有家兔均飼養(yǎng)1周后，在家兔右后大腿中段剃毛，范圍大約為6 cm×5 cm，在此范圍內(nèi)做好標(biāo)記，作為打擊棒的作用點(diǎn)。然后將家兔固定好，由同一人從約50 cm高處自由落下打擊棒，造成急性軟組織損傷。

2.3 給藥方案

挑選符合急性軟組織損傷家兔45只分成3組，每組15只，分別為生理鹽水組、紅花油組及自擬跌創(chuàng)膏組。生理鹽水組采用生理鹽水涂擦患處，每日2次，每次涂擦約5 ml液體;紅花油組采用紅花油涂擦，每次5 ml，每日2次;自擬跌創(chuàng)膏組每日涂抹患處1次，涂抹均勻即可。以上3組均治療1周。

2.4 療效評定標(biāo)準(zhǔn)

參考相關(guān)的報(bào)道[1]予以評定。觀察治療后的第1、2、3、4、7天家兔在肢體腫脹程度和痛閾值方面的差異性，腫脹程度以游離標(biāo)卡尺測量;由受傷后大腿周徑和受傷前大腿周徑之差構(gòu)成。參考報(bào)道[2]的標(biāo)準(zhǔn)將治療不同天數(shù)的3組家兔在右前肢背屈側(cè)面安裝含有飽和氯化鉀溶液的電極，無電極級則浸生理鹽水固定在左前肢背屈側(cè)，兩極均與測痛儀相連，用電流強(qiáng)度線型遞增的直流電將K+導(dǎo)入皮膚作為痛刺激，以家兔出現(xiàn)撤退反應(yīng)作為痛閾反應(yīng)，共測定3次，每次間隔5 min，取平均值為痛閾值。另外，在試驗(yàn)的第1、4、7天抽取靜脈血進(jìn)行 bFGF、TGF-β1、細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、總補(bǔ)體活性水平、炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等指標(biāo)觀察。免疫組織化學(xué)法為取帶有軟組織損傷的家兔組織塊，大小為1.5 cm×1.5 cm，用10%甲醛溶液固定、常規(guī)脫水、石蠟包埋后連續(xù)切片，厚度為4 μm，并分別進(jìn)行HE染色和HO-I免疫組織化學(xué)染色。HE染色利用美國SGYEGHDG公司提供的試劑進(jìn)行染色，HO-I免疫組織化學(xué)染色則采用鏈霉素-生物素免疫染色法，抗4℃孵育過夜，其他參考試劑說明書進(jìn)行，最后用顯微鏡觀察、拍照并分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，將相關(guān)因素調(diào)查統(tǒng)計(jì)的內(nèi)容作為變量，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6 3組試驗(yàn)方案對軟組織損傷恢復(fù)分析

2.6.1 3組家兔肢體腫脹程度比較分析 表1顯示，在觀察期內(nèi)生理鹽水組的肢體腫脹程度越來越重，第4天腫脹開始下降;紅花油組腫脹第3天開始下降;自擬跌創(chuàng)膏組腫脹持續(xù)性消退，起效快，與前2組在肢體腫脹程度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，具有可比性。

表1 3組家兔肢體腫脹程度比較分析(s，cm)

表1 3組家兔肢體腫脹程度比較分析(s，cm)

比較點(diǎn) 生理鹽水組 紅花油組 自擬跌創(chuàng)膏組第1天1.56±0.36 1.34±0.32 1.25±0.34第2天 1.84±0.45 1.43±0.41 1.14±0.43第3天 2.23±0.54 1.29±0.43 0.97±0.34第4天 2.14±0.59 1.04±0.56 0.78±0.26第7天 1.87±1.12 0.86±0.45 0.63±0.24 P值 ＜0.05

2.6.2 3組家兔肢體痛閾值比較分析 表2顯示，生理鹽水組和紅花油組在痛閾值上均呈升高趨勢，但較為平穩(wěn);自擬跌創(chuàng)膏組在痛閾值上隨時(shí)間推移改善顯著，與前2組在痛閾值上比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，具有可比性。

表2 3組家兔肢體痛閾值比較分析(s)

表2 3組家兔肢體痛閾值比較分析(s)

比較點(diǎn) 生理鹽水組 紅花油組 自擬跌創(chuàng)膏組第1天1.43±0.36 1.42±0.30 1.46±0.32第2天 1.44±0.34 1.45±0.34 1.58±0.36第3天 1.44±0.46 1.52±0.14 1.68±0.42第4天 1.49±0.43 1.54±0.46 1.79±0.51第7天 1.51±0.49 1.56±0.37 1.98±0.48 P值 ＜0.05

2.6.3 3組家兔肢體相關(guān)指標(biāo)比較分析 表3顯示，生理鹽水組的 bFGF、TGF-β1、細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、總補(bǔ)體活性水平、炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞指標(biāo)變化幅度最低，紅花油組次之，自擬跌創(chuàng)膏組最高。自擬跌創(chuàng)膏組以上指標(biāo)和其他2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，具有可比性。

2.6.4 免疫組織化學(xué)法鏡下觀察分析 圖1為正常的家兔組織;圖2為軟組織損傷的家兔組織，可見細(xì)胞周圍間隙增寬;圖3可見HE染色后細(xì)胞增色，泡沫細(xì)胞增加明顯;圖4為治療7 d后細(xì)胞組織中出現(xiàn)新生的毛細(xì)血管。

3 討論

急性軟組織損傷屬于中醫(yī)學(xué)“筋傷”范疇，多是由于外來暴力引起筋肉、脈絡(luò)損傷、血脈外溢等引起，其病理機(jī)制為氣滯血瘀、脈絡(luò)不通[3]。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度分析為局部皮膚、軟組織損傷，嚴(yán)重者為肌纖維斷裂、小血管破裂、血管壁通透性增加、血管內(nèi)液體外滲致組織腫脹，生物活性物質(zhì)如組織胺、5-羥色胺、緩激肽等激活，產(chǎn)生了大量的炎性細(xì)胞浸潤致組織壞死，同時(shí)刺激神經(jīng)的疼痛[4]。

自擬跌創(chuàng)膏結(jié)合中醫(yī)學(xué)對此病的辨證依據(jù)，“不通則痛，不容則痛”等，方中以大黃、黃柏為君藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，大黃能減輕毛細(xì)血管通透性，改善脆性，可增加血小板和血液流變學(xué)情況，改善炎癥細(xì)胞代謝;黃柏清熱燥濕，具有祛濕消腫的作用，可促進(jìn)局部血腫的吸收和激化[5]，促進(jìn)血清補(bǔ)體水平的升高;紅花、血竭、乳香、沒藥為臣藥，有活血化瘀作用;血竭有斂瘡生肌功效。這些藥物均能促進(jìn)巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的生成，抑制炎癥細(xì)胞的繁殖，促進(jìn)生子因子bFGF、TGF-β1等水平的提高。獨(dú)活、當(dāng)歸、姜黃、川芎為佐藥，均有理氣活血作用和加強(qiáng)通絡(luò)效果;冰片則有消腫止痛作用。所以，自擬跌創(chuàng)膏有活血化瘀、通絡(luò)舒筋、消腫止痛、祛風(fēng)除濕、強(qiáng)壯筋骨之功效。研究[6]病理學(xué)指出，采用活血類中藥治療軟組織損傷后，在組織形態(tài)學(xué)上第1天的表現(xiàn)為表皮膿痂形成，皮下有彌漫性出血和多中性粒細(xì)胞浸潤，肌纖維斷裂、扭曲，玻璃樣變明顯，周圍血管擴(kuò)張明顯。第7天則表現(xiàn)為表皮大致正常，皮下組織增生不明顯，無明顯的中性粒細(xì)胞浸潤，肌纖維明顯愈合，肌間質(zhì)無明顯腫脹，小血管無明顯充血。

表3 3組家兔肢體相關(guān)指標(biāo)比較分析(s)

表3 3組家兔肢體相關(guān)指標(biāo)比較分析(s)

比較點(diǎn)生理鹽水組 紅花油組 自擬跌創(chuàng)膏組bFGF 第1天94.21±10.74 98.45±10.58 100.46±10.36第4天 95.10± 9.98 104.25±10.35 109.43± 9.36第7天 96.22± 9.94 108.46±11.24 116.36± 7.95 TGF-β1 第1天 113.68±18.46 114.46±17.35 116.96±18.24第4天 114.75±17.35 116.35±17.58 125.47±19.35第7天 116.12±17.89 119.06±18.04 130.35±20.54細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(%)第1天 30.87±6.66 31.12±6.25 35.36±3.89第4天 31.04±6.46 33.35±5.95 40.84± 3.68第7天 32.12±5.62 36.24±5.37 52.37± 4.63總補(bǔ)體活性水平(u/ml)第1天 33.79±0.59 36.37±0.62 38.36±0.72第4天 33.98±0.55 39.38±0.72 40.78± 0.68第7天 34.13±0.56 41.13±0.73 49.34± 0.79炎癥細(xì)胞 第1天 63.21±10.35 59.47±10.13 57.36± 8.89第4天 60.24±9.97 55.49±8.36 50.17±6.82第7天 57.86±9.87 51.93±7.92 36.36±4.36成纖維細(xì)胞 第1天 33.23±5.30 34.84±5.85 35.85±5.93第4天 34.83±5.80 36.72±6.02 38.94±6.14第7天 35.85± 6.30 37.83± 5.94 45.83±6.78巨噬細(xì)胞 第1天 42.13±6.70 43.26±5.18 46.37±3.95第4天 43.17± 5.30 45.89± 3.68 53.37±4.84第7天 44.10± 5.50 50.76± 4.87 63.36±5.50 P值 ＜0.05

圖1 正常家兔組織

圖2 軟組織損傷家兔組織，可見細(xì)胞周圍間隙增寬

圖3 HE染色后細(xì)胞增色，泡沫細(xì)胞增加明顯

圖4 治療7 d后細(xì)胞組織中出現(xiàn)新生毛細(xì)血管

從本次研究結(jié)果看，自擬跌創(chuàng)膏在肢體腫脹程度、痛閾值、bFGF、TGF-β1、細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、總補(bǔ)體活性水平、炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等指標(biāo)變化較生理鹽水組、紅花油組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明該藥物效果確切，且本次研究結(jié)合現(xiàn)代藥物制劑手段，制成膏劑攜帶方便、操作簡單，且不存在散劑等皮膚過敏等不良反應(yīng)，機(jī)體吸收快速，符合軟組織損傷后機(jī)體代謝迅速的特點(diǎn)，可起到“藥到病除”的功效。報(bào)道[8]通過散瘀止痛巴布膏治療小鼠后發(fā)現(xiàn)，在改善大鼠全血黏度、血漿黏度、纖維蛋白原含量、bFGF、TGF-β1、細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和吞噬細(xì)胞等細(xì)胞上效果明顯。

結(jié)合相關(guān)的報(bào)道[9，10]我們認(rèn)為，中藥外用在軟組織損傷上的作用機(jī)制可能有以下幾點(diǎn):①抑制炎性細(xì)胞滲出、浸潤，調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)的合成和釋放，達(dá)到抗炎的作用;②改善機(jī)體代謝，促進(jìn)增生病變的轉(zhuǎn)化和稀釋，使萎縮的結(jié)締組織恢復(fù)，促使機(jī)體處于正常平衡狀態(tài);③通過機(jī)體特異性免疫力，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力，調(diào)節(jié)機(jī)體的炎性細(xì)胞反應(yīng)，加速機(jī)體清除體內(nèi)積血后經(jīng)絡(luò)瘀血;④通過痛閾而達(dá)到鎮(zhèn)痛作用;⑤改善損傷部位的微循環(huán)和血液流變學(xué)性質(zhì)，糾正PH值，降低毛細(xì)血管通透性;⑥促進(jìn)生長因子的生成，修復(fù)機(jī)體的組織代謝水平。但是，如何從中藥影響生長因子的信息傳遞而參與調(diào)節(jié)局部炎癥反應(yīng)、局部組織的修復(fù)等過程的課題是今后的發(fā)展方向。

[1]高駿.冰黃消腫鎮(zhèn)痛劑治療急性軟組織損傷的臨床觀察及實(shí)驗(yàn)研究[D].湖北中醫(yī)藥大學(xué)，2010，9(12):437-439.

[2]豐哲.傷速康涂膜液治療急性軟組織損傷的實(shí)驗(yàn)研究[D].湖南中醫(yī)學(xué)院，2013，10(10):473-475.

[3]姜慧婷，楊婉花，陳冰，等.伸筋活血合劑抗炎鎮(zhèn)痛和治療軟組織損傷作用的研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(10):269-272.

[4]Wang，Yong-Zhi，Guo，Chun-Yu，Zhong，Hong-Gang[J].In vivo effects of Pain Relieving Plaster on closed soft tissue injury in rabbit ears，2010，5(13):4953-4956.

[5]楊懋穎，扈榮，沈麗美，等.治傷膠囊對軟組織損傷小鼠炎癥細(xì)胞因子的影響[J].中國中醫(yī)藥科技，2011，18(3):194-195.

[6]徐琳本，陳麗萍，肖梅英，等.活血促愈膠囊對外傷血瘀證大鼠模型的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(4):270-273.

[7]王平，戚天臣.活血化瘀膏對小鼠臀部急性軟組織損傷抗炎作用的研究[J].天津中醫(yī)藥，2010，27(1):53-55.

[8]李馳榮，張尊祥，蔡曉紅，等.散瘀止痛巴布膏對大鼠試驗(yàn)性炎癥和疼痛藥效學(xué)研究[J].東南國防醫(yī)藥，2010，10(5):349-351.

[9]都興東，劉軍權(quán)，李德本，等.威弛搽劑治療家兔急性軟組織損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2010，25(1):12-15.

[10]Wang Chang-sheng，Cheng Xun-sheng，Chen Xiao-song.Effect of seawater immersion on periosteal function of the soft tissue with open injury in rabbit limbs[J].Chinese medicine and sailing high pressure medical journal，2012，19(1):1-8.