甲烷氧化菌20Z利用Embden-Meyerhof-Parnas途徑高效同化甲烷

崔金玉，姚陸，孫效樂，Marina G. Kalyuzhnaya，楊松,4

1 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 山東省應(yīng)用真菌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109

2 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測試驗(yàn)研究所，山東 濟(jì)南 250100

3 美國華盛頓大學(xué)微生物系，華盛頓州 西雅圖 98105

4 天津大學(xué)系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072

甲烷氧化菌20Z利用Embden-Meyerhof-Parnas途徑高效同化甲烷

崔金玉1，姚陸1，孫效樂2，Marina G. Kalyuzhnaya3，楊松1,4

1 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 山東省應(yīng)用真菌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109

2 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測試驗(yàn)研究所，山東 濟(jì)南 250100

3 美國華盛頓大學(xué)微生物系，華盛頓州 西雅圖 98105

4 天津大學(xué)系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072

崔金玉, 姚陸, 孫效樂, 等. 甲烷氧化菌20Z利用Embden-Meyerhof-Parnas途徑高效同化甲烷. 生物工程學(xué)報, 2014, 30(1): 43?54.

Cui JY, Yao L, Sun XL, et al. Highly efficient methane assimilation through Embden-Meyerhof-Parnas pathway in Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Chin J Biotech, 2014, 30(1): 43?54.

為了探究γ-變形菌綱 (Gammaproteobacteria) 甲烷氧化菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z的甲烷同化代謝過程。文中整合RNA-seq、LC-MS技術(shù)并結(jié)合13C標(biāo)記策略對核酮糖單磷酸途徑 (Ribulose monophosphate pathway) 及下游途徑展開系統(tǒng)組學(xué)分析。M. alcaliphilum 20Z代謝物組定量分析表明Entner-Doudoroff (EDD) 途徑的中間代謝物6-磷酸葡萄糖的濃度是(150.95±28.75) μmol/L，2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸濃度低于質(zhì)譜定量分析檢測限，而Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) 途徑中果糖1,6-二磷酸、甘油醛-3-磷酸/二羥丙酮磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸的濃度分別是 (1 142.02±302.88) μmol/L、(1 866.76±388.55) μmol/L和(3 067.57±898.13) μmol/L。通過EDD和EMP途徑的代謝物13C同位素動態(tài)富集研究，進(jìn)一步揭示3位標(biāo)記丙酮酸豐度是1位標(biāo)記丙酮酸豐度的4～6倍。最后，基因表達(dá)比較分析發(fā)現(xiàn)EMP途徑的關(guān)鍵基因 (如：fbaA、tpiA、gap和pykA) 的表達(dá)水平 (RPKM) 分別是2 479.2、2 493.9、2 274.6和1 846.0，而EDD途徑中基因 (如：pgi、eda和edd) 的RPKM僅是263.8、341.2和225.4。綜合上述結(jié)果闡明EMP途徑才是M. alcaliphilum 20Z進(jìn)行甲烷同化的關(guān)鍵通路。EMP途徑代謝功能的全新闡述不但改變對Gammaproteobacteria甲烷氧化菌甲烷同化模式的傳統(tǒng)認(rèn)知，而且為甲烷高效生物催化轉(zhuǎn)化提供重要的理論基礎(chǔ)。

甲烷氧化菌，甲烷同化途徑，甲烷生物催化，13C標(biāo)記代謝物組，轉(zhuǎn)錄物組

甲烷 (CH4) 是驅(qū)動全球氣候變暖的重要溫室氣體，同時甲烷作為天然氣和沼氣的主要成分不但是高價值燃料資源，也是一碳化工的重要前體原料[1-2]。近年來，探討如何有效實(shí)現(xiàn)甲烷催化轉(zhuǎn)變成化學(xué)產(chǎn)品成為國內(nèi)外化工領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)課題之一[3-4]。甲烷氧化菌是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一能以甲烷作為生長碳源和能源的生物體。Gammaproteobacteria甲烷氧化菌利用核酮糖單磷酸途徑 (Ribulose monophosphate pathway，RuMP) 同化代謝甲烷，是實(shí)現(xiàn)甲烷高效生物催化轉(zhuǎn)化的最有前景微生物系[5-6]。然而除了單細(xì)胞蛋白和聚β-羥基丁酸(poly-β-hydroxybutyrrate)[7-8]，目前基于甲烷的生物催化轉(zhuǎn)化合成高附加值產(chǎn)品的成功研究還沒有報道過。其中一個主要原因是甲烷氧化菌基因組和后基因組的信息缺少、代謝網(wǎng)絡(luò)信息不完整，阻礙對甲烷氧化菌合理而有效的代謝工程改造。

甲烷氧化菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z是一株代表性的中性嗜鹽、嗜堿Gammaproteobacteria菌，其生長速率較快且穩(wěn)定，是具有廣泛應(yīng)用前景的甲烷催化系統(tǒng)[9-10]。2011年，M. alcaliphilum 20Z基因組測序詮釋獲得完成，為進(jìn)一步從系統(tǒng)水平上闡明M. alcaliphilum 20Z的基因組功能、代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制及代謝工程改造奠定重要的理論基礎(chǔ)[11]。傳統(tǒng)生物化學(xué)和酶學(xué)研究一直認(rèn)為Gammaproteobacteria甲烷氧化菌主要利用RuMP途徑的Entner-Doudoroff pathway (EDD)分支途徑進(jìn)行甲烷氧化產(chǎn)物甲醛的同化吸收，而另一途徑Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) 是旁支代謝路徑[5]。然而，最近基因組分析顯示所有參與EMP途徑代謝反應(yīng)的基因都在M. alcaliphilum 20Z基因組中存在[11]。而且對Gammaproteobacteria嗜甲烷菌Methylococcus capsulatus Bath蛋白物組分析也表明EDD途徑和EMP途徑的催化酶在M. capsulatus Bath中適量表達(dá)[12]?？紤]到RuMP途徑中的EMP途徑比EDD途徑能更高效吸收利用甲烷[13]，深入探究EMP途徑在Gammaproteobacteria甲烷氧化菌中真正的代謝功能，就成為理解甲烷同化吸收過程和實(shí)現(xiàn)甲烷高效生物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵所在。

本研究以闡述M. alcaliphilum 20Z的中心代謝網(wǎng)絡(luò)特征為核心，利用RNA-seq、LC-MS技術(shù)并結(jié)合13C標(biāo)記策略，深入探討細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄物和代謝物兩個層次特征，揭示M. alcaliphilum 20Z中EMP途徑是參與甲烷同化的重要代謝過程。本研究結(jié)果對代謝工程改造Gammaproteobacteria甲烷氧化菌高效轉(zhuǎn)化甲烷合成高附加值產(chǎn)品具有十分重要的科學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 菌種

甲基營養(yǎng)桿菌Methylotrophic extorquens AM1和Methylomicrobium alcaliphilum 20Z由美國華盛頓大學(xué)Mary E.Lidstrom課題組贈送。

1.2 試劑

氨基酸、有機(jī)酸和糖磷酸等12C-標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品是分析級，購買于Sigma 公司(St. Louis, MO, USA)。乙醇從EMD Chemicals公司購買(Gibbstown, NJ, USA)。液相色譜使用是LC-MS級溶劑(Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA)。超純水由Millipore Q Reference制備。13C標(biāo)記甲醇 (99%) 和13C標(biāo)記甲烷分別購買于Cambridge Isotope Laboratories公司 (Andover, MA, USA)和Sigma公司。

1.3 Methylotrophic extorquens AM1和Methylomicrobium alcaliphilum 20Z的培養(yǎng)

1.3.1 M. extorquens AM1分批培養(yǎng)和以13C標(biāo)記甲醇為碳源的連續(xù)恒化培養(yǎng)

M. extorquens AM1在250 mL錐形瓶中進(jìn)行液體分批培養(yǎng)，甲醇作為碳源，卡那霉素濃度是50 μg/mL，培養(yǎng)溫度28 ℃，具體培養(yǎng)方法參見文獻(xiàn)[14]。

M. extorquens AM1在1 L發(fā)酵罐(BioFlo110，New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA) 中連續(xù)恒化培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)的無機(jī)鹽組分與分批培養(yǎng)相同，25 mmol/L13C標(biāo)記甲醇作為碳源。培養(yǎng)過程中, 為除去空氣中的CO2，將壓縮空氣通過3個串聯(lián)的內(nèi)含有1 L KOH (4 mol/L)溶液的錐形瓶。恒化培養(yǎng)稀釋率D= 0.1 h–1, OD600=1.0±0.1，5個培養(yǎng)周期后收集細(xì)胞。

1.3.2 M. alcaliphilum 20Z的培養(yǎng)

M. alcaliphilum 20Z培養(yǎng)在改良NMS培養(yǎng)基上[10]，含有3% NaCl，0.25g KNO3，pH為8.9，甲烷濃度是35% (V/V)，搖床轉(zhuǎn)速是250 r/min，培養(yǎng)溫度是30 ℃，氣相色譜火焰離子化檢測器檢測甲烷消耗濃度。

1.4 代謝物組的制備

1.4.113C標(biāo)記內(nèi)標(biāo)代謝物的制備

10 mL13C標(biāo)記M. extorquens AM1細(xì)胞培養(yǎng)液小心、快速轉(zhuǎn)移至28 mL冷浸液中 (HEPES (70 mmol/L, pH 6.8)，60%甲醇 (V/V) 溶液，–40 )℃，低溫冷凍離心 (Dupont Sorvall RC5B, Waltham, MA, USA)，棄去上清液，沉淀細(xì)胞顆粒重新溶解于同樣的冷浸溶液中，并在10 000 r/min下再次離心6 min，接著提取13C標(biāo)記內(nèi)標(biāo)代謝物。提取核苷酸、有機(jī)酸、氨基酸和糖磷酸的方法參見文獻(xiàn)[15]。對于?；o酶，使用文獻(xiàn)[15]中的酸提取方法。將所有13C標(biāo)記的細(xì)胞提取物合并、稀釋和分裝在–80℃下貯存，待用。

1.4.2 M. alcaliphilum 20Z代謝物組的樣品制備

6 mL (OD600=0.4±0.2) 的細(xì)胞，按照上述方法進(jìn)行冷浸，接著在提取代謝物組前，將90 μL的13C標(biāo)記內(nèi)標(biāo)代謝物快速添加到細(xì)胞中，代謝物組提取方法參考文獻(xiàn)[15]，所獲樣品溶解在100 μL的超純水中待分析。

1.5 LC-MS分析代謝物組

LC-MS是在Waters (Milford, MA, USA) 系統(tǒng)上進(jìn)行。LC-MS系統(tǒng)由1525 μ的高效液相色譜泵、2777C自動進(jìn)樣器及Quattro Micro API質(zhì)譜儀(Micromass, Manchester, UK)組成。液相色譜分離采用HILIC模式，色譜柱是Luna NH2(250 mm×2 mm, 5 mμ, Phenomenex)，具體方法參見文獻(xiàn)[16]，質(zhì)譜掃描模式是多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。代謝物峰用Masslynx Quanlynx Applications Manager (version 4.1)軟件進(jìn)行分析。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

4 μL不同濃度的12C標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品添加到已制備好的36 μL13C標(biāo)記內(nèi)標(biāo)代謝物中，最終12C標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別是200、500、1 000、2 500、5 000、10 000、25 000、50 000 nmol/L。以12C標(biāo)準(zhǔn)品峰面積和13C標(biāo)記內(nèi)標(biāo)代謝物峰面積的比值作為縱坐標(biāo)，以12C標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而計算擬合方程和R2，具體方法參見文獻(xiàn)[15]。

1.713C標(biāo)記動態(tài)代謝物組分析

M. alcaliphilum 20Z在指數(shù)生長中期(OD600=0.25±0.05) 轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)瓶中，并快速添加相應(yīng)濃度13CH4(純度是99.9%)，樣品在時間點(diǎn) (0、1、3、5、10、20、40 min) 進(jìn)行收集、提取和保存，具體方法參見1.4。

1.8 轉(zhuǎn)錄物組分析

45 mL M. alcaliphilum 20Z培養(yǎng)液(OD600=0.30±0.05) 添加到5 mL停止液 (含5%苯酚) 中，總RNA/DNA的提取方法參考文獻(xiàn)[17]，RNeasy Mini kit 和MICROExpress kit 用來純化RNA和富集mRNA，1% 瓊脂糖凝膠電泳和Agilent 2100 Bioanalyzer分析提取的RNA質(zhì)量。RNA-seq在美國華盛頓大學(xué)基因組測序中心完成，測序平臺為Illumina高通量深度測序。測序讀段 (Reads) 利用Burrows-Wheeler transform算法和M. alcaliphilum 20Z參考基因組比對和定位。利用Cufflinks軟件計算在基因組上定位讀段的數(shù)量即RPKM (Reads Per Kilobase of gene per Million mapped reads)，RPKM是每百萬讀段中來自某一基因每千堿基長度的讀段數(shù)目。RPKM=基因壓讀段計數(shù)×109/(基因長度×測序深度)，具體分析方法參見文獻(xiàn)[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 M. alca liphilum 20Z中心代謝網(wǎng)絡(luò)的代謝物濃度定量

代謝物濃度影響代謝反應(yīng)的方向和代謝反應(yīng)的速率，因此準(zhǔn)確定量代謝物是解析M. alcaliphilum 20Z代謝網(wǎng)絡(luò)特征的重要元素,是和其他微生物系進(jìn)行比較分析的基礎(chǔ)。由于代謝物組樣品成分復(fù)雜，代謝物在質(zhì)譜離子源離子化過程中存在顯著差異性，并且離子間存在抑制效應(yīng)，因此13C標(biāo)記內(nèi)標(biāo)代謝物 (13C-IS)的添加是矯正質(zhì)譜分析和樣品制備過程中出現(xiàn)誤差的重要方法[15]。然而商業(yè)化13C-IS稀缺且價格昂貴，本研究首先利用甲基營養(yǎng)菌M. extorquens AM1生物合成13C-IS，進(jìn)而將合成的13C-IS添加到M. alcaliphilum 20Z的代謝物提取液中，以提高M(jìn). alcaliphilum 20Z胞內(nèi)代謝物濃度定量的準(zhǔn)確性。選擇M. extorquens AM1菌合成13C-IS是因?yàn)槠浯x物組成分及代謝網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和M. alcaliphilum 20Z相似，而且M. extorquens AM1生長更快速。圖1顯示M. alcaliphilum 20Z代謝物組絕對定量流程。

圖1 甲烷氧化菌M. alcaliphilum 20Z的代謝物組絕對定量流程Fig. 1 Workflow of absolute quantitation of etabolome in M. alcaliphilum 20Z. A: bioreactor cultivation of M. extorquens AM1 grown on13C-methanol to obtain13C-IS; B: the development ofcalibration curve on LC-MS; C: the measurement of intracellular pool of M. alcaliphilum 20Z based on M. extorquens AM1 derived13C-IS.

表1 M. alcaliphilum 20Z和M. trichosporium OB3b胞內(nèi)中間代謝物濃度的比較分析Table 1 Comparison of intracellular pool of key metabolites between M. alc aliphilum 20Z and M. trichosporium OB3b

表1是M. alcaliphilum 20Z的24個中心代謝物濃度的定量結(jié)果。與我們前期研究報道α-變形菌綱 (Alphaproteobacteria) 甲烷氧化菌Methylosinus trichosporium OB3b的中心代謝物濃度相比較[18]，絲氨酸循環(huán)途徑 (Serine cycle) 的中間代謝物，如甘氨酸 (Glycine)、絲氨酸 (Serine)和甘油酸 (Glycerate)的濃度沒有顯著變化。在三羧酸 (Tricarxylic acid cycle，TCA) 循環(huán)途徑中，由草酰乙酸 (Oxalaceticacid，OAA) 合成游離氨基酸天冬氨酸 (Aspartate)，在M. alcaliphilum 20Z中天冬氨酸的濃度是M. trichosporium OB3b的5.8倍，該結(jié)果與M. alcaliphilum 20Z在高鹽環(huán)境下生長積累的四氫甲基嘧啶羧酸關(guān)聯(lián)[10]。在M. alcaliphilum 20Z中，果糖1，6-二磷酸(Fructose-1, 6-bisphosphate，F(xiàn)BP)、核酮糖5-磷酸 (Ribulose 5-phosphate，Ru5P)、磷酸烯醇式丙酮酸 (Phosphoenolpyruvate, PEP) 濃度分別是M. trichosporium OB3b的8.4倍、6.1倍和2.7倍，該結(jié)果與RuMP途徑是M. alcaliphilum20Z進(jìn)行甲烷同化吸收的主要代謝途徑的觀點(diǎn)相一致。此外，近來在M. extorquens AM1和M. trichosporium OB3b中分別發(fā)現(xiàn)新穎的乙醛酸回補(bǔ)途徑 (Ethylmalonyl-CoA pathway，EMC途徑) 的存在[18-19]，然而在M. alcaliphilum20Z中未能檢測到EMC途徑的關(guān)鍵中間代謝物(如：甲基琥珀酸 (Methylsuccinic acid) 和3-羥丁酰- CoA (3-hydroxybutyryl-CoA))，該結(jié)果表明正常培養(yǎng)條件下，EMC途徑在M. alcaliphilum 20Z中沒有功能性激活。

傳統(tǒng)研究認(rèn)為EDD途徑是RuMP途徑的主要分支途徑同化吸收甲烷氧化產(chǎn)物甲醛，而EMP途徑僅是旁支途徑[5]。然而，代謝物組定量分析卻發(fā)現(xiàn)了相反結(jié)果。由表1可知，EDD途徑的關(guān)鍵中間代謝物6PG和KDPG濃度很低(其中6PG濃度是(150.95±28.75) μmol/L,而KDPG濃度低于10 μmol/L不能準(zhǔn)確定量)。EMP途徑的關(guān)鍵中間代謝物濃度明顯高于EDD途徑的，其中FBP濃度是 (1 142.02±302.88) μmol/L, GAP/DHAP是(1 866.76±388.55) μmol/L，PEP是 (3 067.57±898.13) μmol/L。通過比較分析兩個分支代謝途徑的中間代謝物濃度，我們可以推測EMP途徑很可能在甲烷同化吸收過程中起到更重要的作用。

2.2 EDD和EMP途徑中間代謝物的13C同位素富集分析

由圖2可見，在1 min時，果糖-6-磷酸/葡萄糖-6-磷酸 (Fructose-6-phosphate/Glucose-6-phosphate，F(xiàn)6P/G6P) 已經(jīng)明顯獲得1個碳的13C富集，這表明甲烷快速通過核酮糖5-磷酸 (Ru5P)和甲醛的反應(yīng)被吸收進(jìn)入下游代謝途徑。1個碳標(biāo)記的F6P/G6P隨著時序延長而相對豐度逐漸減少，而多碳標(biāo)記的F6P/G6P相對豐度逐漸增加，這是由于磷酸戊糖途徑的碳重排反應(yīng) (圖3A)。EMP途徑下游中間代謝物 (如：2-磷酸葡萄糖/3-磷酸葡萄糖 (Glucose-2-phosphate/ Glucose-3-phosphate, 2PG/3PG) 和PEP) 也同樣地快速獲得1碳、2碳和3碳的13C富集，而且2PG/3PG和PEP在40 min時的總13C富集豐度分別是54.9%和46.1%，這表明13C代謝流顯著地通過EMP途徑。由于6PG和KDPG濃度極低，不能清楚檢測到13C富集。

Pyruvate是兩個分支途徑的共同終點(diǎn)代謝物，如果13C標(biāo)記甲醛主要通過EMP途徑同化吸收，將生成1個碳標(biāo)記pyr在第3位 (即[3-13C1]-pyr)，相反通過EDD途徑將生成1個碳標(biāo)記pyr在第1位 (即[1,13C1]-pyr) (圖3A)。我們利用LC-MS/MS分析1個碳標(biāo)記pyr的位置,發(fā)現(xiàn)在13C富集過程中，[3-13C1]-pyr的豐度高于[1,13C1]-pyr的約4?6倍 (圖3B)。該結(jié)果清楚表明EMP途徑實(shí)際上是更重要分支途徑來進(jìn)行甲烷的吸收代謝。

此外，我們也檢測了絲氨酸循環(huán)途徑的中間代謝物serine和glycine的13C富集規(guī)律，serine和glycine在0-40 min中13C富集豐度明顯偏低 (圖2)。

2.3 EDD和EMP途徑基因表達(dá)水平的比較分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證代謝物組和13C同位素動態(tài)富集研究的結(jié)論，我們比較分析了EDD和EMP途徑相關(guān)基因的表達(dá)水平。由表2可見，在EDD途徑中，參與催化反應(yīng)的基因，例如基因pgi、 eda和edd的表達(dá)豐度 (即RPKM) 分別是263.8、341.2和225.4。反之，EMP途徑的基因有明顯更高的表達(dá)水平，例如基因fbaA、tpiA、gap和pykA的RPKM分別是2 479.2、2 493.9、2 274.6和1 846.0。因此整合轉(zhuǎn)錄物豐度、代謝物組濃度和13C標(biāo)記分析的結(jié)果，我們認(rèn)為EMP途徑，而不是EDD途徑才是M. alcaliphilum 20Z進(jìn)行甲烷同化吸收的主要代謝通路 (圖4)。

圖 2 M. alcaliphilum 20Z胞內(nèi)中間代謝物13C富集的變化規(guī)律Fig. 213C-incorporation in a time course in M. alcaliphilum 20Z. M+0 represents non-labeled, M+1 represents compound with one13C- label, M+2 represents compound with two13C-labels, etc. F6P/G6P: fructose-6-phosphate + glucose-6-phosphate; PEP: phosphoenolpyruvate; 2PG/3PG: 2-phosphoglycerate + 3-phosphoglycera.

圖3 丙酮酸13C示蹤分析揭示EMP途徑和EDD途徑的甲烷同化代謝能力的差異性Fig. 3 Pyruvate as an indicator to distinguish between EMP pathway and EDD pathway. (A)Overview of methane oxidation and the ribulose-monophosphate pathway(RuMP) for formaldehyde assimilation. (B)13C-pyruvate labeling patterns in a time course.

3 討論

圖4 EMP途徑是甲烷同化代謝關(guān)鍵通路Fig. 4 Aschematic model depicting EMP pathway is the major route for methane assimilation. The thickness of arrows indicates the level of gene expression. The color of box indicates the concentration of metabolites. Ru5P: ribulose-5-phosphate; He6P: hexulose-6-phosphate; F6P: fructose-6-phosphate; G6P: glucose-6-phosphate; 6PG: 6-phosphogluconate; KDPG: 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate; GAP: glyceraldehyde-3-phosphate; FBP: fructose-1,6-bisphosphate; DHAP: dihydroxyacetone-phosphate; PEP: phosphoenolpyruvate. Gene predicted function: pmoCAB: particulate methane monooxygenase; mxaFI: PQQ-dependent methanol dehydrogenase; fadh: 2,4-dienoyl-CoA reductase; fdsACD: formate dehydrogenase; fdhA: formate dehydrogenase; hps: 3-hexulosephosphate synthase; hpi: phosphohexuloisomerase; pfk: fructose-2,6-biphosphatase; fba: fructose-bisphosphate aldolase; pykII: pyruvate kinaseII; fdhA: tungsten-containing NAD-dependent formate dehydrogenase; fdsACD: formate dehydrogenase.

表 2 M. alcaliphilum 20Z的EDD和EMP途徑基因表達(dá)水平比較分析Table 2 Gene expression profile of EDD and EMP pathways in M. alcaliphilum 20Z

目前對于甲烷氧化菌研究多涉及于生理、生化特征分析和重構(gòu)代謝網(wǎng)絡(luò)，以及甲烷單加氧化酶 (Methane monooxygenase enzyme) 催化機(jī)理與生物修復(fù)功能等的研究[3-5]。相比參與自然界碳循環(huán)的其他微生物系 (如：光合作用藍(lán)細(xì)菌cyanobacterium Prochlorococcus marinus和甲烷菌Methanopyrus kandleri)，甲烷氧化菌基因組研究起步較晚而后基因組研究幾乎是空白[20]，基因組和后基因組信息的缺少導(dǎo)致對甲烷氧化菌代謝工程調(diào)控困難和工業(yè)化放大限制。近年來Mary Lidstrom和Murrell Colin等課題組對M. alcaliphilum 20Z、M. trichosporium OB3b、Methylomicrobium buryatense strain 5G等不同生態(tài)環(huán)境的代表性甲烷氧化菌株進(jìn)行基因組測序注釋[11,21–22]，這些前期工作為基因組功能挖掘和代謝調(diào)控機(jī)制闡明提供了重要的信息基礎(chǔ)。M. alcaliphilum 20Z是從鹽水湖中分離純化的中度嗜鹽和耐堿(pH7-11)的甲烷氧化菌。本研究工作整合LC-MS、RNA-seq和13C同位素示蹤技術(shù)分別從代謝物組和轉(zhuǎn)錄物組兩個層次系統(tǒng)研究M. alcaliphilum 20Z的中心代謝網(wǎng)絡(luò)。甲烷被甲烷單加氧化酶氧化生成甲醇，進(jìn)而氧化成甲醛，在3-磷酸己糖合成酶 (hps) 作用下，甲醛和Ru5P合成He6P，He6P在磷酸己糖異構(gòu)酶(phi) 的作用下轉(zhuǎn)化成F6P。通過EDD途徑，F(xiàn)6P依次轉(zhuǎn)化為G6P、6PG、KDPG和KDPG，最終KDPG分解生成GAP和丙酮酸;而在EMP途徑中，F(xiàn)6P首先磷酸化生成FBP，進(jìn)而分解生成DHAP和GAP，DHAP再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化生成PEP和丙酮酸 (圖4)。相對于Gammaproteobacteria甲烷氧化菌，Alphaproteobacteria甲烷氧化菌利用絲氨酸循環(huán)同化甲醛[5]。本研究的13C同位素富集結(jié)果顯示絲氨酸循環(huán)途徑的關(guān)鍵中間代謝物serine和glycine在40 min內(nèi)13C同位素總富集豐度低于8.0%和7.0%，這進(jìn)一步證實(shí)絲氨酸循環(huán)不是M. alcaliphilum 20Z進(jìn)行甲烷吸收的主要途徑。

傳統(tǒng)研究認(rèn)為RuMP 途徑的EDD分支途徑是同化甲醛主要途徑，另一分支EMP是旁路途徑。該結(jié)論的主要論據(jù)是EDD途徑的兩個關(guān)鍵酶6-磷酸葡萄糖脫水酶 (6-phosphogluconate dehydratase) 和 2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸醛縮酶 (2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase)有相對更高的活性，而且EMP途徑中pyruvate kinase酶活性不能在Gammaproteobacteria甲烷氧化菌中檢測到[5,23]。然而我們研究表明，和EDD途徑相比較，催化EMP途徑關(guān)鍵酶的基因都有相對高豐度的表達(dá)，而且EMP途徑的中間代謝物豐度明顯高于EDD途徑。更重要的是利用13C同位素標(biāo)記技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)13C標(biāo)記甲醛快速通過EMP途徑被吸收，而且分析EDD和EMP途徑的共同終點(diǎn)代謝物pyruvate的13C標(biāo)記位置，我們更清楚證明高代謝通量通過EMP途徑。

綜合上述研究，我們提出正常培養(yǎng)條件下的Gammaproteobacteria型甲烷氧化菌

M. alcaliphilum 20Z實(shí)際是利用EMP途徑而不是EDD途徑進(jìn)行甲烷同化吸收代謝的。由于EMP途徑的多個中間代謝物可以作為合成包括C2 (如乙酰輔酶A)、C4 (如琥珀酸) 和C6 (如葡萄糖) 等的重要前體代謝物，這就為進(jìn)一步利用合成生物學(xué)理念，改造M. alcaliphilum 20Z菌株，生產(chǎn)多種高附加值產(chǎn)品提供重要的基礎(chǔ)理論。目前研究結(jié)果對探討利用甲烷氧化菌加速甲烷減排的同時有效生物轉(zhuǎn)化甲烷具有重要的科學(xué)意義。

REFERENCES

[1] Stolaroff JK, Bhattacharyya S, Smith CA, et al. Review of methane mitigation technologies with application to rapid release of methane from the Arctic. Environ Sci Technol, 2012, 46(12): 6455–6469.

[2] Liu C, Lu XH. Carbon reduction pattern in China: comparison of CCS and biomethane route. CIESC J, 2013, 64(1): 7–10 (in Chinese).劉暢, 陸小華. 我國碳減排模式探討-CCS路線與生物甲烷路線的比較. 化工學(xué)報, 2013, 64(1): 7–10.

[3] Jiang H, Chen Y, Jiang P, et al. Methanotrophs: Multifunctional bacteria with promising applications in environmental bioengineering. Biochem Eng J, 2010, 49: 277–288.

[4] McMullin CL, Pierpont AW, Cundari TR. Complete methane-to-methanol catalytic cycle: a DFT study of oxygen atomtransfer from N2O to late-row (M=Ni, Cu, Zn) β-diketiminate CAH activationcatalysts. Polyhedron, 2013, 52: 945–956.

[5] Trotsenko YA, Murrell JC. Metabolic aspects of aerobic obligate methanotrophy. Adv Appl Microbiol, 2008, 63: 183–229.

[6] Schrader J, Schilling M, Holtmann D, et al. Methanol-based industrial biotechnology: current status and future perspectives of methylotrophic bacteria. Trends Biotechnol, 2009, 27(2): 107–115

[7] Bothe H, M?ller Jensen K, Mergel A, et al. Heterotrophic bacteria growing in association with Methylococcus capsulatus (Bath) in a singlecellprotein production process. Appl Microbiol Biotechnol, 2002, 59(1): 33–39.

[8] Khosravi-Darani K, Mokhtari ZB, Amai T, et al. Microbial production of poly(hydroxybutyrate) from C? carbon sources. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97(4): 1407–1424.

[9] Khmelenina VN, Rozova ON, Trotsenko YA. Characterization of the recombinant pyrophosphate-dependent 6-phosphofructokinases from Methylomicrobium alcaliphilum 20Z and Methylococcus capsulatus Bath. Meth Enzymol, 2011, 495:1–14.

[10] Khmelenina VN, Trotsenko YA. Characterization ofthe ectoine biosynthesis genes of haloalkalotolerant obligate methanotroph "Methylomicrobium alcaliphilum 20Z". Arch Microbiol, 2006, 184(5): 286–297.

[11] Vuilleumier S, Khmelenina VN, Bringel F, et al. Genome sequence of the haloalkaliphilic methanotrophic bacterium Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. J Bacteriol, 2012, 194(2): 551–552.

[12] Kao WC, Chen YR, Yi EC, et al. Quantitative proteomic analysis of metabolic regulation by copper ions in Methylococcus capsulatus (Bath). J Biol Chem, 2004, 279(49): 51554–51560.

[13] Anthony C. The Biochemistry of Methylotrophys. London: Academic Press, 1982.

[14] Yang S, Sadilek M, Synovec RE, et al. Liquid chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry and comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry measurement of targeted metabolites of Methylobacterium extorquens AM1 grown on two different carbon sources. J Chromatogr A, 2009, 1216(15): 3280–3289.

[15] Yang S, Sadilek M, Lidstrom ME. Streamlined pentafluorophenylpropyl column liquid chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry and global13C-labeled internal standards improve performance for quantitative metabolomics in bacteria. J Chromatogr A, 2010, 1217(47): 7401–7410.

[16] Yang S, Synovec RE, Kalyuzhnaya MG, et al. Development of a solid phase extraction protocol coupled with liquid chromatography mass spectrometry to analyze central carbon metabolites in lake sediment microcosms. J Sep Sci, 2013, 4(24): 3597–3605.

[17] Matsen JB, Yang S, Stein LY, et al. Global molecular analyses of methane metabolism in methanotrophic alphaproteobacterium, Methylosinus trichosporium OB3b. Part I: transcriptomics study. Front Microbiol, 2013, doi: 10.3389 /fmicb. 2013. 00040.

[18] Yang S, Matsen JB, Konopka M, et al. Global molecular analyses of methane metabolism in methanotrophic alphaproteobacterium, Methylosinus trichosporium OB3b, Part II: Metabolomics and13C-labeling study. Front Microbiol, 2013, 4: 70. doi: 10.3389/fmicb.2013.00070.

[19] Peyraud R, Kiefer P, Christen P, et al. Demonstration of the ethylmalonyl-CoA pathway by using 13C metabolomics. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(12): 4846–4851.

[20] Ward N, Larsen ?, Sakwa J, et al. Genomic insights into methanotrophy: the complete genome sequence of Methylococcus capsulatus (Bath). PLoS Biol, 2004, 2(10): e303.

[21] Stein LY, Yoon S, Semrau JD, et al. Genome sequence of the obligate methanotroph Methylosinus trichosporium strain OB3b. J Bacteriol, 2010, 192(24): 6497–6498.

[22] Khadem AF, Wieczorek AS, Pol A, et al. Draft genome sequence of the volcano-inhabiting thermoacidophilic methanotroph Methylacidiphilum fumariolicum strain SolV. J Bacteriol, 2012, 194(14): 3729–3730.

[23] Leak DJ, Dalton H. Growth yields of methanotrophs 2. A theoretical analysis. Appl Microbiol Biotechnol, 1986, 23(6): 477–481.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Highly efficient methane assimilation through Embden-Meyerhof-Parnas pathway in Methylomicrobium alcaliphilum 20Z

Jinyu Cui1, Lu Yao1, Xiaole Sun2, Marina G. Kalyuzhnaya3, and Song Yang1,4
1 Shangdong Province Key Laboratory of Applied Mycology, School of Life Sciences, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, Shandong, China
2 Institute of Quality Standards and Testing, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, Shandong, China
3 Department of Microbiology, University of Washington, Seattle, WA 98105, USA
4 Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, Tianjin University, Tianjin 300072, China

In order to understand metabolic functions essential for methane assimilation, we investigate dribulose monophosphate pathway and adjacent pathways in gammaproteobacterial Methylomicrobium alcaliphilum 20Z by using combined approaches of RNA-seq, LC-MS, and 13C-labeled techniques. The absolute quantification of metabolome showed that the concentrations of intermediates, such as glucose-6-phosphate and 2-dehydro-3-deoxy-phosphogluconate, involved in Entner-Doudoroff (EDD) pathway were (150.95±28.75) μmol/L and below the limit of detection of mass spectrometry. In contrast, fructose-1, 6-bisphosphate, glyceraldehyde-3-phosphate/dihydroxyacetone and phosphoenolpyruvate in Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) pathway had significantly higher concentrations with (1 142.02±302.88) μmol/L, (1 866.76±388.55) μmol/L and (3 067.57±898.13) μmol/L, respectively. 13C-labeling experiment further indicated that the enrichment of [3-13C1]-pyruvate involved in EMP pathway was 4–6 fold higher than [1,13C1]-pyruvate in EDD pathway in a dynamic course. Moreover, gene expression profile showed that the expression levels of genes in EMP pathway (e.g. fbaA, tpiA, gap and pykA) were 2 479.2, 2 493.9, 2 274.6 and 1 846.0, respectively, but gene expressionlevels in EDD pathway (e.g. pgi, eda and edd) were only 263.8, 341.2 and 225.4, respectively. Overall our current results demonstrated that EMP pathway was the main route for methane assimilation in M. alcaliphilum 20Z. This discovery challenged our understanding of methane assimilation pathway in gammaproteobacterial methanotrophic bacteria, and further provided an important insight for efficient methane biocatalysis in the future.

methanotrophs, methane assimilation, methane biocatalysis,13C-labeling metabolomics, transcriptomics

July 24, 2013; Accepted: October 8, 2013

Supported by: the USA Department of Energy (No. DE-SC0005154), Open Funding Project of the Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education of China, and Start-up Funding of High-level Talent at Qingdao Agricultural university (No. 1312). Corresponding author: Song Yang. Tel/Fax: +86-532-88030327; E-mail: yangsong15@hotmail.com

美國能源部基金 (No. DE-SC0005154) ，中國系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題基金，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才啟動基金(No. 1312)資助。

時間：2013-11-27 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20131127.1120.005.html