復(fù)合誘變選育高效轉(zhuǎn)化DHEA為7α,15α-diOH-DHEA的菌株及其轉(zhuǎn)化工藝優(yōu)化

李傳鵬，李會，吳燕，李恒，張汝金，張崢斌，史勁松，許正宏

1江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇無錫214122

2浙江仙居君業(yè)藥業(yè)有限公司，浙江臺州317300

復(fù)合誘變選育高效轉(zhuǎn)化DHEA為7α,15α-diOH-DHEA的菌株及其轉(zhuǎn)化工藝優(yōu)化

李傳鵬1，李會1，吳燕1，李恒1，張汝金2，張崢斌2，史勁松1，許正宏1

1江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇無錫214122

2浙江仙居君業(yè)藥業(yè)有限公司，浙江臺州317300

李傳鵬,李會,吳燕,等.復(fù)合誘變選育高效轉(zhuǎn)化DHEA為7α,15α-diOH-DHEA的菌株及其轉(zhuǎn)化工藝優(yōu)化.生物工程學(xué)報,2014,30(1):147?156.

Li CP,Li H,Wu Y,et al.Optimization of hydroxylating DHEA to 7α,15α-diOH-DHEA by compound mutation and fermentation optimization.Chin J Biotech,2014,30(1):147?156.

結(jié)合酮康唑抗性篩選法，采用亞硝基胍和低能氮離子注入復(fù)合誘變方法篩選得到一株高效生物轉(zhuǎn)化去氫表雄酮(DHEA)為3β,7α,15α-三羥基雄甾-5-烯-17-酮(7α,15α-diOH-DHEA)的菌株亞麻刺盤孢Colletotrichum lini ST-1，該突變株在底物DHEA投料濃度為10 g/L時產(chǎn)物摩爾得率達(dá)到34.2%，較出發(fā)菌株提高了46.2%。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行培養(yǎng)基組分的優(yōu)化，采用Plackett-Burman實驗設(shè)計考察轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中各組分對產(chǎn)物摩爾得率的影響，有效篩選出葡萄糖、酵母粉和MgSO4·7H2O濃度對產(chǎn)物摩爾得率影響顯著，繼而采用最陡爬坡路徑逼近最大響應(yīng)區(qū)域，并利用中心組合響應(yīng)面設(shè)計實驗對3個顯著性因素的最佳水平進(jìn)行研究，得到最適轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基組分為(g/L)：葡萄糖26.34；酵母粉12.15；玉米漿3.00；FeSO4·7H2O 0.015；MgSO4·7H2O 0.14；KH2PO40.90。采用該優(yōu)化培養(yǎng)基，菌株C.lini ST-1的產(chǎn)物摩爾得率達(dá)到49.3%，較優(yōu)化前提高了44.2%。

亞麻刺盤孢，生物轉(zhuǎn)化，復(fù)合誘變，培養(yǎng)基優(yōu)化，響應(yīng)面法

甾體激素藥物對機(jī)體有重要的調(diào)節(jié)作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)，其市場價值僅次于抗生素，在生物技術(shù)的推動下，其生產(chǎn)已經(jīng)成為醫(yī)療保健行業(yè)的重要分支[1-4]。去氫表雄酮(DHEA)是自然界生物體內(nèi)重要的活性物質(zhì)，其雙羥化產(chǎn)物3β,7α,15α-三羥基雄甾-5-烯-17-酮(7α,15α-diOHDHEA)是第4代口服避孕藥有效成分屈螺酮的重要前體[5-6]。

生物轉(zhuǎn)化是一種有效的工具，與化學(xué)合成相比，反應(yīng)條件溫和、具有較強(qiáng)的區(qū)域和立體選擇性，可以完成一些化學(xué)方法難以合成化合物的制備，并且已廣泛應(yīng)用于甾體化合物的合成[7-9]。近年來生物轉(zhuǎn)化DHEA的研究越來越受到關(guān)注，尚珂等[10]采用亞麻刺盤孢Colletotrichum lini AS 3.4486對DHEA進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，并且對其羥化機(jī)理進(jìn)行了初步探究。Romano等[11]應(yīng)用C.lini在N,N-二甲基甲酰胺助溶、添加輔底物葡萄糖和Tween-80分散條件下對DHEA進(jìn)行批次轉(zhuǎn)化，在DHEA總投料濃度為7 g/L時能得到5.8 g/L的7α,15α-diOH-DHEA。Lobastova等[12]分別采用尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum VKM F-1600和赤霉菌Gibberella zeae BKM F-2600轉(zhuǎn)化DHEA，在投料濃度為2 g/L時產(chǎn)物摩爾得率分別達(dá)到63.0%和68.0%。但是仍然存在菌株轉(zhuǎn)化效率不高、底物投料濃度低等缺點，成為DHEA生物轉(zhuǎn)化工業(yè)化應(yīng)用的瓶頸[13]。因此，通過篩選或改良獲得一株高效轉(zhuǎn)化DHEA的菌株具有重要的意義。

發(fā)酵過程參數(shù)的優(yōu)化通常采用單因素實驗，但是操作周期長，無法考察各因素之間的相互關(guān)系。Plackett-Burman實驗設(shè)計是一種兩水平、基于不完全平衡塊原理的設(shè)計方法，可以用最少的實驗次數(shù)在眾多的影響因素中快速有效地篩選出關(guān)鍵因素[14]。響應(yīng)面法是利用合理的實驗設(shè)計，通過模型的構(gòu)建與擬合，對各因素及各因素之間的相互作用進(jìn)行優(yōu)化和評價，快速有效地尋求最優(yōu)工藝參數(shù)的一種統(tǒng)計方法[15]。近年來，利用響應(yīng)面設(shè)計對發(fā)酵過程參數(shù)的優(yōu)化得到廣泛的應(yīng)用[16-21]。

本研究以實驗室保藏的C.lini為出發(fā)菌株，通過亞硝基胍(NTG)和低能氮離子(N+)注入復(fù)合誘變，并結(jié)合酮康唑抗性篩選法獲得一株高效轉(zhuǎn)化DHEA為7α,15α-diOH-DHEA的菌株。并在此基礎(chǔ)上采用統(tǒng)計學(xué)設(shè)計方法對轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，以進(jìn)一步提高誘變菌株的轉(zhuǎn)化效率，為DHEA生物轉(zhuǎn)化的工業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

C.lini：由本實驗室保藏。

1.2 主要材料與試劑

DHEA、7α,15α-diOH-DHEA為國產(chǎn)分析純，由浙江仙居君業(yè)有限公司提供；7α-OH-DHEA由本實驗室制備；其他化學(xué)試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；TLC薄板購自青島海洋化工有限公司。

1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。30℃培養(yǎng)3–5 d。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖15，酵母粉15，玉米漿3，豆餅粉10，pH自然。取菌種斜面，無菌水洗下孢子，玻璃珠振蕩打散，調(diào)整孢子濃度為1×106個/mL，取3 mL接種于含有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，30℃、220 r/min培養(yǎng)3 d后以10%(V/V)的接種量轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基二次活化，30℃、220 r/min培養(yǎng)1 d后制得液體種子。

酮康唑篩選培養(yǎng)基(g/L)：PDA液體培養(yǎng)基冷卻至70℃左右，加入不同體積的酮康唑母液(DMSO溶解、0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾除菌)，混合均勻倒平板。

轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖15，酵母膏15，玉米漿3，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，MgSO4·7H2O 0.3，KH2PO41，pH 6.5。以10%(V/V)的接種量接種于含有30 mL轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，30℃、220 r/min培養(yǎng)至24 h，以10 g/L投入底物DHEA，轉(zhuǎn)化3 d后停止轉(zhuǎn)化。

1.4 主要儀器

HYL-C組合式搖床購自太倉強(qiáng)樂實驗設(shè)備有限公司；Ultimate 3000高效液相色譜儀購自戴安公司；離子束注入設(shè)備由南京工業(yè)大學(xué)提供。

1.5 分析方法

1.5.1 薄層層析(TLC)檢測法

展開劑(氯仿:甲醇=15:1(V/V))；顯色劑(濃硫酸:乙醇=1:1(V/V))。采用硅膠板，點樣量3 μL，105℃加熱5 min顯色。

1.5.2 高效液相色譜(HPLC)檢測法

取轉(zhuǎn)化液，乙酸乙酯抽提多次后合并抽提液，干燥至出現(xiàn)結(jié)晶；色譜純乙腈復(fù)溶，0.22 μm的有機(jī)膜過濾除雜，HPLC檢測。

HPLC條件：柱型，Agilent TC-C18，4.6 mm× 250 mm，5 μm；流動相，乙腈/水(70∶30)；柱溫30℃；檢測波長，206 nm；流速，0.5 mL/min；進(jìn)樣量，10μL。

1.6 復(fù)合誘變方法

1.6.1 酮康唑最低抑菌濃度的確定

將單孢子懸液稀釋涂布于含有不同濃度酮康唑的PDA平板，30℃培養(yǎng)1–2 d后平板菌落計數(shù)，未生長菌落的最低作用濃度即為酮康唑的最低抑菌濃度[22]。

1.6.2 亞硝基胍(NTG)誘變劑量的確定

將單孢子懸液(1×106–1×108個/mL)與1 mg/mL的NTG溶液等體積混合，吹打均勻、30℃搖床振蕩反應(yīng)，分別處理10–60 min，0.9 mol/L的生理鹽水稀釋終止反應(yīng)，稀釋涂布于PDA平板；對照組未加入亞硝基胍；30℃培養(yǎng)1–2 d后平板菌落計數(shù)，選擇致死率在80%–90%的劑量作為最佳誘變劑量。

1.6.3 低能氮離子(N+)注入誘變劑量的確定

吸取100 μL單孢子懸液(1×106–1×108個/mL)均勻涂布于無菌空白平皿，無菌風(fēng)吹干制成菌膜，放入無菌真空靶室內(nèi)進(jìn)行N+離子注入(注入能量15 000 eV，注入劑量0.4×1016–4.0×1016ions/cm2，脈沖式注入，每個脈沖5 s，間隔15 s)，注入結(jié)束后加入1 mL無菌水洗下，稀釋涂布于PDA平板；對照組置于真空靶室內(nèi)，不經(jīng)離子注入；30℃培養(yǎng)1–2 d后平板菌落計數(shù)，計算存活率；分別挑取不同注入劑量平板上單菌落搖瓶發(fā)酵，計算正突變率，選擇正突變率最大的劑量為最佳注入劑量[23]。

1.6.4 復(fù)合誘變

將出發(fā)菌株單孢子懸液(1×109–1×1010個/mL)以亞硝基胍最佳誘變劑量處理后，吸取100 μL單孢子懸液制成菌膜，然后以最佳注入劑量氮離子注入，誘變結(jié)束后稀釋涂布于含有最低抑菌濃度的酮康唑篩選平板，篩選獲得高產(chǎn)突變株。

1.6.5 菌株的篩選

初篩：從生長差異較大篩選平板上隨機(jī)挑取生長良好的酮康唑抗性突變株劃線PDA平板，培養(yǎng)3–5 d后挑取氣生菌絲劃線PDA斜面。

復(fù)篩：單孢子懸液接種于種子培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，將二次活化種子液以10%(V/V)的接種量接種轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，培養(yǎng)至24 h以10 g/L投入底物DHEA，轉(zhuǎn)化3 d后停止轉(zhuǎn)化，取樣萃取和HPLC檢測。

1.7 優(yōu)化設(shè)計

Plackett-Burman設(shè)計：在單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過Plackett-Burman設(shè)計對影響產(chǎn)物摩爾得率的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基各組分進(jìn)行篩選，找出關(guān)鍵因素。

最陡爬坡實驗：根據(jù)Plackett-Burman實驗篩出的重要因素效應(yīng)的正負(fù)和大小來設(shè)計步長，按照正效應(yīng)取較高值、負(fù)效應(yīng)取較低值的原則，進(jìn)一步逼近產(chǎn)物摩爾得率最大響應(yīng)區(qū)域。

中心組合設(shè)計實驗：根據(jù)Plackett-Burman實驗篩選出的重要因素和最陡爬坡實驗確定的響應(yīng)面實驗因素水平的中心點，利用Design expert V8.0.6軟件設(shè)計響應(yīng)面實驗，對實驗結(jié)果進(jìn)行回歸模型的方差分析和響應(yīng)面分析，用F檢驗評價數(shù)學(xué)模型方程的顯著性，方程的擬合性由決定系數(shù)R2確定，最后獲得最佳培養(yǎng)基配方。

1.8 模型驗證

對擬合得到的回歸方程的各自變量求偏導(dǎo)數(shù)得到方程組，求解方程組得到極值點的自變量取值。再按照計算得到的參數(shù)進(jìn)行3次發(fā)酵轉(zhuǎn)化驗證實驗，以驗證模型的可靠性，并確定最終的優(yōu)化結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合誘變篩選結(jié)果

2.1.1 酮康唑最低抑菌濃度的確定

P450酶為甾體羥化反應(yīng)中起催化作用的酶，酮康唑等唑類化合物可以抑制P450酶活性，菌株的酮康唑抗性與P450酶羥化活力具有一定的相關(guān)性[24]。表1為不同酮康唑濃度下菌株的生長狀況，由表可知酮康唑濃度達(dá)到100 μmol/L時沒有菌落生長，將其作為最低抑菌濃度。

表1 酮康唑最低抑菌濃度的確定Table 1Minimum inhibitory concentration of ketoconazole

2.1.2 亞硝基胍誘變劑量的選擇

圖1為亞硝基胍誘變致死率曲線。對于多核細(xì)胞或孢子采用較高的誘變劑量可以獲得較純的變異菌落[25]，因此選擇致死率在80%–90%的作用時間30 min作為最佳誘變劑量。

2.1.3 低能氮離子注入誘變劑量的選擇

圖2為N+離子注入(注入能量15 000 eV，注入劑量0–4.0×1016ions/cm2)“馬鞍形”存活率曲線。圖3為N+離子注入劑量與正突變率的關(guān)系圖，由圖可知隨著注入劑量的增大，正突變率先增大后減小，注入劑量為2.8×1016ions/cm2時正突變率最大，將其作為最佳注入劑量。

2.1.4 復(fù)合誘變菌株的篩選

以最佳誘變劑量進(jìn)行復(fù)合誘變。經(jīng)多輪篩選選取5株產(chǎn)量較高的菌株斜面保藏并進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，最終選取菌株C.lini ST-1進(jìn)行后續(xù)研究。其產(chǎn)物摩爾得率達(dá)到34.2%，與出發(fā)菌株(產(chǎn)物摩爾得率23.4%)相比提高了46.2%。突變株經(jīng)斜面連續(xù)傳代5次后，產(chǎn)物摩爾得率穩(wěn)定，表明菌株遺傳穩(wěn)定性良好。傳代穩(wěn)定性實驗結(jié)果見表2。

圖1 NTG誘變致死率曲線Fig.1Lethality curve by NTG.

圖2 N+注入存活率曲線Fig.2Survival rate curve by N+implantation.

圖3 N+注入劑量與正突變率的關(guān)系Fig.3Relation of dose and positive mutation rate of N+implantation.

2.2 統(tǒng)計學(xué)實驗優(yōu)化轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基

2.2.1 Plackett-Burman實驗

利用design expert V8.0.6軟件進(jìn)行PB實驗設(shè)計，對葡萄糖(X1)、酵母粉(X2)、玉米漿(X3)、FeSO4·7H2O(X4)、MgSO4·7H2O(X5)、KH2PO4(X6) 6個因素進(jìn)行考察，每個因素取高(+)低(-)兩個水平，響應(yīng)值為7α,15α-diOH-DHEA的摩爾得率(Yp)。實驗設(shè)計與結(jié)果見表3，實驗結(jié)果方差分析見表4。

表4顯示葡萄糖、酵母粉和MgSO4·7H2O對產(chǎn)物摩爾得率影響顯著(P＜0.05)。其中正向影響因子為葡萄糖，負(fù)向影響因子為酵母膏和MgSO4·7H2O，各因素對產(chǎn)物摩爾得率的影響可用以下方程表示：

方程的決定系數(shù)R2=0.9530，表明該回歸方程擬合良好。

2.2.2 最陡爬坡實驗結(jié)果

試驗設(shè)計及結(jié)果如表5所示。由表5可知最大產(chǎn)物摩爾得率區(qū)在第4次實驗附近，產(chǎn)物得率達(dá)到47.1%。因此，后續(xù)響應(yīng)面實驗將實驗4的培養(yǎng)基濃度作為中心組合設(shè)計實驗的中心點。

表2 突變株的遺傳穩(wěn)定性Table 2Genetic stability of mutant strain

表3 Plackett-Burman實驗設(shè)計及響應(yīng)值Table 3Plackett-Burman design and responding value

表4 Plackett-Burman實驗設(shè)計各因素水平及影響效果Table 4Factors levels and results of Plackett-Burman design

表5 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5Experimental design and results of steepest ascent

2.2.3 響應(yīng)面實驗結(jié)果分析

采用design expert V8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計確定顯著因子的最優(yōu)水平，并進(jìn)行回歸分析和方差分析，擬合得到回歸方程:

中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果見表6，回歸模型的方差分析見表7，響應(yīng)面圖形見圖4–6。

從表7的回歸模型的方差分析以看出，回歸模型的P＜0.0001，該值小于0.01，表明該模型極顯著。一次項X2、X5的P＜0.05，顯著，平方項X12、X22、X52的P＜0.0001，極顯著，表明各因素與產(chǎn)物摩爾得率之間存在明顯的二次關(guān)系，X1X5、X2X5的P＜0.05，顯著，且X2X5達(dá)到極顯著水平，表明X2與X5的交互作用對產(chǎn)物摩爾得率影響顯著。一次項X1和交互項X1X2的P>0.05，不顯著。失擬項的P值為0.2304，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于0.05，不顯著，表明實驗數(shù)據(jù)與模型擬合良好。模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9638，表明該模型能夠解釋96.38%的響應(yīng)值變化，該模型能較好地模擬7α,15α-diOH-DHEA的實際轉(zhuǎn)化過程。

表6 中心組合設(shè)計及結(jié)果Table 6Experiment design and results of the CCD design

表7 回歸模型方差分析Table 7ANOVA of response surface model

從圖4–6響應(yīng)面分析立體圖可以看出X1與X5、X2與X5的交互作用顯著，X1、X2和X5存在極值點。對回歸方程求導(dǎo)得到培養(yǎng)基組分(g/L)為：葡萄糖26.34；酵母粉12.15；玉米漿3；FeSO4·7H2O 0.015；MgSO4·7H2O 0.14；KH2PO40.9。將各數(shù)值代入回歸方程得到理論產(chǎn)物摩爾得率預(yù)測值為48.6%。為檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，在優(yōu)化條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化實驗，產(chǎn)物摩爾得率平均值為49.3%，與模型預(yù)測值非常接近，表明該模型能夠很好地預(yù)測實際的轉(zhuǎn)化情況。

圖4 葡萄糖和酵母粉濃度對產(chǎn)物摩爾得率影響的響應(yīng)面圖Fig.4Surface layer of the mutual-affection of glucose and yeast extract concentration on molar yield of product.

圖5 葡萄糖和MgSO4·7H2O濃度對產(chǎn)物摩爾得率影響的響應(yīng)面圖Fig.5Surface layer of the mutual-affection of glucose and MgSO4·7H2O concentration on molar yield of product.

圖6 酵母粉和MgSO4·7H2O濃度對產(chǎn)物摩爾得率影響的響應(yīng)面圖Fig.6Surface layer of the mutual-affection of yeast extract and MgSO4·7H2O concentration on molar yield of product.

3 結(jié)論

本實驗對C.lini進(jìn)行復(fù)合誘變，篩選獲得一株7α,15α-diOH-DHEA高產(chǎn)菌株C.lini ST-1，該突變株在DHEA投料濃度10 g/L條件下，產(chǎn)物摩爾得率達(dá)到34.2%，與出發(fā)菌株相比提高了46.2%。為進(jìn)一步提高菌株的轉(zhuǎn)化能力，采用統(tǒng)計學(xué)實驗設(shè)計對轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，利用中心組合設(shè)計實驗對Plackett-Burman實驗篩選出的3個關(guān)鍵因素進(jìn)行研究，確定最佳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方為葡萄糖26.34 g/L、酵母粉12.15 g/L、MgSO4·7H2O 0.14 g/L，產(chǎn)物摩爾得率理論預(yù)測值為48.6%。在最優(yōu)培養(yǎng)基條件下，產(chǎn)物摩爾得率為49.3%，與理論預(yù)測值非常接近，較優(yōu)化前提高了44.2%，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化亞麻刺盤孢轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基是可行的。

REFERENCES

[1]Fernandes P,Cruz A,Angelova B,et al.Microbialconversionofsteroidscompounds:recent developments.EnzymeMicrobTechnol,2003, 32(6):688–705.

[2]Tong WY,Dong X.Microbial biotransformation: recent development on steroid drugs.Recent Pat Biotechnol,2009,3(2):141–153.

[3]Brown WE.The impact of biotechnology to health care industry.Ann Rep fermen Proc,1984,7:135.

[4]Haq NB,Rasheed AK.Biological transformation of steroidal compounds:a review.Steroids,2012, 77(12):1267–1290.

[5]Huang LH,Li J,Xu G,et al.Biotransformation of dehydroepiandrosterone(DHEA)with Penicillium griseopureumSmithandPenicilliumglabrum (Wehmer)Westling.Steroids,2010,75(13/14): 1039–1046.

[6]Han GD,Liu HB.Progress on the synthesis of a novel oral contraceptive drospirenone for women. Chinese J Med Chem,2010,20(2):146–154(in Chinese).韓廣甸,劉宏斌.新型女用口服避孕藥屈螺酮的合成進(jìn)展.中國藥物化學(xué)雜志,2010,20(2): 146–154.

[7]DonovaMV,EgorovaOV.Microbialsteroid transformations:current state and prospects.Appl Microbiol Biotechnol,2012,94(6):1423–1447.

[8]Holland HL.Recent advancesin applied and mechanistic aspects of the enzymatic hydroxylation of steroids by whole-cell biocatalyst.Steroids, 1999,64(3):178–186.

[9]CharneyW,HerzongLH.Microbial Transformations of Steroids.New York:Academic Press,1976:5–73.

[10]ShangK,HuHF,ZhuBQ.Synthesisof 7α,15α-dihydroxyandrostenolonebymicrobial transformation.Chinese Acad Med Mag Organ, 2004(2):30–34(in Chinese).尚珂,胡海峰,朱寶泉.微生物轉(zhuǎn)化法合成7α,15α-二羥基雄烯醇酮.中國醫(yī)學(xué)生物技術(shù)應(yīng)用雜志,2004(2):30–34.

[11]Romano A,Romano D,Ragg E,et al.Steroid hydroxylations with Botryodiplodia malorum and Colletotrichumlini.Steroids,2006,71(6): 429–434.

[12]Lobastova TG,Gulevskaya SA,Sukhodolskaya GV,etal.Dihydroxylationof dehydroepiandrosterone in positions 7α and 15α by mycelial fungi.Appl Microbiol Biotechnol,2009, 45(6):617–622.

[13]Xu ZH,Wu Y,Li H.Current state and progress of biotransformationtechnologyofsteroid compounds.Chin J Bioproc Eng,2013,11(2): 30–36(in Chinese).許正宏,吳燕,李會.甾體生物轉(zhuǎn)化技術(shù)研究的現(xiàn)狀與進(jìn)展.生物加工過程,2013,11(2):30–36.

[14]Plackett RL,Burman JP.The design of optimum multifuctorial experiments.Riometrika,1946,34: 255–272.

[15]MontgomeryDC.DesignandAnalysisof Experiments.5th ed.New York:John Wiley and Sons,2001:451–463.

[16]Wang P,Sun LM,He JY.Medium optimization for enhanced production of carbonyl reductase by Candidatropicalis104byresponsesurface methodology.ChinJBiotech,2009,25(6): 863–868(in Chinese).王普,孫立明,何軍邀.響應(yīng)面法優(yōu)化熱帶假絲酵母104菌株產(chǎn)羰基還原酶發(fā)酵培養(yǎng)基.生物工程學(xué)報,2009,25(6):863–868.

[17]Balusu R,Paduru RR,Kuravi S,et al.Optimization of critical medium components using response surface methodology for ethanol production from cellulosic biomass by Clostridium thermocellum SS19.Process Biochem,2005,9(40):3025–3030.

[18]Zhang SW,Huang JF,Luo LX.Optimization of fermentation medium for protease production by Bacillus subtilis.China Brewing,2013,32(2): 20–24(in Chinese).張士偉,黃建飛,羅立新.枯草芽胞桿菌產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化.中國釀造,2013,32(2): 20–24.

[19]He J,Zhen Q,Qiu N,et al.Medium optimization for the production of a novel bioflocculant from Halomonassp.V3a?usingresponsesurfacemethodology.Bioresour Technol,2009,100(23): 5922–5927.

[20]ChenXC,BaiJX,CaoJM,etal.Medium optimization for the production of cyclic adenosine 3′,5′-monophosphate by Microbacterium sp.no. 205 using response surface methodology.Bioresour Technol,2009,100(2):919–924.

[21]Tang XJ,He GQ,Chen QH,et al.Medium optimization for the production of thermal stable beta-glucanase by Bacillus subtilis ZJF-1A5 using response surface methodology.Bioresour Technol, 2004,93(2):175–181.

[22]Lu WY,Chen PC,Guo YW,et al.Ketoconazole resistance mutation-a study on the breeding of steroids11β-hydroxylationstrain-Curvularia lunata.Microbiol China,2003,30(6):26–29(in Chinese).盧文玉,陳伴成,郭亞文,等.氫化可的松高產(chǎn)菌株新月彎孢霉的選育.微生物學(xué)通報,2003, 30(6):26–29.

[23]Wan HG,Wang WJ,Miao LL,et al.Mutation breeding of high-yield exopolysaccharide-producing strains by nitrogen ion beam implantation.J Radiat Res Radiat Proc,2012,30(3):170–173(in Chinese).萬紅貴,王文娟,繆玲玲.氮離子束注入誘變選育胞外多糖高產(chǎn)菌株.輻射研究與輻射工藝學(xué)報,2012,30(3):170–173.

[24]Guo YW.Breeding of resistance mutants and analysis of P450 enzyme by Curvularia lunata[D]. Tianjin:TianjinUniversityofScience& Technology,2004(in Chinese).郭亞文.新月彎孢霉抗性菌株選育及P450酶特性分析[D].天津:天津科技大學(xué),2004.

[25]Zhuge J,Li HZ,Wang ZX.Genetic Improvement on Microorganisms.Beijing:Chemical Industry Press,2008(in Chinese).諸葛健,李華鐘,王正祥.微生物遺傳育種學(xué).北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2008.

(本文責(zé)編郝麗芳)

July 23,2013;Accepted:October 21,2013

Hui Li.Tel:+86-510-85326883;Fax:+86-510-85918206;E-mail:lihui@jiangnan.edu.cn

Optimization of hydroxylating DHEA to 7α,15α-diOH-DHEA by compound mutation and fermentation optimization

Chuanpeng Li1,Hui Li1,Yan Wu1,Heng Li1,Rujin Zhang2,Zhengbin Zhang2,Jinsong Shi1, and Zhenghong Xu1
1 School of Pharmaceutical Science,Jiangnan University,Wuxi 214122,Jiangsu,China
2 Zhejiang Xianju Junye Pharmaceutical Co.,Ltd.,Taizhou 317300,Zhejiang,China

Combined with method of ketoconazole resistance screening,a 7α,15α-diOH-DHEA high-producing mutant Colletotrichum lini ST-1 was obtained by compound mutation of NTG and low energy N+ion beam implantation.With the substrate concentration of 10 g/L DHEA,the molar yield of 7α,15α-diOH-DHEA reached 34.2%,increased by 46.2%than that of the original strain.Then we optimized the medium.First,Plackett-Burman design was used to evaluate the effects of medium components on molar yield of the product.Results show that glucose,yeast extract and MgSO4·7H2O were the important parameters for the biotransformation process.Subsequently,the path of steepest ascent was used to approach the optimal levels.To obtain the optimal levels,central composite design and response surface analysis were carried out.The optimal medium was as follows(g/L):glucose 26.34,yeast extract 12.15,corn flour 3.00,FeSO4·7H2O 0.015, MgSO4·7H2O 0.14,KH2PO40.90.Under the optimal conditions,the molar yield of 7α,15α-diOH-DHEA reached 49.3%, which was 44.2%higher than that of using the medium before optimization.

Colletotrichum lini,biotransformation,compound mutation,medium optimization,response surfaces methodology

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China(863 Program)(No.2011AA02A211),National Natural Science Foundation of China(No.21206055),Natural Science Foundation of Jiangsu Province,China(No.BK2012127).